在本实验方案中，设计了猪特异性引物，构建了含有猪特异性DNA片段的质粒，并建立了用于定量的标准曲线。利用物种特异性引物，通过qPCR在猪-小鼠细胞移植模型和猪-猴动脉补片移植模型中对cpsDNA进行了定量检测。
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本文内容
摘要
摘要
异种移植是治疗器官衰竭的一种可行方法。然而，如何有效监测异种移植后的免疫排斥反应，仍是临床医生和研究人员面临的问题。本文描述了一种简单且有效的方法，用于监测猪-小鼠细胞移植模型以及猪-猴动脉补片移植模型中的免疫排斥反应。循环DNA是一种潜在的非侵入性器官损伤生物标志物。在本研究中，通过实时定量PCR（qPCR）技术监测异种移植物排斥过程中循环的猪特异性DNA（cpsDNA）。在该实验方案中，设计了猪特异性引物，构建了包含猪特异性DNA片段的质粒，并建立了用于定量的标准曲线。随后，利用物种特异性引物通过qPCR在猪-小鼠细胞移植模型和猪-猴动脉补片移植模型中定量cpsDNA。该方法的价值在于，其可作为一种简单、便捷、低成本且侵入性较小的方法，用于监测异种移植的免疫排斥反应。
引言
器官衰竭是导致死亡的主要原因之一1。细胞、组织和器官移植是治疗器官衰竭的有效方法2。然而，供体器官的短缺限制了该方法的临床应用3,4。研究表明，猪可作为临床移植中人类器官的潜在来源5,6。然而，异种器官移植面临严重的免疫排斥风险。因此，对异种移植后的免疫排斥反应进行监测至关重要。目前，临床上对免疫排斥的监测主要依赖患者的体征和症状，以及实验室检查（如活检、免疫生化分析和超声检查）7,8,9。然而，这些监测方法存在诸多缺点：患者出现免疫排斥的体征和症状通常较晚10，不利于早期发现和早期干预；活检具有侵入性11，患者不易接受；免疫生化分析缺乏足够的敏感性或特异性，而超声检查则仅为辅助手段且费用较高。因此，迫切需要寻找一种有效且便捷的方法来监测免疫排斥反应。
循环DNA是一种存....
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方案
所有实验均严格遵守深圳大学第一附属医院深圳市第二人民医院机构审查委员会的相关指南和规定。
1. 设计猪特异性引物
- 使用 NCBI 软件进行全基因组 BLAST 分析，以鉴定与人类、猴或小鼠不同的猪特异性基因 (www.ncbi.nlm.nih.gov)
- 根据19个猪特异性基因设计引物（表1) 使用 Primer 5 软件
2. 提取基因组DNA
注意：使用商用基因组DNA提取试剂盒（材料表）提取基因组DNA（包括猪、猴、志愿者人类、移植猪组织的猴以及含猪源细胞的小鼠的血液样本）。
- 分别将上述样品的500 µL全血加入不同的微量离心管中。
- 向上述微量离心管中加入20 µL蛋白酶K和500 µL裂解缓冲液 ，然后充分振荡混匀。
- 将这些微量离心管置于56 °C水浴中10分钟，并在此过程中振荡2-3次，直至溶液变澄清。
- 短暂离心，以去除管盖内壁上的液滴。加入500 µL无水乙醇，充分振荡。
- 将混合液转移至吸附柱中，在12,000 rpm（约13,400 × g）条件下离心2分钟。
- ....
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结果
在本实验方案中，设计了猪特异性引物，构建了含有猪特异性DNA片段的质粒，并建立了用于定量的标准曲线（图4）。通过PCR验证了19对引物的物种特异性。随后使用物种特异性引物（引物#4和引物#11）在猪-小鼠细胞移植模型及猪-猴动脉补片移植模型中通过qPCR对猪源性细胞DNA（cpsDNA）进行定量。
采用琼脂糖凝胶电泳从上述样品中分离扩增的DNA片段，并在紫外成像仪中进行观察。通过PCR首先鉴定了特异性扩增猪基因组DNA的引物（图2A）。进一步证实了这些引物在猴/人基因组DNA混合样本或小鼠基因组DNA混合样本中具有物种特异性，能够特异性扩增猪的DNA（图2B）。最后，进一步证明了两种具有物种特异性的引物分别可在猪-猴动脉补片模型和/或猪-小鼠细胞移植模型中特异性扩增猪的DNA（图2C）。
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讨论
定量检测猪源性循环DNA是监测异种移植免疫排斥反应的一种可行方法。Gadi等人24发现，发生急性排斥反应患者的血液中供体来源的循环DNA（ddcfDNA）含量显著高于无排斥反应患者。这些研究表明，ddcfDNA可能是监测器官移植物损伤的通用生物标志物。近年来，由于qPCR操作简便、自动化程度高、灵敏度高、特异性好且成本低，其在核酸检测分析中的应用日益广泛。
在本研究中，根据生物信息学分析结果设计了猪特异性引物，并通过常规PCR验证其特异性。利用qPCR可精确量化猪-猴动脉补片模型和猪-鼠细胞移植模型血液样本中的cpsDNA。 使用物种特异性引物。该方法的主要优势如下：首先，基于高度特异性的引物，该DNA定量方法具有高灵敏度和高特异性；此外，该方法的操作流程非常简便，包括特异性引物设计、DNA提取和qPCR。 一体化分析 工作日，节省时间。该方法为非侵入性 起始于少量血清或血浆样本。同时，我们已证明该方法具有高度可重复性22与高通量测序和飞行时间质谱.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了国家重点研发计划项目资助&中国国家重点研发计划（2017YFC1103704）、深圳市科技创新委员会基础研究项目（JCYJ20170817172116272）、广东省高水平医院建设专项资金（2019）、深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201412020）、深圳市高水平医学学科建设基金（2016031638）、深圳市卫生和计划生育委员会科研项目（SZXJ2017021，SZXJ2018059）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Biowest，巴塞罗那，西班牙 | 111860 | |
| BamHI-HF | 美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室公司 | R3136S | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen 美国加利福尼亚州联合市生物科学公司 | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR管 | Axygen 美国加利福尼亚州联合市生物科学公司 | PCR-02-C | |
| C57BL/6 小鼠 | 中国广东省医学实验动物中心 中国 | 8~10 周 | |
| 离心 | 赛默飞世尔科技 Fisher 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆科学公司 | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | 美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室公司 | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| 标记物 I | 天根，北京，中国 | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA小柱（HiBind DNA Mini Columns） | Omega Bio-tek，美国佐治亚州诺克罗斯 | DNACOL-01 | |
| DNA上样缓冲液 | Solarbio，北京，中国 | D1010 | |
| E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 I 和 E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 II | Omega Bio-tek，美国佐治亚州诺克罗斯 | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara 日本滋贺生物 | 1040S | |
| 中国台湾巴马小型母猪 | 中国深圳华大基因 Ark 生物技术有限公司 | 2～4个月 | |
| 基因组DNA提取试剂盒 | 天根，北京，中国 | DP304-02 | |
| SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液 | 日本大阪，Toyobo | QPK-201 | |
| 凝胶成像系统 XR | Bio-Rad，Hercules，美国 | ||
| 雄性食蟹猴 | 中国广州，广东兰道生物科技 | 8年 | |
| 核酸染料（Gelred） | Biotium，弗里蒙特，美国 | 42003 | |
| 聚合酶（Premix Taq） | Takara 日本滋贺县，Bio | RR901A | |
| pMD19-T 质粒 | Takara 日本，滋贺，Bio | D102A | |
| qPCR仪 | Applied Biosystems QSDx，美国沃尔瑟姆 | ||
| 血清/游离DNA提取试剂盒 | 天根，北京，中国 | DP339 | |
| TAE | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海 | B548101 |
参考文献
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2....
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