需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

人脐带血干细胞来源外泌体处理后单核细胞向表型不同的巨噬细胞分化

5.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61562

⸱

2020年11月12日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, 2Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

本文内容

摘要

外泌体应用是药物开发和再生医学领域的新兴工具。我们建立了一种高纯度的外泌体分离方案，用于从新发现的干细胞CB-SC中分离外泌体，以开展机制研究。我们还将CB-SC来源的外泌体与人单核细胞共培养，诱导其分化为表型 distinct 的巨噬细胞。

摘要

干细胞教育器（Stem Cell Educator，SCE）疗法是一种治疗1型糖尿病及其他自身免疫性疾病的新型临床方法。SCE疗法通过将患者分离的外周血单个核细胞（如淋巴细胞和单核细胞）在血细胞分离机中循环，使其在SCE装置内与贴壁的脐带血来源干细胞（CB-SC）共培养，随后将这些被“教育”过的免疫细胞回输至患者血液中。外泌体是存在于所有生物体液和细胞培养基中的纳米级细胞外囊泡，大小为30‒150 nm。为了进一步探究SCE疗法背后的分子机制，并明确CB-SC释放的外泌体的作用，我们研究了在CB-SC治疗过程中哪些细胞会吞噬这些外泌体。通过将Dio标记的CB-SC来源外泌体与人外周血单个核细胞（PBMC）共培养，我们发现CB-SC来源的外泌体主要被人CD14阳性单核细胞摄取，从而诱导单核细胞向具有纺锤形形态及表达M2相关表面分子标志物的2型巨噬细胞（M2）分化。本文中，我们提供了一项用于分离和表征CB-SC来源外泌体的实验方案，以及CB-SC来源外泌体与人单核细胞共培养并监测其向M2分化的操作流程。

引言

脐带血干细胞（CB-SC）是一类来源于人脐带血的独特干细胞，可与其他已知类型的干细胞（如间充质干细胞（MSC）和造血干细胞（HSC））相区分1。基于其独特的免疫调节特性以及在培养皿表面紧密贴壁生长的能力，我们开发了一项新技术，称为干细胞教育疗法（Stem Cell Educator，SCE），并已进入临床试验阶段2,3。在SCE治疗过程中，采集患者的外周血单个核细胞（PBMC），通过细胞分离装置循环，并在体外与贴壁生长的CB-SC共培养。这些经过“教育”的细胞（即经CB-SC处理的PBMC）随后通过闭环系统回输至患者体内。临床试验已证实，SCE疗法在治疗自身免疫性疾病（包括1型糖尿病（T1D）2,4和斑秃（AA）5）方面具有良好的临床安全性和有效性。

外泌体是一类直径在30‒150 nm之间的纳米颗粒，存在于所有生物体液和细胞培养基中6。外泌体富含多种生物活性分子，包括脂质、mRNA、蛋白质和微小RNA（miRNA），在细胞间通讯中发挥重要作用。近年来，由于外泌体在临床治疗中具有潜在的治疗价值，已引起研究人员和制药公司的广泛关注7,8,9。最近，我们的机制研究表明，CB-SC释放的外泌体在外泌体疗法（SCE therapy）的免疫调节中具有重要作用10。

本文描述了一种研究脐带间充质干细胞（CB-SC）分泌的外泌体介导的SCE疗法靶向单核细胞机制的实验方案。首先，采用超速离心法从CB-SC来源的条件培养基中分离CB-SC分泌的外泌体，并通过流式细胞术、蛋白质印迹法（WB）和动态光散射（DLS）进行鉴定。其次，使用绿色荧光脂溶性染料Dio对CB-SC来源的外泌体进行标记。随后，将标记后的外泌体与外周血单个核细胞（PBMC）共培养，通过流式细胞术检测Dio标记的CB-SC来源外泌体在PBMC不同亚群中的摄取阳性率。该方案为研究外泌体在干细胞免疫调节作用中的机制提供了指导。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案遵循哈肯萨克梅里迪安健康中心发现与创新中心机构人体研究伦理委员会的指南。人血沉棕黄层血液单位购自纽约血液中心（纽约，纽约州）。人脐带血单位采集自健康供体，并购自Oldsmar市（佛罗里达州）Cryo-Cell International血库。纽约血液中心和Cryo-Cell International均获得血液采集与分发的所有认证，并已取得机构审查委员会（IRB）批准及供体签署的知情同意书。

1. 细胞培养及CB-SC来源条件培养基的制备

  1. 将25 mL脐带血（材料表）缓慢加入含有20 mL密度梯度介质（γ = 1.077）的50 mL锥形管中。
  2. 在20 °C条件下，使用水平转子以1,690 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车。
  3. 小心吸取单个核细胞层（血沉棕黄层）转移至新的50 mL锥形管中。用磷酸盐缓冲液（PBS）将体积补至40 mL，混匀后以751 × g在20 °C离心10分钟，使细胞沉淀。
  4. 弃去上清液，向细胞沉淀中加入15 mL ACK裂解缓冲液（材料表），通过移液重悬细胞，室温孵育10分钟。
    注意：此步骤用于去除红细胞。
  5. 向锥形管中加入25 mL PBS，以751 × g离心5分钟，弃去上清液，获得单个核细胞沉淀。
  6. 用40 mL PBS洗涤两次，以去除残留的裂解缓冲液。
  7. 以751 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
  8. 弃去上清液，每管用10 mL化学成分明确的无血清培养基（材料表）重悬脐带血单个核细胞。
  9. 将所有脐带血单个核细胞合并至同一管中。
  10. 取20 µL细胞悬液与20 µL 0.4%台盼蓝溶液（材料表）在1.5 mL离心管中混合。
  11. 将混合液加入计数板，使用自动细胞计数仪测定细胞数量和细胞活力。
    注意：若细胞浓度超过1 × 107 个/mL，则细胞悬液需按1:10稀释后计数。
  12. 将单个核细胞以1 × 106 个/mL的密度接种于150 mm × 15 mm的培养皿中，每皿25 mL化学成分明确的无血清细胞培养基。
  13. 在37 °C、8% CO2条件下培养10–14天，直至脐带血来源的基质细胞（CB-SC）融合度超过80%。
  14. 弃去上清液，每培养皿用15 mL PBS洗涤一次，随后吸除PBS。
    注意：CB-SC与培养皿结合紧密。
  15. 重复步骤1.14两次。
  16. 每培养皿加入25 mL化学成分明确的无血清培养基。
  17. 在37 °C、8% CO2条件下继续培养3–4天。
  18. 将CB-SC来源的条件培养基收集至50 mL锥形管中。

2. CB-SC 的表征

  1. 使用5 mL移液枪头反复吹打10 mL基于PBS的细胞解离缓冲液，使CB-SC细胞脱离（材料表）。
  2. 在1,690 × g 条件下离心5分钟以收集细胞，并将细胞重悬于200 µL PBS中。
  3. 利用染色预处理试剂盒对细胞进行固定和通透处理，用于胞内染色（材料表）。
  4. 每个样本加入5 µL Fc阻断剂（材料表），室温孵育15分钟。
    注意：Fc阻断剂可抑制抗体染色过程中的非特异性结合。
  5. 向100 μL细胞悬液中加入终浓度为25 µg/mL的荧光标记小鼠抗人单克隆抗体，包括CD34、CD45、SOX2、OCT3/4、CD270和Galectin 9（材料表），室温避光孵育30分钟。
  6. 染色完成后，用1 mL PBS洗涤细胞，在751 × g 条件下离心10分钟以收集细胞。
  7. 将细胞重悬于200 μL PBS中，并转移至5 mL流式管中。
  8. 进行流式细胞术检测，以验证上述CB-SC相关特异性标志物的表达情况。

3. 脐带间充质干细胞来源外泌体的分离

  1. 将步骤 1.18 收集的条件培养基在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。将上清液转移至新的 50 mL 锥形管中。
  2. 将步骤 3.1 收集的上清液在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 20 分钟。将上清液转移至新的 50 mL 锥形管中。
  3. 将步骤 3.2 收集的上清液在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 30 分钟。将上清液转移至新的 50 mL 锥形管中。
    注意：使用固定角转子，以便细胞沉淀聚集在管壁一侧。标记管盖的一侧，并在管壁上画一个圆圈，指示预期沉淀位置。
  4. 使用 0.22 µm 滤器（材料表）过滤步骤 3.3 收集的上清液。
  5. 将 15 mL 培养基转移至每个 10 kDa 超滤离心管（材料表）中。
  6. 在 4,000 x g 下离心 30 分钟，以分离浓缩的外泌体培养基。
  7. 将浓缩的外泌体转移至超速离心管中，然后在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 80 分钟，沉淀外泌体。
  8. 弃去上清液，并用 10 mL PBS 重悬沉淀的外泌体。
  9. 在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 80 分钟，收集外泌体沉淀。
  10. 通过反复吹打，用 200 µL PBS 重悬外泌体沉淀。

4. CB-SC 来源外泌体的表征

  1. 使用二辛可宁酸法（BCA）试剂盒测定外泌体样品的总蛋白浓度
    1. 将步骤3.10中制备的每种白蛋白标准品和分离的外泌体样品各取10 µL，重复两份加入96孔板中。
    2. 向每个孔中加入200 µL BCA试剂盒中的工作试剂。将酶标板置于板式振荡器上，充分混匀10秒。
      注意：工作试剂（WR）：50份试剂A与1份试剂B混合。
    3. 用铝箔覆盖培养板，在37 °C下孵育30分钟。
    4. 将培养皿冷却至室温（RT）。
    5. 使用酶标仪在562 nm处测定样品的吸光度。
  2. 外泌体的制备及流式细胞术染色
    1. 通过加入20 μL抗人CD63磁珠（4.5 μm大小）捕获外泌体（材料表将25 μg在步骤3.10中制备的CB-SC来源的外泌体溶于总体积为100 μL的PBS中。
    2. 将试管置于摇床中，4 °C、800 rpm条件下孵育过夜（18‒22 h）。
    3. 将试管在 300 x g 30秒，以使样品沉降至管底。
    4. 加入300 µL分离缓冲液（PBS中含0.1%牛血清白蛋白（BSA）），用移液器轻轻混匀。
      注意：此步骤用于洗涤与磁珠结合的外泌体。
    5. 将试管置于磁力架上静置1分钟（材料表），弃去上清液。
    6. 重复步骤 4.2.4–4.2.5。
    7. 用400 µL裂解缓冲液重悬磁珠结合的外泌体。
    8. 将100 µL珠粒结合的外泌体分装至各管中。
    9. 向每管含有CD63磁珠捕获的外泌体的流式管中加入荧光标记抗体（CD9-FITC、CD81-PE和CD63-FITC，终浓度均为25 µg/mL）。
      注意：同型匹配的IgG用作阴性对照。
    10. 在室温下避光孵育45分钟，摇床转速为800 rpm。
    11. 重复步骤 4.2.4–4.2.5。
    12. 将结合外泌体的磁珠重悬于200 µL分离缓冲液中，转移至5 mL流式管中。
    13. 将试管放入流式细胞仪的样品架中。
    14. 打开外泌体检测方案。
    15. 通过流式细胞仪自动检测样品。
  3. 外泌体的蛋白质印迹检测
    注意：Western blot 是一种成熟的方法，本文不再详述该方法的具体细节。
    1. 裂解步骤 3.10 中获得的 CB-SC 来源外泌体沉淀物 加入100 µL RIPA裂解缓冲液，吹打20次，置于冰上5分钟。
    2. 使用BCA试剂盒测定外泌体裂解液的蛋白浓度，并每孔上样25 µg蛋白。
    3. 在150 V电压下进行凝胶电泳分离蛋白质，持续40分钟。
    4. 使用半干法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜11.
    5. 用5%脱脂牛奶封闭膜30分钟。
    6. 加入2 µg/mL抗人Alix抗体孵育 (材料表）和 1 µg/mL 抗人 Calnexin 抗体（材料表).
    7. 使用数字成像系统通过化学发光检测蛋白质。
  4. 通过动态光散射（DLS）对外泌体进行验证
    1. 将10 µg CB-SC来源的外泌体样品用1 mL PBS稀释。
    2. 将1 mL稀释后的样品转移至一次性半微量比色皿中（材料表).
    3. 将比色皿放入DLS仪器中。将所有样品监测的折射率（RI）设置为1.39。
    4. 在25 °C下运行样品，每份样品采集三次测量数据，以获得平均粒径分布。
  5. 通过透射电子显微镜（TEM）对外泌体进行验证
    1. 在300目铜网上涂覆火棉胶12 (材料表).
    2. 在铜网上用蒸发的碳层加强火棉胶膜12.
      注意：这种包被方法对样本支撑非常有效。
    3. 将10 µL外泌体样品加入载网上，静置晾干。
    4. 用醋酸铀酰对样品进行负染色，持续5分钟。
    5. 用去离子水洗涤三次，然后静置风干。
    6. 在透射电子显微镜下观察并拍照样品。加速电压设为 200 kV，束斑尺寸设为 2。

5. 检测不同PBMC亚群摄取DiO标记的CB-SC来源外泌体的情况

  1. 用绿色荧光脂溶性染料Dio标记CB-SC来源的外泌体
    1. 将100 µg CB-SC来源的外泌体（步骤3.10中制备）转移至15 mL离心管中。
    2. 用PBS稀释样品至5 mL。
    3. 加入绿色荧光脂溶性染料Dio（材料表），使工作浓度达到5 µM。
    4. 室温避光孵育15分钟。
    5. 将样品转移至超速离心管中。
    6. 在100,000 x g条件下离心80分钟，沉淀Dio标记的CB-SC来源外泌体。
    7. 将标记后的外泌体重悬于200 µL PBS中。
  2. 人外周血单个核细胞（PBMC）的制备
    1. 将25 mL人血沉棕黄层（材料表）缓慢加至含有20 mL密度梯度介质（γ = 1.077）的50 mL锥形管上层。
    2. 重复步骤1.2至1.11。
    3. 将1 × 106个PBMC转移至未经组织处理的疏水性24孔板中（每孔1 mL）。
      注：使用未经组织处理的培养板以避免单核细胞贴壁。
  3. 将Dio标记的外泌体与PBMC共培养
    1. 使用200 µL移液器，将步骤5.1.7制备的40 µL Dio标记的CB-SC来源外泌体加入24孔板中含PBMC的各孔中。对照孔中加入等体积PBS。
    2. 反复吹打混匀10次，孵育4小时。
    3. 收集200 μL经外泌体处理的PBMC，在室温下用Hoechst 33342染色10分钟。
    4. 室温下以300 x g离心10分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于100 µL PBS中。
    5. 将细胞滴加至显微镜载玻片上。
    6. 使用显微镜观察并拍摄Dio标记的CB-SC来源外泌体与Hoechst 33342标记的PBMC之间的相互作用。
    7. 将步骤5.3.3中剩余的细胞转移至1.5 mL离心管中。
    8. 在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于200 µL PBS中。
    9. 每份样品加入5 µL Fc阻断剂 ，室温孵育15分钟。
    10. 加入抗体（CD3、CD4、CD8、CD11c、CD14、CD19和CD56，浓度均为25 µg/mL）（材料表）对PBMC进行染色。
      注：同型匹配的IgG作为阴性对照。
    11. 室温避光孵育30分钟。
    12. 加入1 mL PBS，在4 °C下以300 x g离心10分钟，收集细胞沉淀。
    13. 用200 µL PBS重悬细胞，加入5 µL碘化丙啶（propidium iodide）。
    14. 使用流式细胞术评估不同PBMC亚群对Dio标记外泌体的摄取水平。

6. 检测CB-SC来源的外泌体对单核细胞的作用

  1. 分离人CD14阳性单核细胞
    1. 将3 × 107个人外周血单个核细胞（PBMC）转移至15 mL离心管中。
    2. 在4 °C下以300 × g离心10分钟。
    3. 将分离柱（材料表）置于磁力分离器（材料表）中。
    4. 用2 mL冷洗脱缓冲液（材料表）洗涤分离柱三次。
    5. 将细胞重悬于300 µL冷PBS中，加入60 µL CD14微珠，充分混匀后冰上孵育15分钟。
    6. 加入6 mL冷PBS，在4 °C下以300 × g离心10分钟。
    7. 将沉淀细胞重悬于500 µL冷洗脱缓冲液中。
    8. 将细胞转移至分离柱（步骤6.14中已准备）中，让其自然流过。
    9. 每次用2 mL洗脱缓冲液洗涤分离柱三次。将分离柱从磁力分离器上取下，放入15 mL离心管中。
      注：由于CD14阳性单核细胞在室温下易黏附于管壁，该15 mL离心管应置于冰上。
    10. 向柱顶加入2 mL冷洗脱缓冲液，将CD14阳性细胞洗脱至15 mL离心管中。
    11. 在4 °C下以300 × g离心10分钟，收集CD14阳性细胞沉淀。
    12. 用2 mL冷化学成分明确的无血清培养基（材料表）重悬细胞。
    13. 将50 µL细胞转移至1.5 mL离心管中。
    14. 加入10 µL Krome Orange标记的抗人CD14单克隆抗体（材料表），避光孵育20分钟。
      注：同型匹配的IgG作为阴性对照。
    15. 向细胞中加入1 mL PBS，在300 × g下离心10分钟以收集细胞沉淀。
    16. 将细胞重悬于200 µL PBS中，并转移至5 mL流式管中，通过流式细胞术检测CD14阳性单核细胞的纯度。
  2. 用CB-SC来源的外泌体处理单核细胞
    1. 将1 × 106个纯化的单核细胞接种于经组织培养处理的6孔板中，每孔加入2 mL化学成分明确的无血清培养基（材料表）。
    2. 在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。
    3. 用1 mL移液器吸弃上清液，轻柔加入2 mL预热至37 °C的化学成分明确的无血清培养基（材料表）。
      注：单核细胞在2小时内已贴壁，漂浮细胞被视为死亡细胞或其他污染细胞。
    4. 向6孔板中的单核细胞培养物中加入80 µg来自步骤3.10分离的CB-SC来源外泌体，总体积为2 mL。
      注：对照孔中加入等体积的PBS。
    5. 在37 °C、5% CO2条件下孵育3–4天。
    6. 使用倒置显微镜在200×放大倍数下拍摄细胞形态（材料表）。
    7. 用1 mL基于PBS的细胞解离缓冲液，通过1 mL移液器头反复吹打使细胞脱离。
    8. 使用细胞刮刀收集仍贴壁的剩余细胞。
      注：由于原代单核细胞或分化后的巨噬细胞贴壁较紧，在使用解离缓冲液处理后仍有部分细胞残留于底部，因此需使用细胞刮刀收集这些细胞。
    9. 在1,690 × g下离心5分钟收集细胞，用200 µL PBS重悬细胞。
    10. 每样本加入5 µL Fc阻断剂（25 µg/mL），以阻断非特异性结合。
    11. 向细胞中加入抗体（CD14、CD80、CD86、CD163、CD206和CD209，浓度均为25 µg/mL，材料表），室温孵育30分钟。
      注：同型匹配的IgG作为阴性对照。
    12. 向细胞中加入1 mL PBS，在300 × g下离心10分钟，弃上清，用200 µL PBS重悬细胞。
    13. 每样本（200 µL）加入5 µL碘化丙啶（propidium iodide），并将细胞转移至新的5 mL流式管中。
    14. 进行流式细胞术检测，分析CD14、CD80、CD86、CD163、CD206和CD209的表达水平。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

最初，通过流式细胞术检测CB-SC的表型和纯度，所用标记物包括与CB-SC相关的白细胞共同抗原CD45、胚胎干细胞特异性转录因子OCT3/4和SOX2。CB-SC高表达CD45、OCT3/4、SOX2、CD270和半乳糖凝集素9，但不表达CD34（图1A）。流式细胞术分析证实，脐带间充质干细胞来源的外泌体表达外泌体特异性标志物CD9、CD81和CD63。图1B）。通过TEM和DLS对外泌体的形态学及粒径分布进行表征（图1C，D），大小为 79.38 ± 20.07 nm。Western 印迹进一步证实外泌体相关标志物 Alix 的表达，而内质网相关标志物 Calnexin 无表达（图1E).

采用 Dio 标记的 CB-SC-Exo 处理 PBMC。显微镜观察显示，Dio 标记的 CB-SC-Exo 与 PBMC...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

外泌体的应用是临床诊断、药物开发和再生医学领域的新兴方向。本文介绍了一种详细的实验方案，用于制备脐带间充质干细胞（CB-SC）来源的外泌体，并研究这些外泌体对人单核细胞分化功能的影响。本方案表明，通过连续离心和超速离心法可高纯度地分离出具有免疫调节功能的CB-SC来源外泌体，且其能够有效调控单核细胞的免疫功能。

与其他传统方法相比，超滤法是一种基于分子量和排阻尺寸（与其他细胞外囊泡（EVs）不同）来分离和纯化不同细胞或培养基中外泌体的成熟技术。尽管超滤法在分离外泌体时比基于超速离心的分离方法更节省时间，但可能会对较大尺寸的囊泡造成结构损伤。此外，也可通过聚乙二醇（PEG）介导的沉淀法以较低成本收集外泌体，但该方法因存在蛋白质污染风险而可能影响外泌体的纯度13,14。因此，本实验方案具有成本效益，可高效获得高纯度的外泌体。鉴于脐带间充质干细胞（CB-SC）来源外泌体具有免疫调节功能10，对其特性进行表征可能为临床应用前评...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

赵博士是天河干细胞生物技术有限公司的创始人。赵博士是干细胞教育技术的发明人。其他所有作者均无与提交稿件相关的经济利益。

致谢

我们感谢Poddar先生和Ludwig先生通过哈肯萨克大学医学中心基金会提供的慷慨资金支持。感谢Laura Zhao在英文编辑方面所做的工作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml 微量离心管Fisher Scientific05-408-129
15 ml 锥形管Falcon352196
24 孔板Falcon351147非组织培养
板
3,3'-二辛基氧羰花青高氯酸盐（Dio）Millipore sigmaD4292-20MG4 °C 保存
300 目网格Ted Pella1GC300
50 ml 锥形管Falcon352070
6 孔板Falcon353046组织培养板
96 孔板Falcon353072组织培养板
ACK 裂解缓冲液Lonza10-548E100 ml
Amicon-15 10 kDa 离心过滤单元Millipore sigmaUFC901024
抗人 Alix 抗体Biolegend6345014 °C 保存，RRID: AB_2268110
抗人 Calnexin 抗体Biolegend6994014 °C 保存，RRID: AB_2728519
抗人 CD11c 抗体，Pe-Cy7BD Bioscience5613564 °C 保存，RRID: AB_10611859
抗人 CD14 抗体，Karma OrangeBeckman CoulterB362944 °C 保存，RRID: AB_2728099
抗人 CD163 抗体，PEBD Bioscience5560184 °C 保存，RRID: AB_396296
抗人 CD19 抗体，PC5Beckman CoulterIM2643U4 °C 保存，RRID: AB_131160
抗人 CD206 抗体，FITCBD Bioscience5511354 °C 保存，RRID: AB_394065
抗人 CD209 抗体，Brilliant Violet 421BD Bioscience5641274 °C 保存，RRID: AB_2738610
抗人 CD270 抗体，PEBiolegend3188064 °C 保存，RRID: AB_2203703
抗人 CD3 抗体，Pacfic BlueBiolegend3004314 °C 保存，RRID: AB_1595437
抗人 CD34 抗体，APCBeckman CoulterIM2427U4 °C 保存，RRID: N/A
抗人 CD4 抗体，APCBD Bioscience5553494 °C 保存，RRID: AB_398593
抗人 CD45 抗体，Pe-Cy7Beckman CoulterIM3548U4 °C 保存，RRID: AB_1575969
抗人 CD56 抗体，PEBeckman CoulterIM2073U4 °C 保存，RRID: AB_131195
抗人 CD63 抗体，PEBD Bioscience5619254 °C 保存，RRID: AB_10896821
抗人 CD8 抗体，APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterA946864 °C 保存，RRID: N/A
抗人 CD80 抗体，APCBeckman CoulterB306424 °C 保存，RRID: N/A
抗人 CD81 抗体，FITCBD Bioscience5619564 °C 保存，RRID: AB_394049
抗人 CD86 抗体，APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterB306464 °C 保存，RRID: N/A
抗人 CD9 抗体，FITCThermoScienticMA5-168604 °C 保存，RRID: AB_2538339
抗人 Galectin 9 抗体，Brilliant Violet 421Biolegend3489194 °C 保存，RRID: AB_2716134
抗人 OCT3/4 抗体，eFluor660ThermoScientic50-5841-824 °C 保存，RRID: AB_11218882
抗人 SOX2 抗体，Alexa Fluor 488ThermoScientic53-9811-824 °C 保存，RRID: AB_2574479
BCA 蛋白检测试剂盒ThermoFisher Scientific23227
牛血清白蛋白Millipore SigmaA1933
血沉棕黄层纽约血液中心每单位 40–60 ml
细胞刮刀Falcon353085
一次性半微量比色皿VWR97000590
解离缓冲液Gibco131510014100 ml
双室细胞计数板Bio-Rad1450015
外泌体-人 CD63 检测试剂ThermoFisher Scientific10606D4 °C 保存
Ficoll-Paque PLUS 密度梯度介质GE Health17-1440-03500 ml
固定角转子（25°）Thermo Scientifc75003698最大 24,700 × g
Gallios 流式细胞仪Beckman Coulter3 激光
最多 10 色
人脐带血Cryo-Cell International每单位 40–100 ml
人 Fc 封闭剂BD Bioscience5642204 °C 保存
Immun-Blot PVDF 膜Bio-Rad1620177
Millex-GP 注射器滤器单元，0.22 µmMillipore SigmaSLGP033RS
Optima XE-90 超速离心机Beckman Coulter
轨道摇床 MP4BioExpressS-3500-1
PBSThermoFisher Scientific10010049500 ml
碘化丙啶BD Bioscience56-66211E4 °C 保存
Nikon Eclipse Ti2 显微镜Nikon instruments IncEclipse Ti2NIS-Elements 软件版本 5.11.02
Hochest 33342Thermo Scientifc622495 ml
倒置显微镜Fisher scientific12563518
转子 41 TiBeckman Coulter331362最大 41,000 rpm
Sorvall St 16R 离心机Thermo Scientifc75004381
摆桶转子Thermo Scientifc75003655
TC-20 细胞计数仪Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 培养箱ThermoFisher Scientific
透射电子显微镜JEOLJEM-2100 PLUS
超速离心管Beckman Coulter331372
X'VIVO 15 无血清培养基LonzaBEBP04-744Q1000 ml 培养基，4 °C 保存

参考文献

  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3(2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160(2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87(2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763(2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165(2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084(2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

单核细胞分化外泌体分离CD14阳性单核细胞M2型巨噬细胞标志物流式细胞术分析超速离心方案人脐带血干细胞外周血单个核细胞干细胞教育疗法
人脐带血干细胞来源外泌体处理后单核细胞向表型不同的巨噬细胞分化
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。