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方法文章

硅纳米线与光刺激用于细胞内及细胞间电耦合的研究

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DOI：

10.3791/61581

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2021年1月28日

 ,  ,  , 
1The James Franck Institute, The University of Chicago, 2Department of Chemistry, The University of Chicago, 3The Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种利用硅纳米线对细胞进行细胞内光学生物调控的简单且易于操作的方法。该技术具有高度的适应性，可适用于多种细胞类型，并可用于体外以及体内应用。

摘要

肌成纤维细胞能够自发地内化硅纳米线（SiNWs），使其成为生物电子应用的理想靶标。这些细胞-硅杂合体无需电极即可实现光学调控，并且对细胞正常行为的干扰极小。其光学性能来源于硅纳米线的光热和光电特性。这些杂合体可通过标准的组织培养技术获取，并进一步应用于多种生物学场景。本文展示了如何利用这些杂合体研究心肌细胞间的电耦合，并比较肌成纤维细胞之间以及肌成纤维细胞与心肌细胞之间的耦合情况。该过程仅需配备耦合激光光源的荧光显微镜，无需其他特殊设备。同时，本文还展示了使用自行编写的MATLAB程序，对培养物中不同细胞内部及细胞间的钙信号传播进行定量分析。结果显示，肌成纤维细胞的电响应速度较心肌细胞更慢。此外，肌成纤维细胞的细胞间信号传播速度略慢于其细胞内传播速度，但两者相近，提示信号可能通过缝隙连接或纳米管进行被动传播。该技术具有高度可适性，可轻松拓展至其他细胞体系，适用于体外以及体内或离体研究。

引言

所有生物体都利用电（以离子形式存在）来调控细胞行为。细胞膜含有多种特异性离子通道，允许离子进行被动和主动运输。这些离子调控可兴奋细胞的功能，例如神经元活动以及骨骼肌和心肌的收缩性。然而，生物电在非兴奋性细胞中也发挥着重要作用，调控多种细胞功能，如细胞增殖1、神经免疫2,3,4以及干细胞分化5。

近几十年来，生物电学领域受到越来越多的关注，推动了多种生物电子界面技术的发展。微电极膜片移液管是细胞内记录和刺激的金标准6。该方法中，玻璃移液管在特定条件下被拉制，形成尖端孔径为几微米的锐利结构。移液管内填充缓冲液，使其能够与细胞内液直接接触，从而构建出具有极高信噪比、对细胞电活动实现精确控制以及极高时间分辨率的生物电界面。尽管该技术是一种极为强大的工具，且最近已被微型化为纳米移液管构型7，但仍存在若干重要的技术局限性。细胞质稀释效应8以及机械振动限制了其仅适用于短期检测，同时该方法需要昂贵的专业设备和较高的操作技术。此外，其体积较大，限制了可同时记录或刺激的细胞数量；并且由于其侵入性，无法在实验过程中进行重构。为克服这些局限，人们开发了微电极阵列，但电极尺寸限制了空间分辨率以及进入细胞内的能力。纳米电极阵列虽可实现细胞内记录与刺激，但需通过损伤性的电穿孔方式进入细胞质9,10。此外，所有这些方法均依赖基底，因此仅限于体外细胞培养或体表浅层细胞，无法触及三维（3D）组织内部的细胞。

光遗传学11被广泛用于解决这些三维和体内研究的局限性。然而，光遗传学方法依赖于光激活的质膜离子通道，这些通道分布在质膜上，从而限制了三维空间分辨率12以及对细胞内过程的操控能力。

我们最近的研究表明，硅纳米线（SiNWs）可用于对多种非兴奋性细胞（即心肌成纤维细胞和少突胶质细胞）进行亚微米空间分辨率的细胞内生物电检测13。此外，我们还利用这些硅纳米线在三维心脏组织中进行离体的细胞特异性检测，以研究心脏细胞在体内的电耦合机制14。该方法的主要优势在于其简便性：无需任何基因改造或复杂的仪器设备。许多细胞可自发内化光响应型硅纳米线，无需超声处理或电穿孔15。此外，这些硅纳米线可自发逃逸内体包裹，并与细胞质及细胞内细胞器实现无缝整合13,15。这种细胞与硅纳米线的复合体被称为“细胞-硅杂合体”，既保留了原始细胞的动态性、柔软性和多功能性，又具备硅纳米线的光电特性。杂合化后，可通过标准的组织培养技术收获细胞-硅杂合体，并用于多种应用，如细胞内生物电刺激、体外细胞间生物电耦合研究以及体内细胞特异性检测。由于有效的刺激需要高光功率密度与硅纳米线的共定位，因此可在二维和三维条件下实现高空间分辨率。本实验方案将详细描述该方法及其结果分析方式。重点在于体外的细胞内和细胞间检测，但该方法在体内的应用可直接拓展至多种其他生物学场景。

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方案

为确保符合伦理标准，所有涉及从啮齿类动物心脏分离心肌细胞的动物实验程序，均首先获得芝加哥大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。此外，所有动物实验均严格遵循芝加哥大学 IACUC 的指导原则进行。

1. 细胞-硅纳米线杂化体的制备

  1. 使用商业试剂盒，按照制造商的说明分离原代心肌细胞（CMs）。
  2. 制备用于原代细胞分离的完全DMEM培养基，添加10%热灭活胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺。
  3. 为了从MFs-CMs悬浮液中分离肌成纤维细胞（MFs），将步骤1.1中从两个心脏分离的细胞预接种于组织培养皿上（每100 mm培养皿接种两个心脏来源的细胞），孵育1小时。由于心肌细胞需要纤维连接蛋白或胶原处理的表面才能贴壁，因此只有肌成纤维细胞会贴附在组织培养皿表面。
  4. 吸除富集的心肌细胞悬浮液。这些心肌细胞可用于第3节所述的异细胞耦合实验。用DMEM冲洗肌成纤维细胞培养皿，以去除残留的心肌细胞。
  5. 向肌成纤维细胞中加入新鲜培养基，使其增殖至约80%汇合度（2–4天）。每隔一天更换一次培养基。
  6. 当细胞达到准备状态（80%汇合度）时，准备下一步（步骤1.7）所需的SiNWs。
    注意：本实验可使用多种类型的SiNWs。在本实验中，采用化学气相沉积法（CVD）生长的具有核-壳p-i-n结结构的SiNWs，具体方法如先前文献16所述。在CVD生长过程中，SiNWs在硅晶圆基底上生长，最终以覆盖有SiNWs的硅芯片形式保存。
  7. 使用金刚石刻划笔从带有CVD生长SiNWs的晶圆上切割出一块3 mm × 3 mm的芯片。使用尖头镊子操作晶圆，并尽量减少镊子接触的表面积，以免破坏SiNWs。
  8. 通过用70%乙醇冲洗芯片，并在生物安全超净台内紫外光下干燥30分钟，对芯片进行灭菌处理。
  9. 将芯片转移至无菌微量离心管中，用完全培养基冲洗以去除多余的乙醇。
  10. 加入1 mL培养基，在超声水浴中对芯片进行超声处理1–10分钟。随着SiNWs释放到培养基中，溶液应变得浑浊。
    注意：不同超声仪或不同细胞类型可能需要优化超声时间和功率，较短时间和较低功率可获得更长的SiNWs。
  11. 将SiNWs悬浮液加入5 mL培养基中，接种至含有肌成纤维细胞的100 mm组织培养皿中。让SiNWs内化4小时，然后用培养基清洗5次以去除多余的SiNWs。再孵育1小时，使部分内化的SiNWs完成完全内化，之后即可使用。
    注意：不同类型细胞可能需要不同的SiNWs浓度和/或内化时间。
  12. 通过将胶原原液（3 mg/mL）与无菌20 mM乙酸按1:50比例稀释，制备胶原包被溶液。取0.5 mL包被溶液加入35 mm玻璃底培养皿中，37 °C孵育1小时。移除溶液后，用无菌PBS冲洗培养皿。
  13. 用3 mL胰酶在37 °C处理细胞2分钟，收获细胞-SiNWs杂合体。加入10 mL培养基，通过移液剧烈冲洗以收集杂合体。以200 x g轻柔离心5分钟，避免内部化的SiNWs损伤细胞。去除多余培养基后，用1 mL培养基重悬细胞，并接种至经胶原处理的玻璃底培养皿中。
    注意：这些杂合体可单独接种以研究细胞内或细胞间耦合，也可与心肌细胞共接种，以体外研究异细胞耦合。
  14. 通过在37 °C下用细胞质染料（钙黄绿素-AM，4 µM）和细胞膜染料（膜标记物，2 µM）对细胞染色30分钟，并使用共聚焦显微镜成像，最终验证SiNWs的内化情况。由于SiNWs具有高反射性，可使用反射光而非荧光来观察其位置。

2. 细胞内和细胞间研究用细胞的制备

  1. 按照1.12步骤制备胶原蛋白包被溶液。
  2. 进行细胞内电刺激时，以较低的接种密度培养杂交细胞。使用标准血细胞计数板对1.11节中获得的细胞进行计数，并将50,000个细胞接种于35 mm玻璃底培养皿中的培养基中。进行细胞间研究时，使用较高的细胞密度（每皿500,000个细胞）。研究心肌细胞（CMs）与成肌纤维细胞（MFs）之间的细胞间耦合时，将杂交细胞与 freshly isolated CMs 共同培养。 
  3. 实验前使细胞在培养皿中贴壁过夜。进行细胞间研究时，需在37 °C培养48 h ，以使细胞表达细胞间缝隙连接后再进行实验。
  4. 通过将50 µL DMSO加入50 µg Fluo-4 AM中，制备钙离子敏感性染料储备液（可保存于-20 °C）。将1 µL染料溶于1 mL DMEM中，配制染色工作液。
  5. 吸除细胞培养基，加入1 mL染色工作液。在37 °C孵育20–30分钟，使染料进入细胞内。随后吸除染料溶液，并用无菌PBS洗涤两次。
  6. 最后加入1 mL预热的无酚红DMEM培养基，在37 °C孵育30分钟，使细胞内Fluo-4完成去酯化过程。
  7. 将细胞转移至显微镜下进行成像与刺激实验。

3. 光学成像与刺激

  1. 将加湿的微型培养箱预热至 37 °C，并通入空气-CO2 混合气体（95:5）。
  2. 使用配备准直激光线耦合至光路的显微镜进行钙成像和光刺激。
    注意：由于具备点刺激能力，扫描共聚焦显微镜是最直接的选择。然而，也可通过分光镜将准直激光束耦合到标准荧光显微镜的无限远光路中来实现本操作。任何显微镜物镜的设计均可使穿过它的准直激光在焦平面上聚焦为一个衍射极限大小的激光光斑。激光波长应接近激发光波长，以便被二向色镜反射并透过激发滤光片。
  3. 使用明场显微镜、透射光或反射光观察 SiNWs 并确定刺激位点。随后，在保持刺激点位于 SiNW 预定位置的前提下，将光路重新配置为荧光模式。
  4. 针对每种 SiNW 尺寸和细胞类型，验证最佳刺激功率和脉冲时长，以尽量减少对受刺激细胞的光热损伤。典型的刺激方案如下：首先记录 2–10 秒的胞内钙活动基线；然后对 SiNW 施加一次单脉冲激光刺激，功率为 1–10 mW，持续时间为 1–10 ms（相当于 30–300 kW/mm2），并继续记录刺激后 2–10 秒内的钙波变化。
    注意：针对每种 SiNW 尺寸和细胞类型优化光学功率和脉冲时长至关重要，这是为了最大限度地减少对受刺激细胞的光热损伤。
  5. 如有需要，将记录的光刺激视频转移以进行后续分析。

4. 视频处理

  1. 使用“dF/F”宏可视化 Fluo-4 荧光的变化17 ImageJ 可用18计算每个像素的荧光计数变化，并以静息基线的平均值进行归一化。将输出结果（浮点格式）转换为8位，以供进一步处理。
  2. 使用“dF/F”电影进行进一步处理去除异常值在 ImageJ 中使用选择性中值滤波器。设定参数以移除像素值在 2 像素半径范围内超过中值 10 以上的像素，并将该像素值替换为中值。
  3. 使用 Matlab 计算机视觉工具箱中实现的 Lucas-Kanade 算法计算每帧的光流。该函数的输出为一个矢量场，包含每幅图像中每个点的光流 x 分量和 y 分量（代码可在 补充文件 1).
    注意：细胞内的平均光流， <ν> 对应于细胞内钙流的变化。光学流的差分 Δ<ν> 通过确定信号达到最大值的位置，提供钙信号激活的时间点。此外，Δ的幅度<ν> 的最大值与钙波前在细胞内传播的速率相关。
  4. 根据以下公式计算细胞间钙传递速度。
    vCa2+ = rij / ( tmax,j − t最大值，i ),
    其中 tmax,j 和 t最大值，i 分别是细胞 j 和 i 的激活时间，以及 rij 是细胞质心之间的距离。

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结果

该方法能够直接进入细胞内胞质的能力取决于SiNW自发地被细胞内化。尽管SiNW可自发内化进入多种细胞类型15，但某些细胞（如心肌细胞和神经元）需要对SiNW进行处理以促进其内化19。本方案描述了直径为200–300 nm、长度约为1–3 µm的p-i-n型SiNW在心脏成纤维细胞（MFs）中的内化过程。图1A展示了透射光显微镜下SiNW的形态。使用标准相差光学系统时，融合生长的细胞清晰可见，但SiNW几乎不可见，难以确定其位置。因此，我们采用暗场显微镜观察，该模式下仅能观察到反射光的物体，背景为暗色。然而在此对比模式下，由于细胞本身不具反射性，因而无法看到细胞结构。为了显示SiNW在细胞内的位置，我们将图像叠加，从而清晰显示出SiNW在细胞内围绕细胞核分布的排列方式。尽管SiNW与细胞的共定位现象明显，但仍需验证SiNW确实已进入细胞内部，而非仅附着于质膜表面。为此，我们使用共聚焦显微镜观察（图1B），其中胞质用钙黄绿素-A...

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讨论

本文展示了一种对细胞进行细胞内电刺激的简单方法。在本实验中，我们使用了预先与硅纳米线（SiNWs）杂交的微流控装置（MFs），然后与心肌细胞（CMs）共培养。通常情况下，大多数增殖性细胞倾向于内化硅纳米线，因此该方法可适用于多种其他类型的细胞。此外，尽管本文演示的是细胞的细胞内刺激，但相同原理也可用于实现细胞的细胞外刺激。这可以通过阻断会自发内化硅纳米线的细胞内的内体级联过程15来实现，或者使用本身不内化硅纳米线的细胞。例如，尽管已有研究发现心肌细胞能够内化某些纳米结构20,21，但它们不会自发内化硅纳米线15。 本文所用的硅纳米线是通过化学气相沉积（CVD）装置合成的。有关硅纳米线合成的详细步骤，请参考其他文献中提供的资源16。获得硅纳米线后，其操作和使用过程简便，无需任何标准生物医学实验室中不常见的复杂或昂贵设备。使用常规暗场显微镜即可清晰观察到硅纳米线...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由美国空军科学研究办公室（AFOSR FA9550-18-1-0503）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm 玻璃底培养皿CellvisD35-10-0-N
3i Marianas 旋转盘共聚焦显微镜3i
Calcein-AMInvitrogenC1430
CellMask Orange 细胞膜染料InvitrogenC10045
Ⅰ型胶原蛋白（大鼠尾来源）GibcoA1048301
Deluxe Diamond 刻划笔Ted Pella54468
DMEM 高糖培养基（含丙酮酸，不含谷氨酰胺）Gibco10313039
无水 DMSOInvitrogenD12345
Falcon 标准组织培养皿Falcon08-772E
胎牛血清（经认证，热灭活）Gibco10082147
人纤维连接蛋白（血浆来源）Gibco33016015
Fisherbrand 112xx 系列高级超声波清洗器Fisher ScientificFB11201
Fluo-4, AM（细胞渗透性）InvitrogenF14201
FluoroBrite DMEM 培养基GibcoA1896701
L-谷氨酰胺（200 mM）Gibco25030081
OKO 全环境控制培养室（恒温、恒湿、恒 CO₂）OKO
PBS，pH 7.4Gibco10010023
青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）Gibco15140122
Pierce 原代心肌细胞分离试剂盒Thermo Scientific88281
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红Gibco25200056

参考文献

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