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利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

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DOI：

10.3791/61589

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2021年1月19日

 ,  , 
1Department of Biology, San Francisco State University, 2Department of Biochemistry & Biophysics, UCSF Mission Bay

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用基于平板的高内涵成像系统，对多个果蝇（Drosophila）胚胎在胚胎发育过程中进行显微注射并同时成像的实验方案。

摘要

定量活细胞成像的现代方法已成为探索细胞生物学的重要工具，它使得研究人员能够利用统计学和计算建模对生物过程进行分类和比较。尽管细胞培养模型系统非常适合高内涵成像，但高通量的细胞形态学研究表明，体外培养在重现活体生物体内细胞所具有的形态复杂性方面存在局限。因此，亟需一种可扩展的高通量模型系统，用于在完整生物体内对活细胞进行成像。本文介绍了一种利用高内涵图像分析仪同步获取多个果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎在合胞体囊胚阶段发育过程中的延时视频的实验方案。合胞体囊胚传统上一直是活体成像生物事件的理想模型；然而，为了实现定量和高通量研究，获取足够数量的实验重复一直是一项劳动密集型工作，且受限于每次实验重复只能成像单个胚胎。本文提出的方法对成像和显微注射技术进行了改进，使其适用于高内涵成像系统，或任何具备自动多点采集功能的倒置显微镜。该方法可在一次成像过程中同时获取6至12个胚胎的图像，具体数量取决于所需的采集参数。

引言

在过去的30年中，成像技术以及用于活细胞成像的分子探针的进步极大地加深了我们对细胞复杂性及其内部运作机制的理解。伴随着技术的不断进步，人们越来越依赖体外细胞培养模型来获取高通量成像数据。细胞培养模型具有多种优势，包括可通过微流控系统精确控制微环境，以及能够同时对多个细胞进行成像，从而支持高通量筛选所需的定量分析方法1,2。然而，在形态学研究背景下，细胞培养模型也存在显著的局限性，例如二维的玻璃或塑料培养表面会对细胞形态及其调控产生干扰效应3,4,5。这些效应可能导致在研究调控细胞形态的生物学过程时获得虚假或误导性的数据。

尽管已有在完整生物体背景下研究细胞形态的方法6，但由于难以在整个成像过程中维持整个生物体的存活，以及在大型多细胞生物体内进行成像存在技术挑战，适合用于高通量定量活细胞成像的完整生物体仍然十分有限。因此，针对完整生物体的细胞生物学研究通常局限于对单个生物体进行长时间观察，这极大地限制了样本量。此外，这种一次仅能处理一个生物体的局限性使得活体成像难以作为筛选手段广泛应用，且由于样本数量通常过少，限制了定量分析工具的应用。因此，迫切需要一种可用于基于高内涵定量研究的多细胞模式生物。

本方案将Drosophila胚胎应用于基于孔板的高内涵成像，以生成足够用于定量分析的大规模实验样本量。Drosophila melanogaster通常被认为是首个模式生物。利用Drosophila开展的研究在细胞与分子生物学领域取得了多项突破，包括遗传信息的传递、细胞信号通路的鉴定以及胚胎发育的遗传需求7,8,9。此外，Drosophila胚胎已被用于研究细胞分裂过程中体内微管的动态行为10,11,12。通过显微注射递送小分子和分子探针可实现时间上的精确控制，使Drosophila胚胎发育成为在体内探究细胞过程的强有力模型13,14。然而，采用传统成像方法获得大量实验重复极为耗时费力，限制了其在高通量成像筛选和定量分析中的应用。我们的方法利用通常用于单细胞分析的高内涵分析仪，实现了对早期Drosophila胚胎合胞体中体内成像分析的适应性改造。

本方案用于收集、分期及显微注射 果蝇 胚胎以探究有丝分裂期间驱动内质网（ER）形态变化的机制15尽管许多研究已经阐明了内质网在细胞周期中的动态特性16,17,18,19，长期以来难以比较多种扰动随时间对内质网形态的影响。为了确定在细胞分裂过程中驱动内质网形态变化的关键组分，本实验方案所列方法被用于探究微管及其他细胞骨架因子在早期胚胎皮层合胞体分裂中对有丝分裂期内质网重组的作用 果蝇 胚胎。综上所述，基因扰动技术的可及性在 黑腹果蝇 群落，能够在发育过程中的精确时间点进行药物和分子探针的显微注射，以及操作成本低廉 黑腹果蝇 使得该方法非常适合高通量的基于图像的筛选。本文所述方法可用于在体内研究多种细胞和发育过程 果蝇 胚胎20特别是，本方案非常适用于研究在较长时间内发生且位于100微米范围内的生物学事件 果蝇 胚胎皮层

方案

注意：培养基和溶液的配方请参见表1。

1. 用于活体分析的胚胎收集笼的设置与维护21

  1. 将新收集的果蝇放入一个干净的胚胎收集笼中。
    注意：虽然建议使用 commercially available 的收集笼，但也可以用空的果蝇培养瓶轻松自制收集笼21。
    1. 当大量蛹在 p14 阶段开始变黑时，丢弃或转移培养瓶中的成虫；在 20 °C 条件下，这通常发生在卵产下后约 14 天22。
    2. 让蛹孵化并在培养瓶中饲养 12–24 小时。
    3. 使用一个小漏斗置于收集笼开口处，将新鲜果蝇转移至小型收集笼中，以防止果蝇逃逸。可合并最多 3 个培养瓶的果蝇，以获得一个高密度的收集笼，内含 200 至 500 只果蝇。
    4. 通过反复将果蝇培养瓶轻敲坚硬表面（以使果蝇晕眩），然后将打开的培养瓶倒置在收集笼的漏斗上方，再轻敲数次，使果蝇落入收集笼中。
    5. 迅速将培养瓶放回其瓶塞上以封闭开口。在将打开的培养瓶从漏斗移回瓶塞时，确保瓶口始终朝下，因为果蝇倾向于向上爬行以远离敲击源。
    6. 将漏斗紧贴果蝇笼开口，并反复将笼子轻敲坚硬表面以使内部果蝇晕眩。立即取下漏斗，并将一块新鲜的葡萄培养基固定在果蝇笼开口处。使用标签胶带固定葡萄培养基。重复此过程，合并最多 3 个培养瓶，以制备一个高密度的果蝇收集笼。
      注意：也可使用 CO2 或其他果蝇麻醉剂使果蝇麻醉；但这样会延长步骤 1.2 中的适应期。
  2. 让新的收集笼适应环境 24–48 小时。如果使用了 CO2 或其他任何麻醉剂，则需至少适应 48 小时。
    1. 每天更换收集笼中的葡萄培养基两次，每次间隔 8–10 小时，新培养基需添加酵母糊。
  3. 每 5 天设置一个新的收集笼。

2. 采集和制备用于成像的胚胎

  1. 获取发育同步的胚胎
    1. 将收集笼中的葡萄培养基平板更换为新的平板，并在其中心位置添加一小滴酵母糊，让果蝇产卵1小时，随后丢弃旧的葡萄培养基平板。
      注意：果蝇可在产卵前完成受精，因此第一次收集的平板中会含有大量已提前发育的胚胎。先让果蝇排出这些陈旧胚胎，有助于提高后续胚胎之间的发育同步性。
    2. 再次更换为新的葡萄培养基平板（中心添加一小滴酵母糊），让果蝇产卵10分钟，随后丢弃旧平板。
      注意：为避免低温平板减缓胚胎发育，请在使用前将葡萄培养基平板和酵母糊恢复至室温。
    3. 将葡萄培养基平板更换为新的平板（不加酵母糊），并保留上一块带有胚胎的旧平板，该平板上的胚胎将用于成像。如有需要，可通过重复步骤2.1.2和2.1.3，继续从此笼中收集胚胎。
  2. 将步骤2.1中收集的胚胎在25°C条件下培养30–45分钟，以用于观察合胞体分裂23。
    注意：若要对胚胎发育中的合胞胚层阶段进行成像，必须在收集后90分钟内完成装片并开始显微镜观察。初次尝试本方案时，建议在步骤2.2中仅培养10–20分钟，以便为后续操作预留充足的准备时间。
  3. 使用50%次氯酸钠溶液（用去离子水配制）对胚胎进行去壳处理。
    1. 向葡萄培养基平板中加入去离子水，用画笔轻轻搅动使胚胎脱离，然后将含有胚胎的液体倒入140 nm筛网中，从而将步骤2.2中培养后的胚胎转移至筛网（图1A）。
      注意：此操作可在水槽或1,000 mL烧杯上方进行。
    2. 使用喷瓶以去离子水剧烈冲洗胚胎。将筛网在干燥的纸巾上轻拍以吸干水分，持续拍打直至纸巾上不再留下水渍（图1B）。
      注意：必须彻底清除胚胎表面残留的酵母糊，否则会影响下一步中漂白处理的效果。
    3. 取一个空的10 cm培养皿，加入新配制的50%漂白液（漂白剂与去离子水按1:1体积比稀释）。将筛网浸入50%漂白液中，持续2分45秒。筛网接触漂白液时立即启动计时器。在前15秒内，将筛网在漂白液中上下浸入3–4次，以打散胚胎团块（图1C）。
    4. 使用喷瓶以去离子水剧烈冲洗胚胎。将筛网在干燥纸巾上轻拍以吸干水分。重复剧烈冲洗和拍干过程共5次（图1D）。
      注意：此步骤是彻底清除残留卵壳的关键。建议使用整瓶去离子水，并在本步骤中消耗其中约一半的水量。
    5. 使用画笔将筛网上已吸干的胚胎转移至10 cm葡萄培养基平板上21（图1E）
      注意：可选用手工二氯处理作为漂白去壳的替代方法24。

细胞培养灭菌中的静态平衡；示意图；去离子水水合，漂白剂处理。
图1：胚胎去壳处理。（A）使用去离子水喷瓶、画笔和140 nm筛网收集胚胎。（B）使用去离子水喷瓶剧烈冲洗胚胎，并在纸巾上吸干。（C）将胚胎置于50%漂白剂中处理2分钟45秒以进行去壳。（D）使用去离子水喷瓶剧烈冲洗胚胎，并在纸巾上吸干，重复此步骤4次以彻底去除残留卵壳。（E）随后用画笔将胚胎转移至10 cm葡萄培养皿中。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 将胚胎固定到盖玻片上

  1. 在配备顶部鹅颈灯的体视显微镜下，使用取卵工具将15-20个胚胎排列在葡萄培养基平板的洁净区域，形成两排。将胚胎腹面朝下摆放，并使其前后端方向一致。制作取卵工具时，需将精细尖头的不锈钢镊子弯曲成45°角。有关胚胎背腹面（D/V）方向的判断方法，请参见Campos-Ortega等人的研究20。
    注意：必须确保胚胎腹面贴附于葡萄培养基平板，因为在步骤3.5中，胚胎将被压在盖玻片上，从而暴露背侧用于成像。由于背侧比腹侧更平坦，因此对背侧进行成像可增加单个Z平面内可见的细胞核数量。
  2. 准备一块75 mm × 25 mm的硅胶间隔层盖玻片。
    注意：此步骤可预先完成。建议提前制备多个盖玻片，并存放于载玻片盒中以保持清洁。
    1. 将一块75 mm × 25 mm盖玻片的轮廓描画在厚度为1.6 mm的硅胶间隔层片上，然后用剪刀剪下硅胶间隔层（图2A）。
    2. 使用剃刀刀片从硅胶间隔层中切出一个40 mm × 15 mm的内凹区域（图2A）。
    3. 将硅胶间隔层粘附到盖玻片上，并沿暴露的盖玻片玻璃内凹区域涂抹10 µL庚烷胶（图2A）。
      注意：均匀涂抹胶液可确保所有胚胎处于相同的Z平面，便于成像。
  3. 在步骤3.2.3中的庚烷胶干燥期间，从步骤3.1的葡萄培养基平板上切割出包含胚胎的矩形区域。
    1. 使用剃刀刀片在两排胚胎周围切割出一个矩形（尺寸小于40 mm × 15 mm），但暂不移除该矩形。
    2. 在第一个矩形旁边再切割出第二个矩形，并使用不锈钢刮刀的直边将其移除。
    3. 小心地将不锈钢刮刀的直边滑入第一个矩形下方，并将其取出（图2B）。
  4. 将带有胚胎的葡萄培养基切块放置于3.5 cm培养皿的外侧（图2C）。
  5. 在体视显微镜下，将已准备好的盖玻片缓慢覆盖在胚胎上方，并轻轻按压，使两排胚胎牢固粘附于胶液上（图2D）。
  6. 若需对胚胎进行显微注射，则跳至步骤4.1；若无需显微注射，则继续执行步骤3.7。
  7. 用1:1的卤代烃油700与卤代烃油27混合液填充硅胶间隔层，填充至间隔层高度的一半左右，以覆盖胚胎。
  8. 在4孔载玻片适配器的底部边缘贴上双面胶带，以防止盖玻片移动，但需确保胶带不位于物镜光路范围内。此胶带至关重要：若仅将盖玻片放置在适配器上而无固定，其在图像采集过程中会发生位移。将盖玻片安装至4孔载玻片适配器上。

使用硅胶片和盖玻片制备显微镜载玻片的实验装置示意图
图 2：盖玻片的制备与安装。（A）将75 mm × 25 mm盖玻片的轮廓描画在1.6 mm厚的硅胶片上。使用剪刀沿轮廓剪下，在硅胶垫片上切出40 mm × 15 mm的凹槽，然后将其安装到盖玻片上。沿凹槽中心线涂抹15 µL胶液。（B）将两排共15–20个胚胎整齐排列在葡萄状培养板上，占据面积小于40 mm × 15 mm，随后使用剃刀和不锈钢刮刀将该区域切割下来。（C）将切下的葡萄状培养板部分放置在一个空的3.5 cm培养皿顶部。（D）在体视显微镜下，将（A）中的盖玻片缓慢放下，使胚胎粘附在胶液条带上。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 胚胎的干燥与显微注射

  1. 将带有胚胎的盖玻片放置在载玻片上，以防止在干燥和显微注射过程中盖玻片底部被污染。
    注意：成像时盖玻片将不与载玻片连接。因此，成像需要使用倒置显微镜。
  2. 根据室温对胚胎进行干燥处理，时间为 5–10 分钟。在代表性结果中所使用的胚胎在 20 °C 条件下于干燥室中干燥 7 分钟，干燥室内含有干燥剂及一层体积比为 1:1 的硅胶珠（图 3A）。
  3. 干燥后立即用 1:1 的卤代烃油 700 与卤代烃油 27 混合液覆盖胚胎。将硅胶垫圈填充至其高度一半左右。
    注意：必须将高黏度卤代烃油与低黏度卤代烃油混合使用。单独使用纯卤代烃油 700（高黏度）会在施加后 30 分钟内减缓细胞周期进程。使用卤代烃油 700 与卤代烃油 27 按 1:1 比例混合可消除这一人工假象。
  4. 用注射液填充显微注射针，然后将其安装至显微注射仪上，并在加压条件下切开针尖。
    注意：在使用任何珍贵试剂进行完整实验前，建议先重复练习步骤 4.4 数次。这是显微注射过程中最具挑战性的步骤。
    1. 使用加长装填尖端将 2 μL 注射液装入显微注射针中。仅需一根显微注射针，但建议预先准备 2–3 根已装填好的备用针，以防不测。
      注意：有关加长装填尖端的规格，请参见材料表。由于本显微注射技术的特殊性——需在封闭且已装填的针内预先建立空气压力后再打开针尖——因此必须使用加长装填尖端，否则无法完成装填。
    2. 将注射针安装到显微注射仪上，并将推杆压下至其行程的一半位置。目的是增加玻璃毛细管内部的空气压力（图 4A）。
      注意：使用基于矿物油的显微注射仪推杆时，不要使用矿物油。应通过推杆直接建立空气压力，而非借助矿物油传递压力。
    3. 将玻璃针头下降至玻璃载片表面，使用新的 #9 刀片切开针尖。以 45° 角切割，形成锐利的开口。注射液应流至针尖末端，但不应流出针外。小心地在针尖上方加入 20 μL 卤代烃油，然后再次以 45° 角重新切开针尖。此时注射液应开始快速流出。
    4. 立即通过回撤推杆降低空气压力，但需保持连续的流动速率，以防止在两次注射之间胚胎膜堵塞针头（图 4B）。
      注意：若注射液透明，可通过将显微注射针反复插入和抽出卤代烃油，并在体视显微镜下观察液滴形成速率来判断注射液流速。通过每次轻按几下推杆调节空气压力，然后将注射针尖反复插入和抽出卤代烃油，观察调节后新液滴的形成速率。
    5. 使用显微操作器将针头定位在视野中央，然后利用显微操作器将针头抬起，并从其下方移除玻璃载片。此时针头已完成校准，可用于注射。

使用硅胶珠的干燥装置示意图；色谱载玻片的干燥过程，2分45秒计时器。
图3：干燥室示意图。（A）此图为干燥室的示意图。该干燥室由一层硅胶珠与一层干燥剂（drierite）按1:1比例组成。进行干燥时，将胚胎置于单个孔板盖的顶部，关闭干燥室7分钟。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 显微注射胚胎
    1. 将胚胎放置在体视显微镜载物台上，使其位于显微注射针下方，但不要降低注射针。
    2. 在50倍放大倍数下对胚胎进行聚焦。
    3. 降低注射针，直至其与胚胎处于同一焦平面。一手移动载玻片，另一手操作显微注射仪，对一排胚胎进行注射。
    4. 抬起注射针，将载玻片旋转180°，使第二排胚胎对准显微注射针。降低注射针，注射第二排胚胎。
      注意：尽量在10分钟内完成此操作。保留部分未注射的胚胎作为对照组使用。

显微注射装置中气压效应的显微镜示意图；高压与低压对比
图4：显微注射针的制备。 (A在此图示中, 针头中洋红色的强度代表气压。将装有样品的针头安装到显微注射仪上，并将柱塞推出50%以增加针头内部的气压。安装前需确保柱塞处于完全回缩状态。B在压力下剪断针尖，然后回抽柱塞以降低气压和流速。 请点击此处以查看此图的放大版本。

5. 在高内涵分析仪上进行成像

  1. 在运行本实验前，为载玻片适配器创建一个板图。使用 Plate Map Manager 菜单中的板架编辑器输入自定义板适配器的尺寸。
    注意：已为市售的板适配器（见材料表）创建了自定义板图。该板图包含以下设置：载玻片厚度：1000 µm，底部高度：1.607 mm，底部高度变异性：100 µm，基底材料：玻璃，盖玻片厚度：150 µm，盖玻片位置：底部 – 行：1 – 间距：56.987 mm，列：4 – 间距 28.391，尺寸与形状：矩形，宽度 23.00 mm，高度：73.00 mm，相对于 A1 的偏移量：21.29 mm – 42.74 mm
  2. 将载玻片适配器装载到显微镜上，并使用预览功能对盖玻片进行10倍明场图像拼接。
  3. 从某一行的顶部或底部选择一个胚胎，然后选择物镜并切换至60倍（NA 0.95）。为所需的荧光通道确定合适的曝光参数。
    注意：活细胞成像时，激光强度应保持在25%以下。
  4. 在主控制面板上，使用预览功能对包含两行胚胎的60倍荧光图像进行拼接。
  5. 在主控制面板上，选择Bin下拉菜单，并将bin值设为1 x 1以获得最佳分辨率。
  6. 使用z Stack Setup选项卡定义z轴堆栈的参数。
    1. 在z Stack Setup选项卡中，使用上下箭头确定并定义z轴堆栈的顶部和底部边界。定义顶部和底部边界后，选择绿色铅笔图标以保存z轴堆栈位置。请记录该z轴堆栈位置，因其将在步骤5.6.5中使用。
    2. 在z Stack Setup选项卡中，使用z Step输入框定义z切片之间的间距。
      注意：总切片数由调节步骤5.6.1和5.6.2决定。
    3. 在主控制面板上，右键单击荧光通道，使用图像模式下拉菜单将成像模式设置为3D。
    4. 在主控制面板上，选择激光自动对焦框以禁用自动对焦功能。
    5. 在主控制面板上，使用步骤5.6.1中定义的z轴堆栈位置设置初始对焦，然后选择初始对焦框以禁用“每个时间点重新对焦”功能。
  7. 在视野选项卡中，使用视野放置下拉菜单启用自定义点，然后使用箭头选择成像点。
    注意：采集之间的时间间隔（步骤5.8）将决定可同时成像的自定义点数量。
  8. 在时间序列选项卡中，选择采集时间序列框以启用时间序列功能，然后定义总时间点数。
    注意：6个自定义点 × 5个z切片 × 80个堆栈 = 2,400张图像，2,400张图像 × 每张图像8.2 MB = 19.68 GB磁盘空间。
  9. 在主控制面板上，使用名称输入框命名采集设置，然后选择文件和保存以保存采集设置。
  10. 在主控制面板上，选择扫描按钮以运行采集。

6. 图像后期处理

  1. 将 xdce 文件拖放到 Fiji 中，以多维超堆栈形式打开图像序列。
  2. 将超堆栈保存为 tif 文件。
  3. 生成最大强度投影，并将其保存为 tif 文件。
  4. 建立最大强度投影的图像库，并构建用于数据提取和分析的流程。

结果

本方案中介绍的方法用于研究微管在Drosophila胚胎有丝分裂期间内质网（ER）重组过程中的作用15。在有丝分裂过程中，内质网的结构会发生显著的重组，然而驱动这些变化的作用力尚不明确。最近研究表明，一类内质网塑形蛋白可促进内质网管状结构的形成25,26,27,28，而这些管状结构已知与微管密切相关28。为了研究微管对内质网形态的影响，本方案提供的方法被用于生成定量数据，以比较多种显微注射药物处理对有丝分裂期间内质网重组的影响。结果显示，抑制新微管聚合的秋水仙素可显著减少有丝分裂期间内质网的重组，如图5和图6所示。此外，本文所述方法成功获得了32个胚胎的时间序列成像数据。通过定制的MATLAB脚本，从12,800个感兴趣区域中提取了平均强度和最大强度测量值，并生成了描述性与推断性统计结果，这对于不同药物处理间的比较至关重要。由于分子探针易于获得且显微注射操作简便，本文所述方法可轻松适用于通过荧光强度定量研究多种生物学过程。

荧光显微镜过程，Rtn1-GFP，ReepB-GFP，强度分析，细胞成像实验。
图5：有丝分裂期间Rtnl1-GFP和ReepB-GFP在纺锤体极富集的代表性图像。（A）细胞周期10期有丝分裂过程中ReepB-GFP的60倍视野图像。蓝色方框表示用于B-E图的视野区域。A图经过阈值二值化滤波处理。该滤波未用于B-E图，因其会排除低于设定阈值的像素数据。（B,D）对照组及秋水仙碱处理组中的ReepB-GFP。（C,E）对照组及秋水仙碱处理组中的Rtnl1-GFP。本图改编自Diaz等人的研究15。请点击此处查看该图的放大版本。

Rtn1-GFP 与 ReepB-GFP 荧光强度比较；折线图；10µM DMSO，5µM 秋水仙素处理。
图6：有丝分裂期间Rtnl1-GFP和ReepB-GFP在纺锤体极富集程度的定量分析。 对32个胚胎在以下条件下的10帧图像中各20个纺锤体和20个细胞质ROI进行了分析。（A）Rtnl1-GFP胚胎注射10% DMSO作为对照。与未注射样本相比，对照胚胎的富集程度增加了0.1倍（所有样本在T210时p<0.001）（所有样本在T210时p < 0.001）。（B）ReepB-GFP胚胎注射10% DMSO作为对照。与未注射样本相比，对照胚胎的富集程度增加了0.1倍（所有样本在T210时p<0.001）（见图1E；所有样本在T210时p < 0.001）。（C）Rtnl1-GFP胚胎注射5 μM 秋水仙素。与对照组（A）相比，Rtnl1-GFP在纺锤体上的富集显著降低（所有样本在T210时p < 0.001）（所有样本在T210时p < 0.001）。（D）ReepB-GFP胚胎注射5 μM 秋水仙素。与对照组（B）相比，ReepB-GFP在纺锤体上的富集显著降低（所有样本在T210时p<0.001）（所有样本在T210时p<0.001）。本图经Diaz等15修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 酵母糊212. 葡萄汁平板213. 庚烷胶水24
1.1 将7克活性干酵母加入50 ml锥形瓶中。加入9毫升去离子水，用金属刮刀搅拌至均匀一致。2.1 配制溶液a：将6克琼脂加入250 ml烧瓶中的140 ml去离子水中，进行高压灭菌。3.1 将50英寸双面胶带填入玻璃闪烁小瓶中。
1.1 将7克活性干酵母加入50 ml锥形瓶中。加入9毫升去离子水，用金属刮刀搅拌至均匀一致。2.2 配制溶液b：将0.1克对羟基苯甲酸甲酯溶于2 ml乙醇中，然后将该溶液加入60 ml葡萄柚汁浓缩液中混合。3.2 加入20 ml庚烷，并用封口膜密封玻璃闪烁小瓶，在室温下旋转过夜。
2.3 溶液a高压灭菌后立即加入溶液b，混匀后倒入10个35 mm的培养皿中。（可制备35个葡萄汁平板）3.3 通过将胶水转移至两个15 ml锥形管中，在3000 RPM条件下离心15分钟，以去除塑料胶带碎片。
2.4 葡萄汁平板在室温下敞盖静置过夜，待凝固后盖上皿盖，并于4°C保存。3.4 将胶水上清液转移至1.5 ml微量离心管中储存。

表1：培养基与溶液的配制配方。

讨论

此处描述的方案具有高度的通用性，可轻松适用于研究多种阶段中的生物学事件 黑腹果蝇 胚胎发育。该方案非常适用于研究长时间内发生的生物学过程。例如，细胞化研究29,30 或异染色质结构域的形成 果蝇31,32 可受益于采用本方案所述方法，因为这些过程发生在较长时间内。此外，通过降低放大倍数，可增大样本量，以研究对光学分辨率要求较低的问题，例如合胞体分裂之间的时间间隔。33 原肠胚形成的时间或持续时间34.  同样，使用20倍物镜可在同一成像平面上同时观察两个胚胎。本方案中的方法提供了一个动态平台，可利用胚胎发育作为模型系统进行定量分析，以回答生物学问题。

本方案中有三个关键步骤。去卵膜后，需用50%次氯酸钠溶液处理，随后必须彻底冲洗并用力干燥5次（2.3.4）。此步骤可去除残留的微小卵膜碎片。若残留卵膜碎片，将会影响胚胎成像时的视野。在将胚胎固定到玻璃盖玻片上时（3.5），需均匀施压，使胚胎与胶水充分接触。这可确保所有胚胎处于相同的z平面。在切割显微注射针尖时，必须立即回抽针栓以调节针头的流速，否则会导致全部注射液流失。

本研究受到两个因素的限制。第一个因素是缺乏自动化的分割流程。我们设计了一个使用 MATLAB 的手动分割脚本；然而，若采用可遗传编码的纺锤体标记物，则该过程有望实现自动化。未来我们计划构建 CNN-RFP21、Rtln1-GFP 以及 CNN-RFP; ReepB-GFP 转基因品系，以实现纺锤体的自动分割。有关我们的 MATLAB 脚本及分析流程的更多信息，请参见 Diaz 等人15 的补充材料。其次，我们的图像采集时间间隔为 35 秒，这也构成了限制，因为该间隔仅允许我们同时对 6 个胚胎进行成像。若延长采集时间间隔，则可同时成像更多胚胎。尽管通过用通透化步骤替代显微注射可提高药物递送通量，但我们发现这并无必要，因为我们的样本量已受限于采集时间间隔。

尽管本方案用于成像果蝇（Drosophila）胚胎发育，但该整体方法可适用于其他多细胞模式系统中的胚胎发育研究，比如果蝇（C. elegans）、海胆和爪蟾（Xenopus）。胚胎非常适用于定量分析，因为它们可通过收集或受精过程轻松实现同步化。此外，胚胎不会移动或游出视野，因此可使用具备多点采集功能的简单软件生成多个延时视频用于定量分析。尽管本研究中使用了高内涵分析仪，但任何具备多点采集能力的倒置显微镜系统均可与本文所述方法结合使用。

使用具备多点采集功能的倒置共聚焦显微镜也可获得类似结果；然而，当样本量增大、且研究问题对时间分辨率要求较低时，高内涵分析仪的优势便显现出来。使用高内涵分析仪的一个明显优势是能够同时对4张载玻片进行成像，而传统系统仅能对1张载玻片成像。配备完整的4张载玻片、每张载玻片上含有40个胚胎时，只要帧间采集间隔至少为15分钟，便可在数小时内完成对160个胚胎的成像。使用高内涵分析仪的另一个重要优势在于，样品完全与外界光源隔离，这对于基于荧光强度的测量至关重要。最后，本研究中使用的高内涵分析仪配备了一台550万像素的CMOS相机，在60倍放大倍数下可提供达221.87 μm的宽广视场。这一更大的视场使我们能够在每个采集点成像半个胚胎。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

UD、WFM 和 BR 受国家科学基金会（NSF）科学与技术中心——细胞构建中心（Center for Cellular Construction）资助，项目编号为 DBI-1548297。BR 还获得了 NSF 职业奖（CAREER award）1553695 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 x 35毫米微型培养皿VWR货号：10799-192不适用
100%葡萄汁浓缩液Welch's，100%浓缩葡萄汁不适用在杂货店购买
250毫升窄口锥形瓶VWR货号：10536-914不适用
3" 非金属筛网，140号Gilson公司SV-165 #140不适用
4片式成像托盘Grace Biolabs货号：400104不适用
ACROS Organics，正庚烷，99+%，光谱级Fisher Scientific货号：AC411255000不适用
Acros Organics，乙醇，99.5%，ACS级试剂，无水，200 proofFisher Scientific货号：AC615095000不适用
Acros Organics，对羟基苯甲酸甲酯，99%（尼泊金甲酯）Fisher Scientific货号：AC126961000不适用
盖玻片，矩形，25 x 75毫米，#1浮法玻璃Fisher Scientific货号：50-143-782不适用
培养小室硅胶片材料 - 厚度1.6毫米Grace Biolabs货号：664273不适用
DWK生命科学Wheaton 20毫升PET液体闪烁小瓶Fisher Scientific货号：03-341-71A不适用
胚胎收集笼-迷你型Genesee Scientific货号：59-105不适用
Eppendorf微量移液器加样头Fisher Scientific产品编号：10289651不适用
Falcon 15毫升锥形离心管Fisher Scientific货号：05-527-90不适用
Falcon 50毫升锥形离心管Fisher Scientific货号：14-432-22不适用
Fleischmann's，活性干酵母Fleischmann's不适用在杂货店购买
葡萄培养基平板参见配方制备不适用不适用
Halocarbon 27油Genesee Scientific货号：59-133不适用
Halocarbon 700油Genesee Scientific货号：59-131不适用
庚烷胶水参见配方制备不适用不适用
工业用剃须刀片（外科级碳钢），单刃，9号VWR货号：55411-050不适用
Parafilm M实验室封口膜，4英寸 x 250英尺卷装Fisher Scientific货号：50-998-944不适用
Scotch双面胶带（带 dispenser），窄幅，专为粘接设计，1/2" x 7码，每包3卷，带收纳盒Fisher Scientific货号：NC0879005不适用
硅胶干燥珠，干燥剂，粒径约2 - 5毫米Millipore Sigma货号：1077351000不适用
不锈钢勺/刮刀VWR货号：470149-044不适用
W.A. Hammond Drierite指示型干燥剂Fisher Scientific货号：23-116582不适用
酵母糊参见配方制备不适用不适用
仪器设备
Allegra X-12台式离心机Beckman Coulter不适用需配备15毫升锥形离心管转子。
高压灭菌器不适用不适用任何型号的高压灭菌器均可使用。
Drummond Nanoject II微量注射仪Drummond Scientific不适用这是一种基于矿物油的注射系统。
GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000GE Healthcare不适用可使用具备多点采集功能的快速共聚焦显微镜替代。
冰箱（4°C°）不适用不适用果蝇培养基和酵母糊必须在4°C°下保存。
Zeiss Stemi 508体视显微镜，配备透射照明底座300和顶部可弯曲灯臂照明。Zeiss Microscopy不适用透射照明底座和可弯曲灯臂照明是必需的。

参考文献

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