Method Article

使用 CRISPR 介质基础编辑器对 BRCA1 变体进行功能评估

DOI:

10.3791/61557

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BRCA1突变患者患癌症的风险较高，这值得准确评估BRCA1变异的功能。在此，我们描述了使用CRISPR介质细胞素基础编辑器对BRCA1变种进行功能评估的协议，该基编辑器支持活细胞中目标C:G到T:A的转换。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最近的研究已经调查了与 BRCA1 基因突变相关的风险，使用各种功能评估方法，如荧光记者检测，胚胎干细胞可行性测定，和治疗药物的灵敏度检测。虽然它们澄清了许多 BRCA1 变种，但这些涉及使用外源表达 BRCA1 变种的检测与过度表达问题有关，不能应用于转录后调节。为了解决这些限制，我们之前报告了通过CRISPR介导细胞素基础编辑器对 BRCA1 变异进行功能分析的方法，该方法可诱导活细胞中有针对性的核苷酸替代。使用此方法，我们识别出其功能仍然模糊不清的变体， 包括 c.-97C=T、c.154C=T、c.3847C=T、c.5056C=T 和 c.4986+5G=A，并确认CRISPR介质基础编辑器是重新分类 BRCA1中不确定意义变体的有用工具。在这里，我们描述了使用基于CRISPR的细胞素基础编辑器对 BRCA1 变种进行功能分析的协议。该协议为选择目标地点、功能分析和评估 BRCA1 变种提供了准则。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

乳腺癌1型易感基因（BRCA1）是一种广为人知的肿瘤抑制基因。由于BRCA1基因与DNA损伤的修复有关，该基因的突变将导致单个基因患癌症的风险更大。乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌与BRCA1基因2的遗传性功能丧失（LOF）突变有关。BRCA1变种的功能评估和鉴定可能有助于预防和诊断各种疾病。为了解决BRCA1变种的功能问题，已经开发并广泛用于研究BRCA1变种的致病性，如胚胎干细胞活性测定、荧光记者检测和治疗性药物灵敏度检测3、4、5、6。虽然这些方法评估了很多BRCA1变种的功能，但涉及外源表达BRCA1变种的方法在过度表达方面存在局限性，可能会影响下游调控、基因剂量和蛋白质折叠7。此外，这些检测不能利用后脚本法规，如mRNA拼接，成绩单稳定性，以及未翻译区域8，9的影响。

CRISPR-Cas9系统使活细胞和生物体10具有针对性的基因组编辑。通过单导RNA，Cas9可以在特定基因组位点诱导染色体DNA中的双链断裂（DSBs），以激活两个DNA修复途径:易出错的非同源端连接（NHEJ）通路和无差错同源修复（HDR）通路11。HDR 是一种精确的修复机制:然而，Cas9 为 HDR 诱导的 DSB 通常会导致不需要的插入和删除 （indel） 突变。此外，它需要同源捐赠者DNA模板来修复DNA损伤，效率相对较低。最近，Cas9 nickase （nCas9） 已与细胞丁去氨酶域融合，用于定位 C:G 到 T:A 替换，无需均匀的 DNA 模板和 DNA 双链断裂 12、13、14、15。利用细胞素基础编辑器，我们开发出一种对BRCA1变种16进行功能分析的新方法。

在这项研究中，我们使用CRISPR介导细胞素基础编辑器，BE314，它诱导有效的C:G到T:A点突变，用于实施BRCA1变异的功能评估，并成功识别了几个BRCA1变种的功能（图1）。

figure-introduction-1
图1:功能评估工作流程概述。（A） 显示 BRCA1功能评估的示意图。因为 BRCA1 的LOF影响细胞的生存能力，当 BRCA1 突变是致病的，细胞死亡的通道数增加。（B） BRCA1功能评估的阶段。点缀框是可选的。它可以被 gRNA 表达和 BE3 表达质粒 DNA 的共变性所取代。 请点击这里查看此数字的较大版本。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:方法1（HAP1-BE3细胞系的生成）是可选的。BE3编码质粒DNA可以与 gRNA 编码质粒 DNA 共同传递，而不是构建 BE3 表达细胞线。细胞素基础编辑器的其他变体，如 BE4max，也可用于高效的基础编辑。

1. HAP1-BE3细胞系的生成

  1. 质粒DNA的构造
    1. 构建用于扁豆病毒生产的扁豆BE3-爆质质粒DNA，利用高保真聚合酶，通过PCR放大PCR在pCMV-BE3（材料表）中的BE3编码序列。设计PCR引物，以包含消化向量的重叠序列（从步骤1.1.2）为同热组件如下17:
      引物- F: 5'-特特格加
      引物 - R: 5 '-卡加加加格特 克格茨克茨克特克特 - 3'
      注:下划线中显示的核苷酸与消化的载体重叠，这些序列将特定于用户选择的目标向量。
    2. 文摘 lentiCas9-爆炸 （材料表） 质粒 DNA 与限制酶， XbaI 和 BamHI （1 单位每 1μg） 为 1 小时在 37 °C. 使用 0.8% 的阿加罗斯凝胶运行消化产品，并使用商用凝胶提取套件（材料表）净化适当大小的波段（8.6 kb）。
    3. 使用同热组装套件（材料表）克隆放大的 BE3 PCR 产品并消化扁豆Cas9-爆炸载体。共使用0.02-0.5 pmol的DNA片段和1:3比例的载体:插入。将组装产品转化为DH5阿尔法能力细胞18。将变压器添加到含有安非他林（100微克/mL）的琼脂板上，并在37°C下将变压器孵育过夜。
    4. 选择几个菌落，并在含有安非他明（100μg/mL）的LB（生殖汤）介质中接种，并在180 rpm的摇晃孵化器中种植培养物。
    5. 根据制造商的协议，使用商用质粒DNA净化套件（材料表）净化质粒DNA。
    6. 为了确认DNA克隆的成功，通过桑格测序使用标准和BE3特定引物（补充表1）分析每个纯质粒DNA（从步骤1.1.5）的BE3序列，并选择确切的克隆扁豆3-爆炸结构。
      注:为了分析桑格测序的结果，我们推荐了几个工具，如爆炸（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）和CLUSTALW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）。
  2. 细胞培养和HAP1-BE3细胞系的生成
    1. 保持细胞在健康状态和积极分裂状态。培养HAP1细胞在伊斯科夫的修改杜尔贝科的介质（材料表）含有10%的胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。培养 HEK293T/17 细胞在杜尔贝科的修改鹰的介质 （材料表） 含有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素.
      注:HAP1细胞是有用的基因研究，因为它几乎是类固醇细胞。然而，细胞可以自发地回到细胞培养的二倍体状态。富集霍奇斯特34580染色1n人口使用流细胞切除术将有助于维持HAP1细胞19的血红素。
    2. 种子 5 x 106 HEK293T/17 细胞在转世前 1 天在 100 nm 盘上。在转世当天，根据制造商的协议（材料表）20，使用商业转染性转录剂（15微克的扁豆3-爆炸，9微克的psPAX2病毒包装，6微克的pMD2.G）的二代扁豆病毒包装系统的瓶膜传染。在6小时转染后改变介质，在48小时或72小时后收获含有病毒的介质。使用 0.45 μm 过滤器过滤超纳坦。
    3. 在 0.1 的 MOI（感染倍数）下，将 BE3 的扁豆病毒颗粒转化为 HAP1 细胞。要调整以适应适当的 MOI，请使用连续稀释的病毒浓度。取出介质，代之以调整后的病毒超生剂和新鲜培养介质。
    4. 转导后一天，将含有爆霉素（材料表）的介质改为10微克/mL，并选择含爆竹素的转导细胞3天。经过爆破素选择后，选择一口含有10%存活细胞的井作为下一步。
    5. 经过爆破素选择后，在96口井板上以0.5个细胞/井的密度播种转导细胞，以便分离单克隆（例如，在20mL（每200微升0.5个细胞）培养介质中稀释50个细胞，在96个井板中每口井中稀释20个细胞。"孵化96井板2周，并选择单一的殖民地，以确认 BE3 活动。
    6. 将单个殖民地分成两组，一组用于测试 BE3 活动，另一组用于维护。将 gRNA 的扁豆病毒颗粒转换到其中一组以确认 BE3 活性。使用T7内核酶I（T7E1， 材料表）检测或执行目标深度测序技术（步骤4）21分析每个菌落的突变频率。选择合适的单克隆是健康的，具有高度活跃的 BE3。
      注:为了验证确切的突变频率，我们建议目标深度测序比T7E1检测。HEK2 （5'-GAACACTAGACTGC-'3） 是 BE3 经过良好验证的目标站点。

2. 针对 GRNA 的 BRCA1 的设计和施工

figure-protocol-1
图2:gRNA质粒DNA的示例。（A） 要用 BE3 有效编辑目标序列，需要将目标 C （目标 G） 置于五核苷酸窗口内的 NGG PAM （CCN PAM） 。NGG PAM 以红色显示，基础编辑窗口由灰色框表示。（B） 指示 c.8047C=T （H1283Y） 基础编辑的 gRNA 序列，目标 C:G 对以红色显示，而活动窗口则由灰色框突出显示。对于 gRNA 克隆，在5ʹ端都添加了以粗体表示的悬垂序列。gRNA的模板是通过对两种补充寡核苷酸进行退化产生的。 请点击这里查看此数字的较大版本。

注 :BRCA1 变种的正负控制至关重要。在这项研究中，c.5252G=A（R1751Q）和c.4527C=T（Y1509Y）被用作良性控制。c.191G=A （C64Y）、81-1G=A 和 c.3598C=T （Q1200*） 用作致病控制。每个 gRNA 的目标序列列在 补充表 1中。

  1. 在 NCBI22 从根银行获得BRCA1基因组序列。
  2. 搜索 20 bp 目标站点与原空间相邻主题 （PAM） 序列 "NGG" 和 "CCN" 围绕兴趣突变。由于 BE3 的活性窗口是 GRNA 目标序列 14 的 PAM-distal 末端中的 4-8 核苷酸，因此兴趣突变应位于 gRNA 目标序列的 PAM-distal 端的4-8核苷酸中。在 c.8047C=T （H1283Y） - 和 c.5252G=A （R1751Q） 目标 gRNA 的情况下， 5ʹ-TCAGGAACATAC-AGG-3ʹ和5ʹ-CCA-CCA-CCAGCACACACA-3ʹ，粗体序列是活动窗口。C 到 T 和 G 到 A 转换分别发生在 NGG 和 CCN PAM （图 2A）中。
    注:BE-设计师（http://www.rgenome.net/be-designer/）23 是gRNA设计的有用网络工具。
  3. 每gRNA订购两个补充寡核苷酸:对于前寡核苷酸，在指南序列的5ʹ端添加"CACCG"，对于反向寡核苷酸，在 5'末端添加"AAAC"，在 3'末端添加"C"。这些附加序列是特定于用于此协议的目的地 gRNA 表达向量（从步骤 2.5），用户应根据替代的 gRNA 表达向量（图 2B）进行调整。
  4. 将蒸馏水中的寡核苷酸以100μM的最终浓度重新悬而未决。 将两种补充寡核苷酸与T4裂解缓冲液（材料表）混合至10微米，并在95°C下加热5分钟，并在室温下冷却以进行退化。
  5. 文摘pRG2使用限制酶，BsaI（1单位每1μg）为1小时在37°C（材料表）。在 1% 阿加罗斯凝胶上运行消化产品，并纯化适当大小的波段（2.5 kb）。
    注:与其使用经典的消化和结社方法，不如使用金门克隆等其他克隆方法。
  6. 根据制造商的协议，使用购买的DNA韧带（材料表）将未分离的寡核苷酸复式物解放到载体DNA中，并将其转化为DH5α级细胞（其他广泛用于亚克隆的大肠杆菌株也可用于）。
  7. 将变压器添加到含有安非他林（100微克/mL）的琼脂板中，并在37°C下将变压板孵育过夜。 从几个转化剂中净化质粒DNA，并通过桑格测序分析其gRNA序列，使用入门，在U6促进剂（材料表）中具有素感。

3. 使用CRISPR调制的基础编辑工具创建 BRCA1 变种

注:如果不使用HAP1-BE3细胞系，BE3编码质粒DNA可以与 BRCA1靶向gRNA共同传染。与 BE3 和 gRNA 质粒的共变性相比，将 gRNA 质粒转染到 HAP-BE3 细胞可在我们手中的目标部位进行高达 3 倍的有效基础编辑。

  1. 种子 5 x 105 HAP1-BE3 细胞 （或 HAP1 细胞在共同转体方法的情况下） 每口井在 24 井板 1 天前转体.在分流时，培养细胞达到适当的密度（70%-80%的汇合）。
  2. 根据制造商的协议，使用购买的转染试剂（材料表）进行转染BRCA1-靶向gRNA。使用BRCA1的 1 μg 目标 gRNA（在共变异方法的情况下使用 1 μg 的 BE3 编码质粒 DNA）在BRCA1目标站点诱导 C:G 到 T:A 转换。每3~4天孵育一次37°C的细胞和亚培养。
  3. 在转产后 3 天、10 天和 24 天收获细胞颗粒，以分析基础编辑效率（从转产后 3 天的样本分析为第 0 天样本的重新分级）。
  4. 使用基因组DNA净化套件（材料表）提取基因组DNA。
    注:我们建议用试剂与DNA的可变比性优化转染条件。HAP1转染的最佳条件是将试剂的4:1配给到我们手中的DNA。

4. 伊卢米纳下一代测序的样品准备

figure-protocol-2
图3:为下一代测序做准备。第1个 PCR引漆旨在放大基因组DNA上的 BRCA1 目标位点。第二个 PCR 引物的设计使其序列比第 1个 PCR 引物序列位于更多内部。在 2个 PCR 入门的两端添加了显示为黄色条的其他序列，以附加执行下一代测序的基本序列。 请点击这里查看此数字的较大版本。

  1. 设计第 1个PCR 入门器以放大BRCA1目标站点。虽然对 1st PCR 产品的规模没有限制，但建议将产品尺寸扩大至 +lt;1 kb，以有效地放大特定区域（图 3）。
  2. 设计位于第1 台 PCR 产品内的第 二台 PCR 引物。根据 NGS 读取长度考虑放大器的大小（例如，放大器产品的大小应小于 300 bp，用于 2 × 150 bp 配对端运行以合并每个读数）。为了附加用于 NGS 分析的基本序列， 在2 个 PCR 引物的 5'端添加附加序列如下:对于前引物，在 5'末端添加 5'-ACACTCTCTCCCTCTCTCT-3'序列，在反向引物中添加 5'-GTGACTGGGACGCGTGCTCCTCCG ATCT-3'序列到 5'末端。
    注:我们使用嵌套 PCR 通过防止引入器连接到非目标序列来减少非特定绑定的放大量。
  3. 放大从三个时间点获得的基因组DNA上的 BRCA1 靶点。根据制造商的协议，使用高保真聚合酶，以最大限度地减少 PCR 错误。对于第1次 PCR反应，使用100 ng的基因组DNA在15个周期内进行放大。对于第 2 个 PCR 反应，使用 1μL 的 1 个 PCR 产品进行超过 20 个周期的放大。在2%的阿加罗斯凝胶上运行第2个 PCR产品的5 μL，并确认尺寸。
  4. 为了附加 NGS 分析的基本序列，使用下面列出的引物放大第二 个 PCR 产品。对于 PCR 反应，第 2 个 PCR 产品的1 μL 用于使用高保真聚合酶放大长达 30 个周期。
    1. 要执行多路复用测序，同时对大量库进行汇总和排序，请使用具有唯一索引序列（补充表 1）的前瞻（D501 – D508）和反向（D701 – D712）入门。使用不同的引入器集放大每个示例，以执行独特的双索引策略。
    2. 在 2% 阿加罗斯凝胶上运行 5 μL 的 PCR 产品，以确认尺寸，并使用商用 PCR 清理套件（材料表）净化放大器。将每个样本等量混合以创建 NGS 库。
  5. 使用光谱仪将NGS库量化为260nm波长，并使用重新悬念缓冲器或10mTris-HCl（pH 8.5）稀释NGS库浓度为1nM。根据库类型将 100 μL 的库稀释到适当的加载浓度（例如，为 Nextera DNA Flex 准备 200 pM 的库）。
    1. 作为对照，将 phiX 与适合套件类型的稀释样品组合在一起。
    2. 将库加载到墨盒上，然后根据制造商的协议运行 NGS。Illumina iSeq 100 或 Miseq 系统可以对各种长度的放大片进行排序，最高可达 300 bp，用于单读或配对结束。我们建议每个目标放大器读数超过 10，000 次，以深入分析基础编辑效率。

5. BRCA1 变种功能评估基础编辑效率分析

  1. 使用MAUND24分析基础编辑效率。基础编辑效率如下所述。
    figure-protocol-3
    如果 BE3 活动窗口中存在多个细胞氨酸，则仅考虑用于评估BRCA1变种的 C 到 T 转换。例如，如果 BE3 活动窗口的序列是"C4A5T6C7T8"，则基础编辑生成的可能序列是"T4A5T6C7T8"、"C4A5T6T7T8"和"T4A5T6T7T8"。此时，如果位置 4 是所需的BRCA1变体的目标位置，则仅考虑"T 4 A5T6C7T8"序列来计算基础编辑效率。
    注:我们还推荐其他用于分析基础编辑活动的 Web 工具，如 CRISPResso225和 BE 分析仪23。
  2. 使用 BRCA1 变种的正负对照来验证结果。良性控制的基础编辑效率应保持不变，而致病控制的基础编辑效率应随着时间的推移而降低。
  3. 计算BRCA1变种的相对基础编辑效率并确定其致病性。对第 0 天和第 21 天样本之间的显著差异进行适当的统计分析，如 t-test。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议中描述的实验方法能够对CRISPR基质编辑器生成的内源 BRCA1 变种进行功能评估。为了选择适当的细胞系来评估 BRCA1 变异的功能，研究人员应该确认 BRCA1 是靶向细胞系中必不可少的基因。例如，我们首先将 Cas9 和 gRNA 传染到 HAP1 细胞系中，以中断 BRCA1， 并通过有针对性的深度测序分析突变频率。我们发现HAP1细胞系（图4A）的突变频率会随着时间而显著降低。这些结果表明 ，BRCA1 是HAP1细胞系细胞存活性的基本基因。为了调查C:G到T:替代变异是否影响 BRCA1的功能，质粒DNA编码gRNA，可以诱导每个突变，被转移到HAP1-BE3细胞系，并分析替代频率。c.3598C=T（P.Q1200*）的相对替代频率（一种致病变种）显著减少，而c.4527C=T（p.Y1509Y），一种良性变种，与时间（图4B）保持相似。在 ClinVar 数据库中，C.154C=T （p....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此协议描述了使用CRISPR冥想细胞素基础编辑器对 BRCA1 变种进行功能评估的简单方法。该协议描述了在目标位置设计 gRNA 的方法，以及从中表达的质粒 DNA 的构建方法。细胞素基础编辑器在活动窗口中诱导核苷酸转换（如果 BE3，核苷酸 4-8 在 GRNA 目标序列的 PAM-分端）。研究人员应该仔细选择目标序列，因为活动窗口中的所有细胞氨酸都可以代替胸腺素。此外，正如第 5 步所述，应仔细分析活动窗口中的多个细胞氨酸，以评估 BRCA1 变种的功能。

其中最重要的步骤是目标细胞系的转染，这会影响 BRCA1 功能评估的初始突变频率。为了提高初始突变频率，研究人员应优化对感兴趣的细胞线的传递方法。正如第 1 步所述，BE3 表达细胞系的生成是增加初始突变频率的有用选项。我们不建议将gRNA的扁豆病毒转导到HAP1-BE3细胞中，因为BE3和gRNA的构成表达可能导致累积核苷酸转化，这些结果干扰 BRCA1 变异的功能评估。

除了本议定书中引入的 B...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了韩国国家研究基金会的支持（赠款2017M3A9B4062419，2019R1F1A1057637和2018R1A5A2020732到Y.K.）。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHINEBR3136限制性内切酶
杀稻瘟菌素Thermo Fisher ScientificA1113903用于选择转导细胞的药物
BsaINEBR0535限制性内切酶
DNeasy 血液 &组织试剂盒Qiagen69504基因组 DNA 制备试剂盒
Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基HEK293T/17 细胞的Gibco11965092
的胎牛血清Gibco16000036用于细胞培养的 Supplemetal
FuGENE HD 转染试剂PromegaE2311转染试剂
Gibson 组装预混液NEBE2611LGibson 组装试剂盒
Iscove's 修改后的 Dulbecco's 培养基Gibco12440046用于 HAP1 细胞
lentiCas9-BlastAddgene52962用于 lentiBE3 克隆的质粒 DNA
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027转染试剂
Opti-MEMGibco31985070转染材料
pCMV-BE3Addgene73021质粒 DNAlentiBE3 克隆
青霉素-链霉素Gibco15140用于细胞培养的 Supplemetal
Phusion 高保真 DNA 聚合酶NEBM0530SQ高保真聚合酶
pMD2.GAddgene12259用于病毒制备的质粒 DNA。
pRG2Addgene104174gRNA 克隆载体
psPAX2Addgene12260用于病毒制备的质粒 DNA。
QIAprep Spin Miniprep kitQiagen27106质粒DNA制备试剂盒
QIAquick Gel extraction KitQiagen28704凝胶提取试剂盒
QIAquick PCR纯化试剂盒Qiagen28104PCR产物制备试剂盒
Quick Ligation KitNEBM2200Ligase for gRNA克隆
T7核酸内切酶NEBM0302材料用于 T7E1 检测
XbaINEBR0145限制性内切酶
用于 培养基用于细胞培养的培养基 I

References

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