小鼠B细胞发育的流式细胞术表征

摘要

本文介绍了一种通过流式细胞术对小鼠腹膜、脾脏和骨髓组织中免疫B细胞区室异质性的简单分析方法。该方案可适用于并扩展至其他小鼠组织。

摘要

大量研究已对小鼠B细胞在次级淋巴器官中的发育和分化过程进行了表征。由B细胞分泌的抗体已被分离并开发为成熟的治疗手段。在易患自身免疫疾病的小鼠或免疫系统经过改造的小鼠中，验证B细胞的发育情况，是开发或测试小鼠治疗药物的重要环节，也适合采用流式细胞术进行分析。已有成熟的小鼠B细胞流式细胞术检测参数可用于评估腹膜、骨髓和脾脏中的B细胞发育，但必须遵循一系列最佳实践操作。此外，B细胞区室的流式细胞术分析还应结合其他B细胞发育的检测指标。利用该技术获得的数据可进一步加深我们对野生型小鼠、易患自身免疫疾病的小鼠模型以及人源化小鼠的理解，后者可用于生成抗体或类抗体分子作为治疗药物。

引言

单克隆抗体随着逐渐成为主流医学的一部分，已日益成为治疗多种人类疾病的首选疗法^1,2。我们此前已描述过经基因工程改造的小鼠，其能高效产生携带完全人源可变区并具有小鼠IgH恒定区的抗体^3,4。最近，我们进一步描述了可产生具有独特抗原结合能力的类抗体分子的基因工程小鼠⁵。抗体由B细胞分泌，是适应性体液免疫的基础。B细胞分为两种不同类型：B-1和B-2。在哺乳动物中，B-1细胞起源于胎儿肝脏，出生后富集于黏膜组织以及胸膜腔和腹膜腔；而B-2细胞在出生前起源于胎儿肝脏，出生后则主要在骨髓（BM）中产生。B-2细胞富集于包括脾脏和血液在内的次级淋巴器官^6,7,8。在骨髓中，B-2造血祖细胞在免疫球蛋白μ重链重排启动后开始分化为前B细胞（pro-B细胞）^9,10。免疫球蛋白重链成功重排并组装成前B细胞受体（pre-BCR），伴随信号传导和增殖性扩增，促使细胞进一步分....

方案

所有小鼠实验均由再生元公司机构动物照护与使用委员会（IACUC）监督并批准。实验使用来自杰克逊实验室的三只雌性C57BL/6J小鼠（17周龄）的组织进行。在开始实验前应对所有抗体进行滴定，以确定最佳浓度。使用补偿微珠进行单色补偿时，应确保其染色强度等于或高于样本的染色强度。所有缓冲液、抗体和细胞均需置于冰上或4 °C保存。加入活率染料后，所有步骤和孵育均需在4°C下避光或在低光照条件下进行。

1. 腹腔细胞收获与单细胞分离

1. 使用 CO₂ 或根据批准的方案对小鼠实施安乐死_。
2. 将小鼠仰卧放置，喷洒70%乙醇消毒，用剪刀剪开腹部外层皮肤，注意不要剪破腹膜。
3. 使用装有25号针头的3 mL注射器，向腹腔内注射3 mL冰上预冷的洗涤缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的DPBS [体积比]）。
4. 用手指轻轻按摩腹膜。
5. 重复步骤1.3和1.4。
6. 将装有18号针头的3 mL注射器插入腹膜，注意避开器官和脂肪组织。
7. 吸取含有腹腔细胞的洗涤缓冲液，并转移至冰上的15 mL锥形管中。
8. 重复步骤1.3和1.4。
9. 用镊子提起腹膜，剪出一个小孔。
10. 将一次性移液管插入小孔，收集残留的洗涤缓冲液，再次注意避开脂肪和器官。
11. 将收集的剩余腹腔细胞....

结果

本文展示了小鼠腹膜、骨髓和脾脏中B细胞发育的设门策略。分析的基础是先使用活力染料染色，然后根据前向散射面积（FSC-A）和前向散射高度（FSC-H）排除双联体细胞，最后通过前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）的特征选择细胞，以去除碎片，此步骤称为大小设门，反映细胞的相对大小和颗粒度，之后再对目标细胞群进行设门分析。

腹腔B细胞的流式细胞术分析显示了C57BL/6J小鼠中活细胞、总B细胞、B-1和B-2亚群以及B-1a和B-1b细胞在腹腔细胞中的比例（图1），所用染色方案见表1。这些比例对应的平均绝对细胞数量见表5。B-1细胞的异常可通过细胞亚群的分布情况来界定，该分布可基于细胞比例或每只小鼠的绝对细胞数进行分析。

讨论

自20世纪80年代以来，对淋巴组织和非淋巴组织进行流式细胞术分析，已能够同时鉴定并计数小鼠和人类中的B细胞亚群。该方法已被用作体液免疫的评估手段，并可进一步用于评价B细胞的功能特性。本方法利用现有试剂，通过同时分析多个参数，评估小鼠和人类B细胞成熟的不同阶段，从而揭示B细胞的异质性，即使在稀有细胞群体中亦可实现。当用于检测复杂且异质性的样本时，可在数分钟内对单个细胞进行亚群检测³³。在流式细胞术分析中，最常采用的逐级设门分析策略，在需要鉴定特定细胞群时，通常简单而直观³⁴。最后，流式细胞术的另一优势在于其易于在大多数学术实验室中开展，尤其在有经验的操作者指导下更为便捷。本实验方案详细描述了通过鉴定和计数B-1细胞群，并深入分析B-2细胞发育过程中的前B细胞、未成熟B细胞、过渡期B细胞及成熟B细胞，以及它们表面Igκ或Igλ轻链的表达情况，从而对小鼠腹膜、骨髓（BM）和脾脏中的B细胞群体进行评估。在研究小鼠B细胞发育时，流式细胞术是最广泛使用且最简便的方法。

尽管流式细胞术能够产生极为宝贵.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 安全锁 Eppendorf 管	Eppendorf	22363611	0.5 mL 微量离心管
1.5 mL Eppendorf 管	Eppendorf	22364111	1.5 mL 微量离心管
15 mL Falcon 管	Corning	352097	15 mL 圆锥形管
18 号针头	BD	305196
25 号针头	BD	305124
3 mL 注射器	BD	309657
70 mM MACS SmartStrainer	Miltenyi Biotec	130-110-916	70 mM 细胞筛
96 孔 U 型底板	VWR	10861-564
ACK 裂解缓冲液	GIBCO	A1049201	红细胞裂解缓冲液
Acroprep Advance 96 孔滤板	Pall Corporation	8027	滤板
B220	eBiosciences	17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ	BD	552843	补偿微珠
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ	BD	552844	补偿微珠
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A8577	BSA
BP-1	BD	740882
Brilliant Stain Buffer	BD	566349	荧光染色缓冲液
C-Kit	BD	564011
CD11b	BD	563168
CD11b	BioLegend	101222
CD19	BD	560143
CD21/35	BD	562756
CD23	BD	740216
CD24 (HSA)	BioLegend	138504
CD3	BD	561388
CD3	BioLegend	100214
CD43	BD	553270
CD43	BioLegend	121206
CD5	BD	563194
CD93	BD	740750
CD93	BioLegend	136504
DPBS (1x)	ThermoFisher	14190-144	DPBS
eBioscience 可固定活力染料 eFluor 506	ThermoFisher	65-0866-14	活力染料
Extended Fine Tip 转移移液管	Samco	233	一次性转移移液管
FACSymphony A3 流式细胞仪	BD	custom order	流式细胞仪
Fc 阻断剂，CD16/CD32 (2.4G2)	BD	553142	Fc 阻断剂
FlowJo	Flowjo		流式细胞仪分析软件
gentleMACS C 管	Miltenyi Biotec	130-096-334	自动化解离管
gentleMACS Octo 解离仪（带加热模块）	Miltenyi Biotec	130-095-937	组织解离仪
GR1 (Ly6C/6G)	BioLegend	108422
IgD	BioLegend	405710
IgM	eBiosciences	25-5790-82
Kappa	BD	550003
Lambda	BioLegend	407308
多聚甲醛，32% 溶液	Electron Microscopy Sciences	15714
Ter119	BioLegend	116220
True-Stain 单核细胞阻断剂	BioLegend	426103	单核细胞阻断剂
UltraPure EDTA，pH 8.0	ThermoFisher	15575038	EDTA
Vi-CELL XR	Beckman Coulter	731050	细胞计数仪