研究血管医疗器械血细胞相容性和宿主细胞活化的体外血流循环模型

医疗器械的血相容性测试是开发血管支架或灌注管等用于体外膜氧合的新设备的关键步骤。直到今天，动物模型还被视为标准工具，在医疗器械在人类实施之前完成医疗器械测试程序。从今以后，有必要寻找替代体外模型，进一步有助于最大限度地减少对动物的调查。因此，在这项研究中，我们探索了一个微型体外血热动力学循环模型。该方法的目标是按照ISO 10993-4标准测试医疗器械的体外血液相容性。

ISO 10993-4 标准描述了要对血液样本 1 进行调查的标准化^{临床参数集}。简言之，这些是血栓形成（血小板聚集和计数）、凝血（纤维蛋白肽A、FPA）、血液学分析（全血细胞计数）、造血指数（自由血浆血红蛋白）和补血系统（终端补充复合体，sC5b9）。然而，其他标记，如嗜中性粒细胞多形态核弹性酶（PMN），白细胞间6（IL-6）和肿瘤坏死因子- alpha（TNF）反映白细胞的激活状态，也可以考虑测量。为了确定和量化血浆中存在的循环细胞自由蛋白，三明治酶链接免疫吸附剂测定（ELISA）代表了一种传统和最可靠的方法^2，3。同样，通过流式细胞学（FACS）检测分子的细胞表面表达（基于单细胞悬浮的读数，其中荧光标记的特定抗体与靶细胞表面分子^4结合），可以量化宿主细胞（如白细胞）的表型和活化状态。也建议扫描电子显微镜 （SEM） 以确定 ISO 10993-4 标准 1 的测试材料上的血栓^形成。此方法可以辅以 X 射线显微断层扫描 （μCT），对血栓进行结构分析，例如，在 3D 渲染图像⁵中，其厚度、大小和定位。

使用这种体外血流动力学模型的理由是，通过了解血液成分（如血小板）的基本生理动力学，以及它们与不同类型的血管装置的相互作用，来筛选性能最佳和相容的医疗器械。这种体外系统是高度要求的，因为它们减少了对动物研究的要求。

此处介绍的循环模型满足了这些要求。这个模型最初由 A.B钱德勒在1958年描述为血血栓的生产，因此，也被称为钱德勒循环^模型6。到目前为止，该模型已被用于一系列的实验和修改，以调查^{医疗器械7，8，9，10，11，12，13，14}的血液^{生物相容性}。它由聚合物管组成，部分充满血液，形成可回收的回路。这些回路在温度控制的水浴中旋转，以模拟血管流动条件及其血液学效应。替代方法，如泵驱动模型或模型，使用机械球阀内的循环，以诱导血液流动内的聚合物管已经描述了^15，16。然而，本文提出的方法的整体优势是，应用于血细胞和蛋白质的机械力低，避免血解，并且血液和连接器之间没有接触，这可能导致流动湍流和血液成分的激活。回路内的主要激活因素是测试材料本身和内部捕获的空气。这有助于最大限度地减少测量误差的来源，并提供高可重复性，即使血空界面可导致蛋白质变性^17。也可以调查各种管材和支架直径，没有长度或大小限制，从而允许使用不同的长度和内径管。此外，在不准确的环闭和暴露在未涂层管表面的宿主血容也是可能的调查。这种体外血动力循环模型的其他类似医学应用是，它也可用于研究免疫治疗（药物）和血液成分之间的相互作用，无论是临床前开发或个别药物安全筛选之前的第一阶段第一阶段临床试验，或产生血栓材料，可用于进一步实验18，19，20。

本研究描述了测试灌注管和/或支架的血容的详细协议。在这里，无涂层和涂层PVC管（HepPVC:肝素涂层，聚PVC:生物活性聚合物涂层）的比较。血小板的活化降低，但与未涂覆管相比，两种涂层管的凝固系统（FPA）的活化率更高。这里使用的 HepPVC 管经过共价绑定肝素的修改，使其血栓性^21， 并且已在循环模型中用于优化和描述不同的参数²²。本研究中使用的聚PVC管是用于体外血液灌注临床设置的商用管，并涂有肝素聚合物，以减少其血栓^原性23。有时，在临床应用中，甚至使用未涂覆的PVC管。因此，我们包括乳胶管作为正对照组，显示血小板的过度活化，凝固系统和可溶性因素，如IL-6，TNF和PMN弹性酶。模拟不准确的环闭合时，注意到了血栓的形成。与基线条件相比，这导致了凝血和补剂系统以及白细胞和血小板的激活。此外，血液接触这里使用的支架材料（裸金属尼丁醇支架，覆盖碳浸渍扩大聚四氟乙烯）导致更高的血小板和白细胞活化在PMN弹性酶方面。总体而言，所提出的模型没有在任何测试的血管装置中诱导血解，因为它们与基线或静态条件相当，但乳胶管除外，其中红细胞（RBC）血解明显。此外，这些灌注管可以通过成像或组织学检查。虽然组织学评估可能是可行的，但我们主要关注ELISA和流式细胞学来进行这些实验，从而使许多实验室根据本文提出的模型进行实验的敏感性。因此，该方法是按照ISO 10993-4标准的建议，对血管医疗器械的血液生物相容性进行检验的可行方法。此外，当血液和材料之间的相互作用应在流动条件下进行测试时，可以使用这种方法，模仿体内条件。

这项研究得到了马格德堡大学医学院伦理委员会（申请号88/18）的批准，受试者在抽血程序之前提供了书面知情同意。

1. 肝素库存制备和血液取样

1. 计算整个实验所需的血液量。
   注:几乎，每个血管设备需要5 mL的肝素血重复（循环）。同样，每个基线和静态条件需要 5 mL 的血液，这些血液在室温下保持。
2. 通过稀释去压水中未分离的肝素（例如Rotexmedia），在浓度为100 IU/mL时准备肝素库存溶液。使用此溶液的 150 μL 进行 10 mL 新鲜血液的肝素化。
3. 计算全血细胞计数、ELISA 和 FACS 测定所需的血液量和血浆量。
   注:本研究中表示的测量值来自两个平行运行的循环（一个为重复），总血量为 10 mL。
4. 根据所需血液量，用150μL的肝素库存溶液填充10 mL注射器，以防止最终肝素浓度为1.5 IU/mL血液的血液凝固。
5. 用蝴蝶抽血（大小:21G）。非常轻柔地填充注射器，以避免因真空过多而产生血解或细胞激活。
   注:在实验开始前，应获得当地道德委员会的许可。获得每个献血者知情同意。确保献血者健康，不服用任何药物，特别是实验前至少10天不服用抗血小板剂或非类固醇抗炎药物。值得注意的是，在比较不同类型的血管设备时，选择相同的捐赠者，如本手稿中介绍。为了进一步评估个体间的差异，可以与不同的捐助者重复议定书。
6. 在玻璃烧杯中收集血液，避免过度搅拌。

2. 体外血流动力学循环总成

1. 将水浴注满，直到水位达到旋转单元的中心。将水温设置为 37 °C。
2. 用于测试不同管材的循环组件（聚PVC、HepPVC、PVC和乳胶）
   1. 用管切割机切割两块 50 厘米长的管材（内径 5 mm）。确保切割表面平整，因为对于小直径的回路的完美闭合尤为重要，这样血液在管接头边缘上不会出现任何变形。
      注:整个协议使用内径为 5 mm 的管。
   2. 为了便于处理，避免旋转后样品处理延迟，请并行运行四个循环（2 个重复材料）。
   3. 要生成循环形状，请将管的开端插入一小块硅管中，以安装调查管的外径。
   4. 使用聚碳酸酯张力带，确保正确关闭环路。首次使用时，通过用剪刀切割张力带，调整带子的长度以适应环路的外径，然后用 3 mm 扭矩扳手固定。
   5. 在检查管端时小心拧紧张力带接头的锁紧螺钉。调整闭合力，使管端之间没有间隙。如果锁紧螺钉完全拧紧，且聚碳酸酯带的张力似乎过低，以关闭管端之间的间隙，则打开锁定系统并切割几毫米的张紧带。重复此，直到实现精确的环路闭合（图 1A）。
   6. 如果管材非常柔软，并且倾向于在张力带内滑动，则用电胶带将环固定到张力带上（图 1B，C）。
   7. 为温度控制准备一个附加的 PVC 循环，其尺寸与测试回路相同。
   8. 将回路固定到水浴外旋转装置的循环底座中。此后，将循环底座连接到水浴内的旋转单元（图 1E）。
   9. 部分从环路上拆除张力带，并拔下每个管的一端以打开环路。
   10. 用 5 mL 血清移液器轻轻填充每个循环 5 mL 的血液。在将血液轻轻混合到玻璃杯中两次，在装入循环之前，缓慢上下移液。
   11. 拿一次性温度计，放在温度控制回路内。如果温度计太大，用剪刀剪下来，以安装较小的管子。在室温下用5 mL的去化水填充循环。
   12. 关闭环路，确保环路、张力带和机架是否安装正确。
   13. 将转速设置为每分钟 30 转 （rpm），旋转 3 小时。
3. 用于测试不当环路闭合（间隙）影响循环组件
   1. 准备四个循环（多边形PVC），如2.2中所述。
   2. 用张紧带正确关闭两个环，避免管端之间的任何间隙。
   3. 对于其他两个循环，如 2.2.3 所述，将开端插入更大的管中，但在环路端点之间留下 1-2 mm 的间隙。请勿使用这些环路的张力带（图1D）。
   4. 准备一个温度控制回路，如 2.2.7 和 2.2.11 中所述。
   5. 如 2.2.10 中所述，用血液填充所有循环。
   6. 将转速设置为 30 rpm，旋转 3 小时。
4. 支架测试的循环组件
   1. 准备四个循环，如 2.2 中所述，如下所示。
      注:为了评估支架的血液生物相容性，应测试管材本身是否具有生物相容性，以防止细胞活化。如果不存在数据，可以像 2.2 中所述对管材料本身进行测试。此外，支架内的直径范围可应用（参见制造商的说明），并且应适合管材的内径。
   2. 打开两个回路，将管子从张力带系统中带走。
   3. 根据制造商的说明，将支架插入管中间。
   4. 使用不带支架的其他两个循环作为控件。如 2.2.10 中所述，用血液填充所有循环。
   5. 将转速设置为 30 rpm，旋转 3 小时。
5. 温度控制
   1. 在持续时间内的任何时间以及停止旋转时，回路内的血液温度由温度控制回路内的温度计指示。要读取温度，请停止旋转并立即读取温度计指示的温度。

3. 血液样品处理

1. 旋转后，让回路在机架中站立 2 分钟，处于向上位置，让血液积聚在回路底部，避免在打开回路时溢出。
2. 检查留下的血液是否静静:如果血液凝固，最终怀疑肝素不当。在这种情况下，最好也使用另一个献血者重复实验。
3. 小心地将循环从机架中拿出来。打开接头，让血液流入 10 mL 玻璃烧杯。
4. 从重复运行的管子中抽出血液。
5. 从同一供体中抽出新鲜血液进行基线分析，如 1.5 和 1.6 中所述。
6. 柠檬酸钠血的收集
   1. 对于柠檬酸钠血液的收集，填充四个1.5 mL管，每个管中含有从柠檬酸钠管中收集的111μL柠檬酸钠溶液，最终产生3.2%的柠檬酸钠浓度。
   2. 如 1.6 和 3.3 所述，用玻璃烧杯中 1 mL 的血液填充每个管。
   3. 保持血液在室温下，并使用此血液进行 FACS 分析，如 12 所述。
      注:要更改不同实验设置的环路长度，请根据要测量的数量正确规划等分。在进行实际实验之前，可能需要用新鲜血液建立所有必需的测量结果，以确保循环中的血液量足以用于所有测量。
7. 收集乙二胺甲酸（EDTA）血液和血浆样品。
   1. 从每个带血的玻璃烧杯（见1.6和3.3）将4.5毫升血液转移到一个5mlEDTA管中。用血液从每个 10 ml 玻璃烧杯中填充两个 EDTA 管。
   2. 轻轻地混合血液，放在冰上。
   3. 将 2 mL 的血液转移到 2 mL 锁定离心管中，并使用此血液进行血细胞计数和自由血红蛋白测量，如 5 中所述。和6.
   4. 将剩余血液以3，500 x g离心 20分钟。
   5. 小心地将血浆收集在500μL等分中，并立即在-80°C下冻结。

4. 扫描电子显微镜和+CT图像

1. 血液样本处理后，用 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗 2.3 中所述的空环。
2. 用手术刀小心地从每个管子的每一端切开一个1厘米长的样品。
3. 在4°C下孵育样品，在2%的谷胱甘肽溶液中孵育样品。
   注意:吸入醛蒸汽可引起鼻腔症状，如流鼻涕或持续闷塞和气道刺激，与皮肤接触会导致皮炎。戴手套、防护服和安全护目镜时，应在烟罩中处理醛。
4. 用 PBS 冲洗样品（3 次）。
5. 在去维化水中制备1%的三氧化硅（OsO_4）溶液，并在室温下孵育样品15分钟。
   注意:OsO₄ 是一种强氧化剂，可通过暴露在光线下减少。为了避免在制备过程中减少，请将 OsO₄ 存放在棕色玻璃瓶中。OsO₄ 挥发性极强，其烟雾对眼睛、鼻子和喉咙有毒。始终在烟罩下工作，使用手套和保护衣物，确保身体的任何部位都暴露在 OsO_{4 中}。联系您机构有关废物处理和储存处理的准则。一般来说，OsO₄ 可存储几个月，但它需要特殊的玻璃瓶与特氟龙衬里和干燥器，因为 OsO₄ 可以变色内部表面和冰箱内装物在泄漏烟雾的情况下。
6. 提取样品，将其转移到新的 15 mL 离心管中，然后用 PBS 冲洗样品 3 次。
7. 准备一系列浓度不同的乙醇（25%、50%、75%、95%、100%）
8. 乙醇中的脱水样品:在25%、50%、75%、90%和30分钟内孵育20分钟。
9. 从 100% 乙醇中抽取样品，让它在室温下通宵干燥。
10. 在 5 kV 的加速度电压下，使用 X 射线 μCT 扫描仪检查扫描电子显微镜中的样品。

5. 血细胞计数

1. 服用 2 mL 的 EDTA 血液，如 3.7.3 中所述
2. 将管子插入自动血液学分析仪，并按照制造商的说明操作。

6. 等离子体中自由血红蛋白（fHb）的测量

1. 从 3.7.5 中描述的每个条件中解冻一个等离子样品。解冻后储存在冰上。
   注:始终在37°C的水浴中解冻冷冻血浆样品，并立即转移到含有一些水的冰中，以降低温度。这对于避免在解冻过程中激活血液成分非常重要。
2. 使用 fHb 试剂，并按照制造商的说明进行操作。打开后避免污染，防止试剂受到直接光线（阳光、紫外线）的照射。
3. 使用1:5稀释的移液方案（参见制造商的说明）。
4. 在1.6 mL半微库中加入1000μL的血红蛋白试剂。使用此 cuvette 确定空白值。
5. 将 1000 μL 的血红蛋白试剂和 250 μL 的血浆样品加入另一个半微库中。
6. 通过反复填充反应混合物，将两个槽中的内料混合，并在室温下孵育至少3分钟。
7. 确定样品对fHb试剂的消光（E）为空白试剂。计算样品的 fHb 浓度 （mmol/l）: E₅₄₀-E₆₈₀ x 0.452。

7. FPA 的测量

1. 从3.7.5中描述的每个条件中解冻血浆样品，解冻后储存在冰上。
2. 使用 FPA Elisa 套件，并按照制造商的说明进行操作。

8. sC5b9 的测量

1. 从3.7.5中描述的每个条件中解冻血浆样品，解冻后储存在冰上。
2. 使用 sC5b-9 ELISA 套件，并按照制造商的说明操作。

9. PMN 的测量

1. 从3.7.5中描述的每个条件中解冻血浆样品，解冻后储存在冰上。
2. 使用 PMN-弹性酶 ELISA 套件，并按照制造商的说明进行操作。

10. TNF的测量

1. 微孔板必须在运行 ELISA 前一天涂覆。对于涂层，在2°C-8°C下将100μL的捕获抗体溶液加入到所有孔、密封板和孵育中。
2. 从 3.7.5 中描述的每个条件中解冻一个等离子样品。解冻后储存在冰上。
3. 使用 TNF ELISA 套件，并按照制造商的说明操作。

11. IL-6的测量

1. 微孔板必须在实验前一天涂上捕获抗体。对于涂层，在4°C下，将100μL的捕获抗体溶液加入微孔板的所有孔井中，并密封板，并在4°C下隔夜孵育
2. 从 3.7.5 中描述的每个条件中解冻等离子体样本。解冻后储存在冰上。
3. 使用 IL-6 ELISA 套件，并按照制造商的说明操作。

12. FACS 分析

1. 通过添加 10 mL 的胎儿小牛血清和 2 mL 的 EDTA 溶液 （0.5 M） 到 488 mL 的 1x PBS 来准备 500 mL 的 FACS 缓冲液。FACS 缓冲区可以在 4°C 下存储 4 周。
2. 在每个染色过程（单细胞血小板聚合体（MPA）、血小板活化（PA）、白细胞内分（LI））使用100μL的柠檬酸钠血（参见3.6.3）。
3. 将100μL的血液从每个样品中移入5 mL FACS管。在每个样品中，用MPA（单细胞血小板聚合体）面板、PA（血小板聚合体）面板和LI（白细胞集成）面板制备3个用于抗体染色和标签的管。
4. 将其余 4 个样品混合到一个 5 mL FACS 管中。使用此混合物用于未污染和荧光减去一 （FMO） 控制。
5. 通过将混合样本血的100μL移液到每个管中，准备6个FACS管。将 3 管标记为未污染管，将 3 管标记为 FMO-CD41、FMO-CD62P 和 FMO-CD162。
6. 加入100μL的4%的甲醛溶液，在室温下在黑暗中孵育15分钟。
   注意:甲醛对皮肤和眼睛有毒。吸入后可引起严重的肺刺激，长时间接触后可导致肺部损伤。此外，它被归类为致癌物质和生殖毒素。始终戴上手套和安全眼镜，在烟罩下工作。
7. 在每个管中加入1 mL的洗涤缓冲液，以287 x g的离心机 进行5分钟。丢弃上一杯，重复洗涤步骤两次。
8. 对于红血球（RBC）解液，加入1mL的1x缓冲RBC解液缓冲液（稀释10xRBC解液缓冲液在去ion化水中），通过缓慢上下移液混合，在黑暗中在RT中孵育5分钟。
9. 为单个污渍准备补偿珠。到 1 mL 的 FACS 缓冲器添加 4 滴每个正负珠。涡流彻底，并添加100μL的珠液到一个5mL FACS管。
10. 准备4个带珠子和标签的管子，作为CD14-FITC、CD41-BV421、CD45-APC和CD62P-PE。在每个管中加入1 mL的FACS缓冲液，以287 x g的离心机进行5分钟。丢弃上一杯，继续冰上。
11. RBC 解解后，将 1 mL 的 FACS 缓冲液添加到每个管中，然后如 12.7 中所述进行清洗。丢弃上一个。
12. 准备抗体鸡尾酒:
    1. MPA 面板:添加 4 μL 的 CD45-APC、4 μL 的 CD14-FITC 和 4 μL 的 CD41-BV421 至 388 μL 的 FACS 缓冲液。
    2. PA面板:将1.6μL的CD41-BV421和12μL的CD62P-PE添加到386.4μL的FACS缓冲液中。
    3. LI面板:添加4μL的CD45-APC和8μL的CD162-BV421至388μL的FACS缓冲液。继续冰上。
13. 准备单个污渍:为 CD14-FITC、CD41-BV421 和 CD45-APC 各加入 0.5 μL 至 499.5 μL 的 FACS 缓冲液。对于 CD62P-PE，将 0.3 μL 添加到 499.7 μL 的 FACS 缓冲液中。继续冰上。
14. 准备FMO控制:（i） MPA面板（FMO-CD41）:将1个μL CD14-FITC抗体和1 μL的CD45-APC抗体加入98μL FACS缓冲液。（ii） PA面板（FMO-CD62P）:将 CD41-BV421 添加到 99.6 μL 的 FACS 缓冲液中。（iii） LI面板（FMO-CD162）:在99μL的FACS缓冲液中加入1μL的CD45-APC。将 FMO 控制装置放在冰上。
15. Vortex 抗体鸡尾酒，并添加 100 μL 的每一抗体鸡尾酒，如 12.12 中制备的每个标签管（MPA、PA 和 LI 面板），如 12.3 所述，通过上下移液轻轻混合。在黑暗中继续 Rt 。
16. 涡流单染色抗体稀释，并加入100μL的单染色抗体稀释，如12.13中制备。每个标签管与珠子如12.7所述，轻轻混合通过上下移液。在黑暗中继续 Rt 。
17. Vortex FMO 抗体鸡尾酒，并加入 100 μL 的每款 FMO-1 抗体鸡尾酒，如 12.14 中制备。每个标签管（FMO 控制），如 12.5 中所述。通过上下移液轻轻混合。在黑暗中保持 Rt 。
18. 在黑暗中用抗体染色孵育所有管子30分钟。
19. 将三根管用于无污染控制（参见 12.4），并在 250 μL 的 FACS 缓冲液中重新填充颗粒。继续冰上。
20. 孵育时间后，用 12.7 中所述的 FACS 缓冲液洗洗除未污染控制装置以外的所有管。在 250 μL 的 FACS 缓冲液中重新暂停颗粒，并获取流式细胞仪上的数据。
21. 在 FACS 软件中，使用未污染的单元格进行负值设置，对鼠标珠进行补偿。使用无污染的单元格进行正面设置。此外，使用 FMO 控制浇注策略，其中 FMO-CD41 用于 MPA 面板，FMO-CD62P 在 PA 面板中使用，FMO-CD162 用于 LI 面板。
22. 获取近 0.5 x 10⁶ - 0.25 x 10⁶ 事件每个管为 FACS.使用分析软件保存数据并进行分析（版本 9.9.6）。

所有提交的数据，除了FACS图，都用统计软件进行分析。使用流式细胞学软件对FACS绘图进行了分析。

对整个血细胞计数的分析没有显示所有测试条件之间的红细胞有任何显著差异（图2）。但是，乳胶组的血小板和白细胞急剧减少，表明乳胶的生物相容性很差。乳胶组自由血红蛋白水平增加进一步强调了这一点，表明除乳胶组外，其他血管装置或条件均无导致大量血解（图2）。此外，涂层PVC管、聚PVC和 HepPVC，以及测试的支架，没有通过血小板和白细胞损失导致血栓形成，而乳胶表现出最高的血小板和白细胞损失，其次是未涂覆的PVC管，显示出下降趋势。

虽然所有测试的血管设备都导致凝血系统 （FPA） 和补剂组件 （sC5b-9） 的激活率增加，但与聚PVC回路相比，HeppPVC回路呈现出 FPA 和 sC5b-9 水平下降的趋势（图 3）。有趣的是，与聚PVC相比，未涂覆的PVC和Gap循环显示的FPA水平较低，但没有达到统计显著性水平。然而，与基线和静态条件相比，乳胶环的FPA水平显著增加。

根据整个血细胞计数，乳胶环表现出最高水平的TNF，IL-6和PMN弹性酶（图4），达到统计显著性水平相比，其他组在TNF和IL-6（图4A，B），而静态和基线条件在PMN弹性酶（图4C）。这些结果表明乳胶对白细胞有有效的激活。激活标记的基线水平始终与静态条件相媲美，表明血液的肝素化。

有趣的是，随着凝血系统（FPA）和白细胞（PMN弹性酶）的适度激活，间隙诱导回路的血小板和白细胞计数仅略有减少，但不适当的环闭合与由此产生的流动湍流和血液接触到未涂覆的粗糙切割表面导致拼接的宏观可见血块（图1F）。块块及其分布整个拼接表面明显与+CT和SEM图像，而没有发现血块时，循环关闭与外部关闭装置之间没有留下循环结束之间的间隙（图5）。

图6A、B所示，对沾有血小板特异性标记、CD41和血小板活化标记的宿主血细胞进行细胞计量分析。在这里，乳胶管在血小板上表现出极高的中值荧光强度（MFI），其次是支架，而肝素涂层聚PVC管表现出最小的活化血小板，描绘了多PVC管的抗血栓特性。此外，白细胞根据CD45和SSC（侧散射）的粒度分类为（i） 粒细胞;（ii） 单细胞和（iii）淋巴细胞（图7），在已知与血小板24上的CD62P相互作用的每个白细胞亚细胞上检测到CD162+内黄蛋白的表达。人们注意到，乳胶循环中的粒细胞和淋巴细胞的内黄蛋白表达急剧减少。这一结果与乳胶环中白细胞总频率降低水平一样（图2）。一般来说，单核细胞中的整蛋白水平高于粒细胞和淋巴细胞，表明单细胞与活性血小板相互作用的可能性。在这方面，还通过用CD14（作为单细胞标记物）和CD41（作为血小板标记）染色血细胞，并最终识别双阳性细胞，即CD14+CD41=MPA（图8）来评价单细胞血小板聚集体。在这里，我们注意到支架组在MPA上表现出最高水平的CD41表达，其次是乳胶组，表明尽管单细胞频率降低（<1%）， 形成MPA的趋势增加在乳胶循环。

图1:体外血流动力学循环模型概述及其修改。（A） 用于外部环路闭合系统的间隙实验，在接头上不留下间隙。（B） 循环由聚PVC涂层PVC管和支架内（箭头）。（C） 由乳胶管做的循环。（D） 间隙实验的环路，无需外部环路闭合系统，在管端（箭头）之间留下间隙。（E） 循环放置在水浴内的循环摇篮中，充满鲜血。（F） 旋转后在接头（箭头）上产生间隙。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:血细胞计数和血浆血红蛋白的结果。（A） 红细胞计数.（B） 血小板计数。（F） 白细胞计数.（D） 自由血浆血红蛋白。结果表明乳胶的生物相容性差，导致过度血解。数据以平均值表示;错误栏指示 SEM. n=1。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:凝固和补剂系统激活结果。（A） 凝固系统激活，用纤维蛋白肽A（FPA）（B）水平测量，补充系统激活，用sC5b-9水平测量。虽然乳胶管引起FPA水平的显著升高，但所有测试材料的补性活化都很强。数据以均值表示，误差条指示 SEM. *p<0.05，n=1。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:白细胞激活标记。（A） 肿瘤坏死因子α（TNF）。（B） 白细胞素6 （IL-6） （C） PMN弹性酶。 结果表明，由于分析标记物水平升高，白细胞的激活率增加，其次是支架回路，这只能导致PMN弹性酶水平升高，而不是TNF或IL-6。数据以均值表示，误差条表示 SEM. *p<0.5;**p<0.01， n=1. 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:循环拼接的成像。（A） μ（间隙）的环路的一个计算机断层扫描 （μCT）。红色区域表示血栓材料。（B） 管的发光侧的渲染。矩形选择表示扫描电子显微镜 （SEM） （C）的区域。（D） 带外部环路闭合装置的环路的 CT，在拼接时没有间隙，以及 （ E） 渲染和查看灯具表面。未发现血栓材料。（F） 矩形选择的 SEM 图像 （E）。在切割表面上未发现血栓材料。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:用于血小板激活 （CD62P） 的 FACS 图。（A） 代表 FACS 图（基本状况）显示血液 CD41+ 血 小板。（B） 显示血小板激活状态的图形，与静态RT和基线条件相比，不同类型血管装置的荧光强度（MFI）反映了血小板激活状态。数据栏显示来自单个测量的数据。 请单击此处查看此图的较大版本。

图7:白细胞内黄蛋白（CD162）的FACS图。（A） 代表 FACS 图（基本条件）显示血液 CD45+ 白细胞和亚群 （B） 图显示白细胞 CD162+ 内特格林平均荧光强度 （MFI） 不同类型的血管设备与静态和基线条件进行比较。数据栏显示来自单个测量的数据。 请单击此处查看此图的较大版本。

图8:血小板单细胞聚合的FACS图（CD41/CD14）。（A） 代表性 FACS 图（基本条件）显示血液单细胞 （CD45+/CD14+ ）、血小板 （CD41+） 和单核细胞血小板聚合体 （CD41+/CD14+） （ B ）显示与静态和基线条件相比，单细胞小板聚合的 CD41= 平均荧光强度 （MFI） 。数据栏显示来自单个测量的数据。 请单击此处查看此图的较大版本。

资助者[ebo kunze工业设计，Im Dentel 17，72639 Neuffen，德国]以消耗品和出版费的形式向本手稿的作者[Max Wacker]提供了财政支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿编写方面没有任何额外作用。