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异种移植模型血液中循环猪特异性DNA的定量分析

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DOI：

10.3791/61579

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2020年9月22日

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1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在本实验方案中，设计了猪特异性引物，构建了含有猪特异性DNA片段的质粒，并建立了用于定量的标准曲线。利用物种特异性引物，通过qPCR在猪-小鼠细胞移植模型和猪-猴动脉补片移植模型中对cpsDNA进行了定量检测。

摘要

异种移植是治疗器官衰竭的一种可行方法。然而，如何有效监测异种移植后的免疫排斥反应，仍是临床医生和研究人员面临的问题。本文描述了一种简单且有效的方法，用于监测猪-小鼠细胞移植模型以及猪-猴动脉补片移植模型中的免疫排斥反应。循环DNA是一种潜在的非侵入性器官损伤生物标志物。在本研究中，通过实时定量PCR（qPCR）技术监测异种移植物排斥过程中循环的猪特异性DNA（cpsDNA）。在该实验方案中，设计了猪特异性引物，构建了包含猪特异性DNA片段的质粒，并建立了用于定量的标准曲线。随后，利用物种特异性引物通过qPCR在猪-小鼠细胞移植模型和猪-猴动脉补片移植模型中定量cpsDNA。该方法的价值在于，其可作为一种简单、便捷、低成本且侵入性较小的方法，用于监测异种移植的免疫排斥反应。

引言

器官衰竭是导致死亡的主要原因之一1。细胞、组织和器官移植是治疗器官衰竭的有效方法2。然而，供体器官的短缺限制了该方法的临床应用3,4。研究表明，猪可作为临床移植中人类器官的潜在来源5,6。然而，异种器官移植面临严重的免疫排斥风险。因此，对异种移植后的免疫排斥反应进行监测至关重要。目前，临床上对免疫排斥的监测主要依赖患者的体征和症状，以及实验室检查（如活检、免疫生化分析和超声检查）7,8,9。然而，这些监测方法存在诸多缺点：患者出现免疫排斥的体征和症状通常较晚10，不利于早期发现和早期干预；活检具有侵入性11，患者不易接受；免疫生化分析缺乏足够的敏感性或特异性，而超声检查则仅为辅助手段且费用较高。因此，迫切需要寻找一种有效且便捷的方法来监测免疫排斥反应。

循环DNA是一种存在于血液中的细胞外DNA。Mandel和Metais12于1948年首次报道了在外周血中存在循环DNA。在正常生理条件下，健康人血液中的循环DNA基础水平相对较低。然而，在某些病理状态下，例如肿瘤、心肌梗死、自身免疫性疾病和移植排斥反应，由于细胞凋亡和坏死导致循环DNA大量释放，血液中循环DNA的水平可显著升高13,14。循环DNA的来源与凋亡和坏死有关15，而这些过程是异种移植排斥反应的特征16。

循环DNA已被证实为一种用于癌症检测的微创生物标志物17,18,19。对供体来源的循环DNA进行高通量测序，可用于器官移植后排斥反应的可靠检测20,21。然而，该方法需要提取高浓度和高质量的DNA。除高昂的成本和耗时外，DNA的需求也限制了该方法在临床常规应用中的可行性。通过定量实时PCR（qPCR）可精确量化供体来源的循环DNA，该方法具有高度的特异性和灵敏性。因此，利用qPCR定量猪源循环DNA是监测异种移植免疫排斥反应的一种可行方法。该方法侵入性小、灵敏度高、特异性强、成本低且节省时间。猪与人类在遗传上属于不同物种，基因组序列差异显著（图1）。因此，在异种移植后，由于异种排斥反应，猪的循环DNA可释放进入受体血液中。通过受体血液中物种特异性引物的qPCR，可对猪源循环DNA（cpsDNA）进行精确定量。此前，我们已证实了cpsDNA作为异种移植生物标志物的理论依据和可行性22,23。本文中，我们将进一步披露更多实验技巧与细节。本实验包括以下步骤：首先，设计猪特异性引物，并提取基因组DNA，用于通过常规PCR验证引物的特异性；其次，构建cpsDNA的标准曲线，并从样本血液中分离cpsDNA；最后，利用 qPCR对循环中的猪特异性DNA进行定量。

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方案

所有实验均严格遵守深圳大学第一附属医院深圳市第二人民医院机构审查委员会的相关指南和规定。

1. 设计猪特异性引物

  1. 使用 NCBI 软件进行全基因组 BLAST 分析，以鉴定与人类、猴或小鼠不同的猪特异性基因 (www.ncbi.nlm.nih.gov)
  2. 根据19个猪特异性基因设计引物（表1) 使用 Primer 5 软件

2. 提取基因组DNA

注意：使用商用基因组DNA提取试剂盒（材料表）提取基因组DNA（包括猪、猴、志愿者人类、移植猪组织的猴以及含猪源细胞的小鼠的血液样本）。

  1. 分别将上述样品的500 µL全血加入不同的微量离心管中。
  2. 向上述微量离心管中加入20 µL蛋白酶K和500 µL裂解缓冲液 ，然后充分振荡混匀。
  3. 将这些微量离心管置于56 °C水浴中10分钟，并在此过程中振荡2-3次，直至溶液变澄清。
  4. 短暂离心，以去除管盖内壁上的液滴。加入500 µL无水乙醇，充分振荡。
  5. 将混合液转移至吸附柱中，在12,000 rpm（约13,400 × g）条件下离心2分钟。
  6. 向每个吸附柱中加入800 µL洗涤液，在12,000 rpm（ 约13,400 × g）条件下离心1分钟。将吸附柱在室温下放置数分钟，以干燥残留的洗涤液。
    注意：洗涤液由制造商提供。
  7. 将吸附柱转移至另一干净的离心管中，向吸附膜中央加入50 µL洗脱缓冲液，在室温下静置2-5分钟。在6,200 × g条件下离心1分钟，随后在12,000 rpm（约13,400 × g）条件下再次离心1分钟。
    注意：洗脱缓冲液由制造商提供，但也可使用含有10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和0.1 mM EDTA的TE缓冲液进行DNA洗脱。
  8. 将DNA溶液于-20 °C保存。

3. 验证引物的特异性

注意：上述19对引物的物种特异性已通过PCR确认，PCR使用了聚合酶（材料表）以及表1中列出的引物进行。

  1. 配制预混溶液：将 12.5 µL 的 2x PCR 预混液 （材料表）、1 µL 的 5' 引物（10 µM）、1 µL 的 3' 引物（10 µM）以及 8.5 µL 的 ddH2O 混合。配制时需额外增加 2 个样本的量。
  2. 将 23 µL 预混溶液分装至 0.2 mL 微量离心管中，每管加入 2 µL 基因组 DNA，并小心盖紧管盖。随后轻轻混匀并短暂离心。
  3. 将 0.2 mL 微量离心管放入 PCR 仪中，进行以下程序：变性：95 °C 持续 5 秒；退火：60 °C 持续 30 秒；延伸：72 °C 持续 30 秒。
  4. 按以下步骤进行琼脂糖凝胶电泳：
    1. 称取 1.2 g 琼脂糖加入含有 100 mL 1x TAE 缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热煮沸 5 分钟。待溶液冷却至约 70 °C 后，加入 5 µL 核酸染料（材料表）。沿培养板边缘缓慢倒入溶液，并在室温下静置至凝胶完全凝固。
    2. 将 5 µL 样品与 2-Log DNA Ladder（0.1–10.0 kb）或 Marker I（0.1–0.6 kb）分别加入琼脂糖凝胶加样孔中，上述样品均包含 1 µL 的 6x DNA 上样缓冲液。然后在 120 mA 条件下电泳，直至条带充分分离。
    3. 使用紫外成像仪观察含有 DNA 片段的琼脂糖凝胶。
  5. 对上述样品进行琼脂糖凝胶电泳，以分离扩增的 DNA 片段，并通过紫外成像仪进行观察。利用 PCR 方法，首先鉴定了特异性扩增猪基因组 DNA 的引物（图 2A）。进一步验证了这些引物在猴/人基因组 DNA 混合样本或小鼠基因组 DNA 混合样本中对猪 DNA 的特异性扩增能力（图 2B）。最终，两种具有物种特异性的引物分别在猪-猴动脉补片模型和/或猪-鼠细胞移植模型中被证实可特异性扩增猪源 DNA（图 2C）。

4. cpsDNA 的标准曲线

  1. 将含有猪源DNA片段的pMD19-T质粒转化至DH5α中，该质粒可由引物#4或引物#11（表1）特异性扩增。使用50 µg/mL氨苄青霉素筛选阳性菌落。
    人/猴队列中的引物#4（正向：5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′，反向：5′-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3′）
    小鼠模型用引物#11（正向：5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′，反向：5′-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTC T-3′）
    注：所有引物的详细信息见表1。
  2. 按照以下步骤提取上述质粒。
    1. 从新鲜划线的选择性平板上挑取单菌落，接种于1–5 mL含有适当选择性抗生素的LB培养基中。在37 °C、剧烈振荡（300 rpm）条件下培养12–16小时。
    2. 室温下以10,000 × g离心1分钟。弃去上清液。
    3. 加入250 µL溶液I/RNase A。通过涡旋或反复吹打充分混匀。细胞沉淀的完全重悬对于获得高产量至关重要。
      注：使用前必须将RNase A加入溶液I中。
    4. 将悬浮液转移至新的1.5 mL微量离心管中。加入250 µL溶液II。反复倒置并轻轻旋转数次，直至获得澄清裂解液。可能需要孵育2–3分钟。
      注：避免剧烈混合，以免剪切染色体DNA并降低质粒纯度。裂解反应时间不得超过5分钟。
    5. 加入350 µL溶液III。立即反复倒置数次，直至形成絮状白色沉淀。
      注：加入溶液III后必须立即并充分混匀，以避免局部沉淀。
    6. 以最大速度（≥13,000 × g）离心10分钟，形成致密的白色沉淀。立即进行下一步操作。
    7. 将DNA小量纯化柱插入2 mL收集管中。
    8. 小心吸取步骤4.2.7中的澄清上清液，转移至DNA小量纯化柱中。注意不要扰动沉淀，避免细胞碎片进入纯化柱。
    9. 以最大速度离心1分钟。弃去滤液，收集管可重复使用。
    10. 加入500 µL HBC缓冲液。以最大速度离心1分钟。弃去滤液，收集管可重复使用。
      注：使用前HBC缓冲液必须用100%异丙醇稀释。
    11. 加入700 µL DNA洗涤缓冲液。以最大速度离心1分钟。弃去滤液，收集管可重复使用。
      注：使用前DNA洗涤缓冲液必须用100%乙醇稀释。
      1. 可选：重复一次DNA洗涤缓冲液洗涤步骤。
    12. 将空的DNA小量纯化柱以最大速度离心2分钟，以干燥柱基质。
      注：在洗脱前充分干燥DNA小量纯化柱基质非常重要。残留的乙醇可能干扰下游实验。
    13. 将DNA小量纯化柱转移至洁净的1.5 mL微量离心管中。
    14. 直接向柱膜中心加入30–100 µL洗脱缓冲液或无菌去离子水。
      注：DNA从小量纯化柱上的洗脱效率依赖于pH值。若使用无菌去离子水，应确保其pH值约为8.5。
    15. 室温静置1分钟。
    16. 以最大速度离心1分钟。
      注：此步骤可回收约70%结合的DNA。可进行第二次洗脱以获得残留DNA，但浓度较低。
  3. 使用EcoR I（15 U/µL）和Bam H1（15 U/µL）双酶切验证上述质粒22。
    1. 在冰上配制反应体系：加入1 µL EcoR I（15 U）、1 µL Bam H1（15 U）、2 µL 10×缓冲液、1 µg质粒DNA，ddH2O补足至20 µL总体积，充分混匀。在37 °C水浴中孵育2小时。
    2. 通过1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，并如前所述在紫外光下观察。
  4. 用ddH2O将浓缩质粒稀释为起始标准品溶液（2 × 1011 拷贝/mL）。以含有猪源DNA片段的质粒（P2）为例，计算拷贝数：
    1. 计算1 mL起始标准品溶液中的质粒数量：N = (2 × 1011) / (6.02 × 1023) mol。
    2. 计算P2的分子量：M = 2810 bp × 650 D/bp = 2810 × 650 D（g/mol）。
    3. 计算P2的质量：m = N × M = (2 × 1011) / (6.02 × 1023) mol × 2810 × 650 g/mol。
    4. 计算P2的体积：V = m/C = [(2 × 1011)/(6.02 × 1023) × 2810 × 650] g/C。 （C为P2的浓度（ng/µL），通过分光光度计测定）。
  5. 用ddH2O将起始标准品溶液进行10倍系列稀释，得到2 × 1010 拷贝/mL、2 × 109 拷贝/mL、2 × 108 拷贝/mL、2 × 107 拷贝/mL…直至2 × 100 拷贝/mL的标准品溶液。稀释过程中需充分涡旋混匀。
  6. 建立标准曲线。
    1. 配制qPCR反应体系（所有步骤避光操作）：将含有325 µL qPCR Mix（材料表）、13 µL 5′引物、13 µL 3′引物和169 µL ddH2O的预混液加入1.5 mL微量离心管中，充分混匀后短暂离心。
    2. 将上述40 µL预混液分装至8联管中，每管加入10 µL不同浓度的标准DNA。小心封盖，混匀后短暂离心。
    3. 将8联管放入qPCR仪中，按照图3所示程序运行。

5. 从血液样本中分离循环DNA

  1. 使用含EDTA的试管，在猪-猴动脉补片模型和猪-鼠细胞移植模型中于不同时间点采集血液样本。
  2. 采集约400 µL（来自猪-猴动脉补片模型）或100 µL（来自猪-鼠细胞移植模型）的血液样本，转移至1.5 mL微量离心管中。在低温、高速条件下离心（3,000 × g，4 °C，5 min），去除血液样本中的血细胞。
  3. 将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，并在16,000 × g 条件下离心10 min，以去除细胞碎片。
  4. 将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。使用商品化的血清/游离DNA提取试剂盒，按照基因组DNA提取厂商说明书中的方案2，从上述上清液中提取循环DNA。
  5. 将提取的循环DNA浓缩至40 µL，并于-20 °C保存。

6. 循环猪特异性DNA的定量

  1. 配制预混液：25 µL qPCR Mix（材料表）、1 µL 5' 引物、1 µL 3' 引物、10 µL 样品 DNA 和 13 µL ddH2O。配制时应多准备两个样本的用量。
  2. 将40 µL预混液分装至8联管中，每管加入10 µL样品DNA，随后小心盖紧管盖。反应体系数量应比实际需要多准备两个。
  3. 将8联管放入qPCR仪中，操作步骤与标准曲线相同。建议先运行一次标准品反应，以确保反应条件适合定量分析。qPCR反应体系的操作流程见图3。

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结果

在本实验方案中，设计了猪特异性引物，构建了含有猪特异性DNA片段的质粒，并建立了用于定量的标准曲线（图4）。通过PCR验证了19对引物的物种特异性。随后，使用物种特异性引物（引物#4和引物#11）在猪-小鼠细胞移植模型和猪-猴动脉补片移植模型中通过qPCR定量cpsDNA。

采用琼脂糖凝胶电泳从上述样本中分离扩增的DNA片段，并在紫外成像仪中进行可视化。通过PCR，首先鉴定了特异性扩增猪基因组DNA的引物（图2A）。进一步证实了这些引物在猴/人基因组DNA样本群或小鼠基因组DNA样本群中具有特异性扩增猪DNA的种属特异性（图2B）。最后，两种具有种属特异性的引物分别在猪-猴动脉补片模型和/或猪-小鼠细胞移植模型中被进一步证明可特异性扩增猪DNA（图2C）。

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讨论

定量检测猪源性循环DNA是监测异种移植免疫排斥反应的一种可行方法。Gadi等人24发现，发生急性排斥反应患者的血液中供体来源的循环DNA（ddcfDNA）含量显著高于无排斥反应患者。这些研究表明，ddcfDNA可能是监测器官移植物损伤的通用生物标志物。近年来，由于qPCR操作简便、自动化程度高、灵敏度高、特异性好且成本低，其在核酸检测分析中的应用日益广泛。

在本研究中，根据生物信息学分析结果设计了猪特异性引物，并通过常规PCR验证其特异性。利用qPCR可精确量化猪-猴动脉补片模型和猪-鼠细胞移植模型血液样本中的cpsDNA。 使用物种特异性引物。该方法的主要优势如下：首先，基于高度特异性的引物，该DNA定量方法具有高灵敏度和高特异性；此外，该方法的操作流程非常简便，包括特异性引物设计、DNA提取和qPCR。 一体化分析 工作日，节省时间。该方法为非侵入性 起始于少量血清或血浆样本。同时，我们已证明该方法具有高度可重复性22与高通量测序和飞行时间质谱...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了国家重点研发计划项目资助&中国国家重点研发计划（2017YFC1103704）、深圳市科技创新委员会基础研究项目（JCYJ20170817172116272）、广东省高水平医院建设专项资金（2019）、深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201412020）、深圳市高水平医学学科建设基金（2016031638）、深圳市卫生和计划生育委员会科研项目（SZXJ2017021，SZXJ2018059）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Biowest，巴塞罗那，西班牙111860
BamHI-HF美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室公司R3136S
1.5 mL 微量离心管Axygen 美国加利福尼亚州联合市生物科学公司MCT-150-C
0.2 mL PCR管Axygen 美国加利福尼亚州联合市生物科学公司PCR-02-C
C57BL/6 小鼠中国广东省医学实验动物中心  中国8~10 周
离心赛默飞世尔科技 Fisher 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆科学公司Micro 21R
2-Log DNA Ladder美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室公司N3200S0.1–10.0 kb
标记物 I 天根，北京，中国MD101-020.1–0.6 kb
DNA小柱（HiBind DNA Mini Columns）Omega Bio-tek，美国佐治亚州诺克罗斯DNACOL-01
DNA上样缓冲液Solarbio，北京，中国D1010
E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 I 和 E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 IIOmega Bio-tek，美国佐治亚州诺克罗斯D6942
D6943
EcoR ITakara 日本滋贺生物 1040S
中国台湾巴马小型母猪中国深圳华大基因 Ark 生物技术有限公司2～4个月
基因组DNA提取试剂盒天根，北京，中国DP304-02
SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液日本大阪，ToyoboQPK-201
凝胶成像系统 XRBio-Rad，Hercules，美国
雄性食蟹猴中国广州，广东兰道生物科技8年
核酸染料（Gelred）Biotium，弗里蒙特，美国42003
聚合酶（Premix Taq）Takara 日本滋贺县，BioRR901A
pMD19-T 质粒Takara 日本，滋贺，BioD102A
qPCR仪Applied Biosystems QSDx，美国沃尔瑟姆
血清/游离DNA提取试剂盒天根，北京，中国DP339
TAE生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海B548101

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DNA qPCR DNA

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