小鼠肾脏驻留型CD8+ T细胞的分离及其流式细胞术分析

摘要

病毒感染后，肾脏中含有相对大量的CD8⁺ T细胞，为研究非黏膜组织驻留记忆T细胞（T_RM）提供了机会。本文介绍了一种从小鼠肾脏中分离淋巴细胞用于流式细胞术分析的实验方案。

摘要

组织驻留记忆性T细胞（T_RM）是免疫学研究中迅速发展的领域。从各种非淋巴组织中分离T细胞是研究T_RM的关键步骤之一。不同器官的淋巴细胞分离方案略有差异。肾脏是一种重要的非淋巴器官，在病原体暴露或自身免疫激活后常伴有大量免疫细胞浸润。近年来，包括我们实验室在内的多个研究团队已开始在小鼠和人类中，针对多种生理和病理条件下肾脏驻留的CD8⁺ T细胞进行表征。由于T淋巴细胞含量丰富，肾脏成为研究非黏膜或非屏障组织中T_RM的理想模型器官。本文将介绍一种在专注于T_RM研究的实验室中常用的小鼠肾脏CD8⁺ T细胞分离方案。简言之，我们采用C57BL/6小鼠急性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染模型，展示如何通过血管内CD8⁺ T细胞标记、酶消化以及密度梯度离心等步骤，从小鼠肾脏中分离并富集淋巴细胞，以制备适用于后续流式细胞术分析的样本。

引言

组织驻留记忆性（T_RM）T细胞是成年人体和感染小鼠体内最丰富的T细胞群体之一。T_RM细胞构成免疫防御的第一道防线，并在多种生理和病理过程中发挥关键作用^1,2,3,4,5。与循环T细胞相比，T_RM细胞具有独特的表面标志物和转录程序^6,7,8。拓展对T_RM细胞生物学的认识，是理解T细胞应答的关键，对于未来T细胞疫苗和免疫疗法的开发至关重要。

除了在所有非淋巴组织中普遍共有的T_RM分子标志物外，越来越多的证据表明，组织特异性特征是T_RM生物学的核心组成部分⁹。肾脏在感染后可容纳大量免疫细胞，包括T_RM细胞，为研究非黏膜组织中T_RM细胞的生物学特性提供了理想....

方案

根据本方案进行的所有动物实验必须获得相应机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。本文所述所有操作步骤均已获得圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心IACUC的批准。

1. 将P14 T细胞过继转移至C57BL/6受体小鼠并感染LCMV

1. 使用6至12周龄的P14小鼠。确保P14 TCR转基因供体小鼠的性别与C57BL/6受体小鼠的性别一致。否则，例如将雄性T细胞移植到雌性小鼠体内，将在约12天内引发免疫介导的循环供体T细胞排斥反应¹⁴。
2. 按照试剂盒说明书，使用小鼠CD8⁺ T细胞纯化试剂盒从P14 TCR转基因小鼠的脾脏和淋巴结中纯化初始型CD8⁺ T细胞。
   1. 简要地，解剖取出脾脏和淋巴结，研磨样品以制备单细胞悬液。
   2. 为富集初始T细胞，在第一次抗体孵育步骤中加入生物素标记的抗CD44抗体¹³。
      注意：本步骤所用的阴性筛选商用试剂盒包含两个主要组分，用于两步孵育（即生物素化抗体混合物孵育和链霉亲和素磁珠孵育）。
3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并通过尾静脉向每只性别匹配的C57BL/6受体小鼠注射200 µL PBS中含1,000至10,000个纯化的P14 T细胞。
   注意：详....

结果

本方案的流程总结于流程图中（图1A）。在LCMV感染后第30天，我们对CD8⁺ T细胞进行血管内标记。5分钟后，取出动物的两个肾脏，剪碎并进行胶原酶消化。通过Percoll离心进一步从消化后的样品中纯化淋巴细胞，并通过流式细胞术进行分析。如图1B所示，即使经过密度梯度离心富集淋巴细胞，最终产物中仍常见大量非淋巴细胞。然而，在圈选活淋巴细胞后，可轻松鉴定出CD8⁺ T淋巴细胞。我们能够区分血管内与血管外的CD8⁺ T细胞。由于CD8α与CD8β在CD8⁺ T细胞上的表达模式高度相关，因此血管内CD8⁺ T细胞在CD8α-CD8β流式图谱上呈现对角线分布模式。与预期一致，仅血管外CD8⁺ T细胞有效获得了组织驻留记忆T细胞（T_RM）表型，例如CD69上调和Ly6C下调（图1B）。在我们的实验中，我们关注的是携带同.......

讨论

随着组织特异性免疫成为快速发展的研究领域，越来越多的证据表明，免疫细胞特别是淋巴细胞群体几乎可以在成人的所有器官以及感染或免疫小鼠的器官中被识别。LCMV小鼠感染模型是研究抗原特异性T细胞应答、效应T细胞与记忆T细胞分化（包括多种组织中的T_RM生物学特性）的经典模型。本文介绍了一种用于分析肾脏中CD8⁺ T细胞的实验方案。该方案主要借鉴了专注于T_RM¹²的研究文献。由于肾脏淋巴细胞中P2RX7高表达以及酶消化过程诱导的细胞死亡¹⁵，本方案所获得的淋巴细胞最适合立即进行表型分析。然而，已有成熟方案可通过抑制P2RX7介导的细胞死亡¹⁶，因此可以预见，当前方案可被简便地改进（例如加入抑制剂以阻断P2RX7信号通路），从而提高细胞存活率，并适用于其他长期功能性检测。应设置适当的对照组，以确保P2RX7抑制剂不会干扰目标功能性实验的检测结果。

肾脏中的CD8⁺ .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 微量离心管	Fisherbrand	05-408-130
15 ml 离心管	康宁	431470
3 ml 注射器	BD	309657
37°C 培养箱	VWR
生物素标记的抗CD8a抗体（克隆53-6.7）	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
小牛血清	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
胶原酶B	默克生命科学	11088807001
一次性刻度移液管	Fisherbrand	13-711-9AM
胰岛素注射器	BD	329424
微型解剖弹簧剪	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort 小鼠 CD8 Naïγδ T细胞分离试剂盒	Biolegend	480043
头顶加热灯	亚马逊	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
摇床	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
实心黄铜小鼠固定器	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
带制冷功能的摆动转子离心机	赛默飞世尔科技
组织培养6孔板	康宁	3516