病毒感染后，肾脏中含有相对大量的CD8+ T细胞，为研究非黏膜组织驻留记忆T细胞（TRM）提供了机会。本文介绍了一种从小鼠肾脏中分离淋巴细胞用于流式细胞术分析的实验方案。
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摘要
摘要
组织驻留记忆性T细胞（TRM）是免疫学研究中迅速发展的领域。从各种非淋巴组织中分离T细胞是研究TRM的关键步骤之一。不同器官的淋巴细胞分离方案略有差异。肾脏是一种重要的非淋巴器官，在病原体暴露或自身免疫激活后常伴有大量免疫细胞浸润。近年来，包括我们实验室在内的多个研究团队已开始在小鼠和人类中，针对多种生理和病理条件下肾脏驻留的CD8+ T细胞进行表征。由于T淋巴细胞含量丰富，肾脏成为研究非黏膜或非屏障组织中TRM的理想模型器官。本文将介绍一种在专注于TRM研究的实验室中常用的小鼠肾脏CD8+ T细胞分离方案。简言之，我们采用C57BL/6小鼠急性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染模型，展示如何通过血管内CD8+ T细胞标记、酶消化以及密度梯度离心等步骤，从小鼠肾脏中分离并富集淋巴细胞，以制备适用于后续流式细胞术分析的样本。
引言
组织驻留记忆性（TRM）T细胞是成年人体和感染小鼠体内最丰富的T细胞群体之一。TRM细胞构成免疫防御的第一道防线，并在多种生理和病理过程中发挥关键作用1,2,3,4,5。与循环T细胞相比，TRM细胞具有独特的表面标志物和转录程序6,7,8。拓展对TRM细胞生物学的认识，是理解T细胞应答的关键，对于未来T细胞疫苗和免疫疗法的开发至关重要。
除了在所有非淋巴组织中普遍共有的TRM分子标志物外，越来越多的证据表明，组织特异性特征是TRM生物学的核心组成部分9。肾脏在感染后可容纳大量免疫细胞，包括TRM细胞，为研究非黏膜组织中TRM细胞的生物学特性提供了理想机会。通过腹腔途径感染急性LCMV（淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒）是一种成熟的小鼠全身性感染模型，用于研究抗原特异性T细胞应答。在野生型小鼠中，该感染通常于7–10天内被清除，并在包括肾脏在内的多种组织中留下大量LCMV特异性记忆T细胞10。P14 TCR（T细胞受体）转基因小鼠携带的CD8+ T细胞能够识别由C57BL/6小鼠MHC-I（主要组织相容性复合体I类）分子H2-Db呈递的LCMV的一个免疫优势表位。通过将同源标记的P14 T细胞过继转移与小鼠LCMV感染模型相结合，可追踪CD8+效应T细胞和记忆T细胞的动态变化，包括TRM的分化与稳态维持。
在某些屏障组织中，例如小鼠LCMV模型中的肠上皮内淋巴细胞（IEL）区室和唾液腺，既定的淋巴细胞分离方法可获得高比例的TRM细胞，且血液来源的T细胞污染极少11。然而，在非屏障组织（如肾脏）中，致密的血管网络含有大量循环中的CD8+ T细胞。已有充分文献报道，即使成功的灌注也无法有效清除所有循环中的CD8+ T细胞。为克服这一技术难题，血管内抗体标记技术已被确立为TRM实验室中最常用的技术之一12。简言之，在处死小鼠前3-5分钟，通过静脉注射每只小鼠3 µg抗-CD8抗体（用于标记CD8+ T细胞）。完整的血管壁可防止抗体在短时间内（即3-5分钟）迅速扩散，因此仅血管内的细胞被标记。在执行标准的淋巴细胞分离流程后，可通过流式细胞术轻松区分血管内与血管外的细胞。
本文将介绍一种在组织驻留记忆性T细胞（TRM）实验室中常用的标准化实验方案，用于对接受过CD45.1+ P14 T细胞移植并感染淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）30天后的C57BL/6小鼠进行血管内标记、淋巴细胞分离以及肾脏CD8+ T细胞的流式细胞术分析13。该相同方案也可用于研究肾脏中的效应T细胞和记忆T细胞。
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方案
根据本方案进行的所有动物实验必须获得相应机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。本文所述所有操作步骤均已获得圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心IACUC的批准。
1. 将P14 T细胞过继转移至C57BL/6受体小鼠并感染LCMV
- 使用6至12周龄的P14小鼠。确保P14 TCR转基因供体小鼠的性别与C57BL/6受体小鼠的性别一致。否则，例如将雄性T细胞移植到雌性小鼠体内，将在约12天内引发免疫介导的循环供体T细胞排斥反应14。
- 按照试剂盒说明书，使用小鼠CD8+ T细胞纯化试剂盒从P14 TCR转基因小鼠的脾脏和淋巴结中纯化初始型CD8+ T细胞。
- 简要地，解剖取出脾脏和淋巴结，研磨样品以制备单细胞悬液。
- 为富集初始T细胞，在第一次抗体孵育步骤中加入生物素标记的抗CD44抗体13。
注意：本步骤所用的阴性筛选商用试剂盒包含两个主要组分，用于两步孵育（即生物素化抗体混合物孵育和链霉亲和素磁珠孵育）。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并通过尾静脉向每只性别匹配的C57BL/6受体小鼠注射200 µL PBS中含1,000至10,000个纯化的P14 T细胞。
注意：详细的尾静脉注射方案见步骤2。 - 次日，所有C57BL/6受体小鼠通过腹腔途径接种2 x 105 pfu的LCMV Armstrong病毒，病毒用200 µL PBS稀释。
2. CD8+ T细胞的血管内标记
注意：根据研究兴趣的不同，可在感染后的不同时间点进行实验。本文以感染后第30天（即步骤1.4之后第30天）为例进行说明，该时间点通常被视为CD8 T细胞应答的早期记忆阶段。
- 将生物素标记的抗CD8α抗体用PBS稀释至15 µg/mL。确保每只小鼠接受含3 µg抗体的200 μL PBS。
注意：此处使用生物素标记的抗CD8抗体，以便更灵活地设计最终的FACS染色方案。也可直接使用荧光染料标记的抗体，但必须注意静脉标记与FACS染色应使用不同克隆的单克隆抗体。 - 使用上方加热灯对小鼠尾静脉适当加热5-10分钟，以扩张静脉。
注意：需格外小心避免动物过热。若小鼠停止活动，应降低温度或移除加热灯。 - 用100 U胰岛素注射器（28G）吸取200 µL预稀释的抗CD8α抗体混合液，并通过上下推动活塞排除所有气泡。将针头弯曲，使针头与注射器之间形成150°角，斜面朝上，以便针头与静脉平行。
- 使用合适尺寸的啮齿类动物固定器固定小鼠，并用70%乙醇喷洒尾部，使静脉清晰可见。
注意：应尽量缩短固定时间。 - 用非优势手的拇指和中指夹住尾部远端，将食指置于针头插入部位下方。
- 用优势手握住注射器，将针头平行于静脉方向朝心脏方向刺入静脉。
注意：若操作正确，针头应能顺利滑入静脉。 - 通过尾静脉缓慢注射200 µL抗CD8α抗体。
注意：若感到阻力或在尾部针头处出现白色区域，则表明针头未进入静脉。初次注射应靠近尾尖进行；必要时可向尾根方向移动进行后续注射。 - 拔出针头，并轻轻按压至出血停止。
- 将小鼠放回笼中，并在3-5分钟后实施安乐死。
注意：应通过异氟烷麻醉舱实施安乐死，随后进行颈椎脱位。其他方法（如CO2吸入）可能需要长达5分钟，可能导致静脉抗体标记时间产生不必要的变异。 - 使用剪刀解剖肾脏，将完整肾脏转移至1.5 mL微量离心管中，并将样品置于冰上直至进一步处理。
注意：完整肾脏在冰上可安全保存数小时，再进行后续处理和消化。
3. 肾脏的酶消化
- 为每只小鼠准备含有3 mL消化液（RPMI/2% FCS/1 mg/mL Collagenase B）的6孔板，置于冰上保存。
注意：可配制较高浓度的胶原酶B储备液（例如20倍浓度），并于-20°C或更低温度保存。工作液应新鲜配制。本实验方案中所用所有溶液/缓冲液的配方详见表1。 - 向1.5 mL微量离心管中加入300 μL消化液，使用直头弹簧剪刀将肾脏样本剪碎。
注意：应将肾脏组织剪切成大小均匀的碎片，直径不超过1.5 mm。无需进行去包膜操作。 - 将剪碎的肾脏样本转移至含有消化液的6孔板中。
注意：使用6孔板仅出于操作便利性考虑，适用于需同时处理多个样本的情况。 - 在37 °C条件下，以轻柔振荡（约60 rpm）孵育45分钟。
- 消化完成后，直接在培养皿内使用3 mL注射器的推杆前端碾磨组织，随后转移至15 mL锥形离心管中。
注意：通常此步骤无需通过细胞筛过滤，因为后续将进行密度梯度离心以纯化活淋巴细胞。 - 在4 °C条件下，以500 x g 离心5分钟，沉淀细胞。
- 将沉淀重悬于3 mL RPMI/10% FCS中。
4. 密度梯度离心法富集消化后肾脏中的淋巴细胞
- 在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心样品 5 分钟。
- 弃去上清液，并用 5 mL 的 44% Percoll/RPMI 混合液（44% Percoll + 56% RPMI，不含 FBS）重悬细胞沉淀。
- 将装有 3 mL 67% Percoll/PBS 溶液（67% Percoll + 33% PBS）的 3 mL 移液器枪头直接插入每根试管底部，缓慢释放溶液，使密度较大的溶液（67% Percoll/PBS）在底部形成独立的一层，而较轻的溶液（44% Percoll/RPMI）被推至上层，从而形成梯度分层。
注意：对于新到货的密度梯度介质，需向瓶中加入 1/10 体积的无菌 10x PBS，充分混匀后，将 PBS 平衡后的密度梯度介质视为 100% 溶液。 - 在室温下以 900 x g 离心 20 分钟，离心机的加速和刹车设置需调低。
注意：对于具有加速和刹车设置的离心机（量程为 1-9，1 表示最小，9 表示最大），建议加速设为 6，刹车设为 4。 - 小心从离心机中取出试管，避免扰动各层；
注意：淋巴细胞层位于粉红色的 RPMI 层与无色的 PBS 层之间，通常清晰可见。 - 使用移液管小心移除上层液体，避免接触淋巴细胞层。
- 将淋巴细胞层转移至新的 15 mL 离心管中，加入 PBS/5% FCS 至满管，缓慢倒置混匀 4–6 次，确保充分混匀。
注意：此步骤对于清除残留的 Percoll 至关重要。 - 在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心样品 5 分钟。
- 弃去上清液，并用 500 μL 完全 RPMI 培养基重悬细胞沉淀。细胞即可用于流式细胞术染色。
5. 流式细胞术染色与分析
注意：请遵循T淋巴细胞流式细胞术染色的标准操作流程。
- 每次FACS染色取约1 × 106个细胞。
注意：FACS染色使用U型底96孔板。但如果样本数量有限，也可使用5 mL FACS管。 - 在4 °C条件下，以500 x g离心5分钟，弃上清液。
- 将每个样本重悬于50 µL含有10 µg/mL 2.4G2 FcR阻断剂（一种抗CD16/32单克隆抗体，用于阻断所加FACS抗体与FcR之间的相互作用）的FACS缓冲液中。冰上孵育15分钟。
- 无需进一步离心，直接向每个样本中加入50 µL表面染色抗体混合物，使最终染色体积为每样本100 µL。冰上避光孵育30分钟。
注意：在抗体混合物中加入荧光标记的链霉亲和素（2 µg/mL或按制造商推荐浓度），用于标记CD8α+血管内CD8+ T细胞，并使用荧光标记的抗CD8β抗体标记所有CD8 T细胞。抗体混合物通过将所需量的目标抗体加入FACS缓冲液中配制而成。 - 用PBS洗涤样本两次。每次洗涤时，向96孔板各孔中加入冷PBS，于4 °C以500 x g离心5分钟，弃上清液。
- 将细胞重悬于每孔100 µL稀释后的活/死细胞染料中。冰上避光孵育30分钟。
注意：即使经过密度梯度介质离心，酶消化步骤常因ARTC2.2/P2RX7信号通路导致组织驻留T细胞发生显著死亡15。强烈建议在固定前进行活/死细胞染料染色。可在处死小鼠前向其给予抗ARTC2纳米抗体，以防止细胞分离过程中诱导的细胞死亡。 - 用FACS缓冲液洗涤样本两次。每次洗涤时，向96孔板各孔中加入冷FACS缓冲液，于4 °C以500 x g离心5分钟，弃上清液。
- 将细胞重悬于每孔100 μL固定缓冲液中。37 °C孵育10分钟。
注意：固定缓冲液需新鲜配制，通过将甲醛用PBS稀释至终浓度为2%甲醛制得。 - 用FACS缓冲液洗涤样本两次。每次洗涤时，向96孔板各孔中加入冷FACS缓冲液，于4 °C以500 x g离心5分钟，弃上清液。
- 将细胞重悬于每孔250 μL FACS缓冲液中。密封板子，4 °C避光保存，直至进行FACS分析。
注意：在FACS分析前，需将样本通过70 μm尼龙滤网过滤，以去除可能堵塞FACS仪器的细胞团块。
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结果
本方案的流程总结于流程图中（图1A）。在LCMV感染后第30天，我们对CD8+ T细胞进行血管内标记。5分钟后，取出动物的两个肾脏，剪碎并进行胶原酶消化。通过Percoll离心进一步从消化后的样品中纯化淋巴细胞，并通过流式细胞术进行分析。如图1B所示，即使经过密度梯度离心富集淋巴细胞，最终产物中仍常见大量非淋巴细胞。然而，在圈选活淋巴细胞后，可轻松鉴定出CD8+ T淋巴细胞。我们能够区分血管内与血管外的CD8+ T细胞。由于CD8α与CD8β在CD8+ T细胞上的表达模式高度相关，因此血管内CD8+ T细胞在CD8α-CD8β流式图谱上呈现对角线分布模式。与预期一致，仅血管外CD8+ T细胞有效获得了组织驻留记忆T细胞（TRM）表型，例如CD69上调和Ly6C下调（图1B）。在我们的实验中，我们关注的是携带同...
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讨论
随着组织特异性免疫成为快速发展的研究领域，越来越多的证据表明，免疫细胞特别是淋巴细胞群体几乎可以在成人的所有器官以及感染或免疫小鼠的器官中被识别。LCMV小鼠感染模型是研究抗原特异性T细胞应答、效应T细胞与记忆T细胞分化（包括多种组织中的TRM生物学特性）的经典模型。本文介绍了一种用于分析肾脏中CD8+ T细胞的实验方案。该方案主要借鉴了专注于TRM12的研究文献。由于肾脏淋巴细胞中P2RX7高表达以及酶消化过程诱导的细胞死亡15，本方案所获得的淋巴细胞最适合立即进行表型分析。然而，已有成熟方案可通过抑制P2RX7介导的细胞死亡16，因此可以预见，当前方案可被简便地改进（例如加入抑制剂以阻断P2RX7信号通路），从而提高细胞存活率，并适用于其他长期功能性检测。应设置适当的对照组，以确保P2RX7抑制剂不会干扰目标功能性实验的检测结果。
肾脏中的CD8+ ...
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披露
作者无相关财务披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI125701 和 AI139721、癌症研究所 CLIP 项目以及美国癌症协会资助项目 RSG-18-222-01-LIB 支持，资助对象为 N.Z.。我们感谢来自流式细胞术中心的 Karla Gorena 和 Sebastian Montagnino。在流式细胞术共享资源中心产生的数据得到了圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心（UTHSCSA）、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助项目 P30 CA054174-20（UTHSCSA 临床与转化研究中心 [CTRC]）以及 UL1 TR001120（临床与转化科学奖）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 微量离心管 | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml 离心管 | 康宁 | 431470 | |
| 3 ml 注射器 | BD | 309657 | |
| 37°C 培养箱 | VWR | ||
| 生物素标记的抗CD8a抗体（克隆53-6.7） | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| 小牛血清 | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| 胶原酶B | 默克生命科学 | 11088807001 | |
| 一次性刻度移液管 | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| 胰岛素注射器 | BD | 329424 | |
| 微型解剖弹簧剪 | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort 小鼠 CD8 Naïγδ T细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480043 | |
| 头顶加热灯 | 亚马逊 | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| 摇床 | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| 实心黄铜小鼠固定器 | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| 带制冷功能的摆动转子离心机 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 组织培养6孔板 | 康宁 | 3516 |
参考文献
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