超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

摘要

本文介绍了一种在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的实验方案。我们已标准化了在其原生组织环境中对高度敏感的成体干细胞群体进行成像的条件。该技术通过平衡时间分辨率与空间分辨率，实现在活体组织中直接观察生物学现象。

摘要

在成像技术中，空间分辨率与时间分辨率之间长期存在着关键的权衡。突破光的衍射极限的成像传统上仅限于使用固定样本，或对组织外带有强荧光信号标记的活细胞进行。目前的超分辨率活细胞成像技术需要使用特殊的荧光探针、高强度照明、多次图像采集并结合采集后的图像处理，或通常是这些步骤的组合。这些先决条件极大地限制了该技术可适用的生物样本类型和研究场景。

本文介绍一种在原位进行超分辨率（约140 nm XY分辨率）时间序列荧光活细胞成像的方法。该技术同样适用于荧光强度较低的情况，例如在低表达基因上内源性标记EGFP或mCherry。作为原理验证，我们已利用该方法对果蝇（Drosophila）睾丸中的多种亚细胞结构进行可视化观察。在组织制备过程中，解剖所得的睾丸组织可保持细胞结构和组织形态的完整性。本文中，我们应用该技术对微管动态、微管与核膜之间的相互作用，以及微管与着丝粒的连接情况进行成像观察。

该技术在样品制备、样品安装以及标本固定方面需要特殊的操作步骤。此外，标本在解剖后必须维持数小时，同时不能影响细胞的功能与活性。尽管我们已针对果蝇（Drosophila）雄性生殖系干细胞（GSCs）以及解剖所得睾丸组织中的前体生殖细胞优化了活细胞超分辨率成像的条件，但该技术可广泛适用于多种不同类型的细胞。在生理条件下观察细胞，同时不牺牲空间或时间分辨率的能力，将为致力于解决细胞生物学关键问题的研究人员提供一种不可或缺的工具。

引言

利用超越光衍射极限的分辨率，在活细胞中可视化亚细胞结构和蛋白质动态通常极具挑战性^1-3。尽管已开发出多种超分辨率技术，如随机光学重建显微镜（Stochastic-Optical-Reconstruction-Microscopy, STORM）、光激活定位显微镜（Photo-Activated-Localization-Microscopy, PALM）以及受激发射损耗显微镜（Stimulated-Emission-Depletion, STED）^4,5,6，但由于样品制备过程复杂，且需要在体外维持样本的活力与生物活性，传统超分辨率显微镜在活体样本成像中的应用仍受到限制。传统的共聚焦显微镜空间分辨率无法突破约230 nm的XY分辨率，通常不足以观察复杂的细胞亚结构^5,6。然而，近年来共聚焦显微技术的一项新进展——Airyscan超分辨率成像，能够实现约140 nm的XY分辨率^7,8，且样品制备相对简便，适用于活细胞成像。由于该成像检测系统需要较长....

方案

1. 活细胞成像混合液（活细胞培养基）的制备

1. 补充施奈德氏培养基 果蝇 含15%胎牛血清（FBS）和0.6倍青霉素/链霉素的培养基。调节pH至约7.0。
2. 使用培养基前，加入胰岛素至终浓度为 200 µg/mL。
   注意：该培养基对于维持细胞正常分裂和发育至关重要 果蝇 活体成像过程中的睾丸^10,14.

2. 玻璃底细胞培养皿的制备

1. 使用直径为35 mm的多聚-L-赖氨酸包被的玻璃底细胞培养皿进行果蝇（Drosophila）睾丸实验。培养皿内腔为直径23 mm、高1 mm的环形凸起，底部为玻璃材质（图1A-a）。
   注意：应选择工作距离较短、数值孔径较大、放大倍数较高的物镜所适用的玻璃底培养皿；这些特性对于获得超分辨率图像至关重要。
2. 使用允许气体交换的透析膜（截留分子量：12–14 kD），并将膜剪成小片。
   注意：膜片应小于培养皿的玻璃区域，但需足够大以完全覆盖样本。
3. 用100 µL活细胞培养基浸泡膜片约5分钟。切勿将干燥的膜直接用于样本上，以免造成损伤。该膜....

结果

在Drosophila组织中，特别是对于生殖干细胞（GSCs），突破衍射极限的活细胞成像为研究细胞周期进程中亚细胞事件的动态变化提供了机会。最近一项利用本方案的研究表明，在GSCs中，母体中心体与子代中心体的微管活动在时间上具有不对称性¹⁰。母体中心体在进入有丝分裂前约4小时即开始发出微管，而子代中心体仅在有丝分裂起始时才发出微管。来自母体中心体的高度活跃的微管会与核膜相互作用，并诱导极化的核膜破裂（Nuclear Envelope Break Down, NEBD）。局部的核膜破裂发生在靠近干细胞微环境（hub）的一侧，使得母体中心体发出的微管能够进入细胞核，并优先结合更强的姐妹动粒和姐妹着丝粒，从而确保它们被分配至未来的干细胞。这些观察结果表明，存在一种不对称的有丝分裂轴，其中微管、核膜、动粒和着丝粒以时空可控的方式相互作用，最终确保染色体的非随机分离^10,11,12。

讨论

超分辨率显微技术可实现数十纳米的空间分辨率^4,5,6。STORM 和 PALM 显微技术可实现高达 20 至 50 nm 的分辨率（XY 方向），而 STED 显微技术的分辨率为 20 至 100 nm（XY 方向）。SIM 显微技术的空间分辨率则受限于 100 至 130 nm¹⁵。然而，由于这些技术具有高光子密度和较长的采集时间，因此在活细胞成像中的应用极为困难。

在组织内的活细胞中对细胞骨架、染色体和细胞器等亚细胞结构进行成像，要求该技术兼具超高灵敏度和非侵入性，同时仍具有高空间分辨率。本文介绍的Airyscan超分辨率技术结合了共聚焦成像与0.2艾里单位针孔，并采用像素重分配和去卷积算法。该技术的空间分辨率可达传统共聚焦显微镜的1.7倍⁷。传统共聚焦显微镜的分辨率约为220–230 nm，受限于光的衍射极限；而该成像技术.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Adobe Illustrator CS6（绘图软件）	Adobe	N/A
透析膜	Spectra/Por 1-4 标准再生纤维素透析膜	货号 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	货号 26140079	15% (V/V)
Fiji（分析软件）	NIH	N/A	图像荧光强度定量
玻璃底细胞培养皿（FluroDish）	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris（图像重建软件）	Bitplane	N/A	三维图像重建
浸油	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
胰岛素	Sigma	货号 15550	200 µg/ml
青霉素/链霉素	Invitrogen	货号 - 15140-122	0.6x
Schneider 果蝇培养基	Invitrogen	货号 - 11720-034
转盘共聚焦显微镜	Zeiss	N/A	配备 evolve 相机（Photometrics），使用 63x Zeiss 物镜（1.4 NA）
纸巾	Kimwipe	N/A	润湿以形成湿室
配备 AiryScan 超分辨率模块的 LSM 800 共聚焦显微镜	Zeiss	N/A	配备高灵敏度 GaAsP（砷化镓磷）探测器，使用 63x Zeiss 物镜（1.4 NA）
ZEN（成像软件）	Zeiss	N/A