近红外光免疫治疗（NIR-PIT）是一种新兴的癌症治疗策略，利用抗体-光吸收剂（IR700Dye）偶联物和近红外光选择性杀伤癌细胞。本文介绍一种利用生物发光成像评估NIR-PIT在胸膜播散性肺癌和恶性胸膜间皮瘤小鼠模型中抗肿瘤效应的方法。
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摘要
摘要
与皮下小鼠模型相比，原位小鼠模型能更准确地评估光免疫治疗的疗效。胸膜播散模型可用于评估肺癌或恶性胸膜间皮瘤等胸腔内疾病的治疗方法。
近红外光免疫治疗（NIR-PIT）是一种新近开发的癌症治疗策略，该方法将肿瘤靶向抗体的特异性与光吸收剂（IR700染料）在近红外光照射后产生的毒性作用相结合。已有多种抗体应用于NIR-PIT并报道了其疗效；然而，目前仅有少数研究报道了该策略在原位模型中的治疗效果。在本研究中，我们展示了NIR-PIT治疗胸膜播散性肺癌模型的疗效评估实例。
引言
尽管经过数十年的研究，癌症仍然是导致死亡的主要原因之一。其原因之一在于放疗和化疗属于高度侵入性的治疗手段，可能限制其治疗效果。相比之下，细胞或分子靶向治疗作为侵入性较小的技术，正受到越来越多的关注。光免疫疗法是一种将免疫疗法与光疗相结合，以协同增强治疗效果的治疗方法。免疫疗法通过增强肿瘤微环境的免疫原性并减轻免疫调节抑制，从而诱导机体对肿瘤的破坏。光疗则利用光敏剂与光射线的组合来摧毁原发性肿瘤，同时肿瘤细胞释放的肿瘤特异性抗原可进一步增强抗肿瘤免疫反应。由于光敏剂对靶细胞具有特异性和选择性，因此可实现对肿瘤的靶向治疗。光疗的模式包括光动力疗法（PDT）、光热疗法（PTT）以及基于光化学的疗法1。
近红外光免疫疗法（NIR-PIT）是一种新近开发的抗肿瘤光疗方法，结合了基于光化学的治疗与免疫治疗1,2。NIR-PIT 是一种分子靶向治疗，通过将近红外硅酞菁染料 IRdye 700DX（IR700）与单克隆抗体（mAb）偶联，靶向特异性细胞表面分子。当靶细胞受到近红外光（690 nm）照射时，其细胞膜会被破坏3。
将传统光敏剂与抗体结合以实现靶向光疗，即靶向光动力疗法（PDT），这一概念已有三十多年历史
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方案
所有 in vivo 实验均按照名古屋大学动物护理与使用委员会《实验动物资源护理与使用指南》的要求进行（批准号：#2017-29438、#2018-30096、#2019-31234、#2020-20104）。六周龄的纯合型无胸腺裸鼠购自名古屋大学动物中心并由该中心饲养。对小鼠进行操作时，使用异氟烷麻醉（诱导：4-5%，维持：2-3%）；通过镊子夹压足掌以确认麻醉深度。
1. IR700 与单克隆抗体的偶联
- 将单克隆抗体（1 mg，6.8 nmol）与 IR700 NHS 酯（66.8 mg，34.2 nmol，DMSO 中 5 mmol/L）在 0.1 mol/L Na 中孵育2HPO4 (pH 8.6) 条件下，15–25 °C 反应 1 小时。
- 使用层析柱（如 Sephadex）纯化混合物。用 PBS 准备并洗涤层析柱，然后将混合物上样至柱中，收集流出液，其中含有纯化的 IR700 偶联抗体。该 IR700 偶联抗体称为抗体-光敏剂偶联物（antibody photosensitizer conjugate, APC）。
- 测定APC中的蛋白和IR700浓度。
- 使用分光光度计制备蛋白质和IR700的校准曲线。
- 按照试剂盒说明书，将....
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结果
将抗podoplanin抗体NZ-1与IR700偶联，制备出NZ-1-IR700。我们通过SDS-PAGE证实了NZ-1与IR700的结合（图8）。通过将荧光素酶基因转染至恶性间皮瘤细胞（H2373）中，获得表达荧光素酶的H2373细胞（H2373-luc）10。
我们对8至12周龄的雌性纯合型裸鼠进行了麻醉，并将1 × 105个H2373-luc细胞注入胸腔。将肿瘤细胞注射到小鼠体内的当天记为第1天。
第4天，在注射D-荧光素钠（15 mg/mL， 200 µL)通过腹腔注射，选择胸腔内具有足够荧光素酶活性的小鼠进行后续研究（图9）。100 微克 NZ-1-IR700（100 µL通过静脉注射 通过 尾静脉。对照组注射 PBS（100 µL).
在第5天，采用二氧化.......
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讨论
本研究中，我们展示了一种用于评估近红外光免疫治疗（NIR-PIT）在恶性胸膜间皮瘤（MPM）胸膜播散模型中治疗效果的方法。NIR-PIT可实现高度选择性的细胞杀伤，因此对正常组织几乎无损伤23,24,25。由于这种选择性细胞杀伤特性，NIR-PIT在播散性模型中已被证明具有良好的安全性9,26。然而，在某些步骤中可能存在其他可替代的方法。目前已有多种建立胸膜播散模型的报道27,28,29,30。我们选择了注射建模法，因.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25w/v% 胰蛋白酶-1mmol/L EDTA 4Na 酚红溶液 | Wako | 209-016941 | 用于细胞培养 |
| 1mL 注射器 | TERUMO | SS-01T | 用于小鼠实验 |
| 30G 针头 | Nipro | 1907613 | 用于小鼠实验 |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| 胶体蓝染色试剂盒 | Invitrogen | LC6025 | 用于凝胶蛋白染色 |
| Coomassie (Bradford) Plus 蛋白检测试剂 | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | 用于测定 APC 浓度 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Wako | 043-07216 | 用于 IR700 偶联 |
| D-荧光素（钾盐） | Cayman Chemical | 14681 | 用于生物发光成像和 DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad Software | 用于统计分析 | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | 用于分析 700 nm 荧光图像 | |
| IRDye 700DX 酯红外染料 | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| 异氟烷 | Wako | 095-06573 | 用于小鼠麻醉 |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | 用于采集生物发光图像和 DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | 用于分析生物发光图像和 DLIT | |
| Na₂HPO₄ | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | 用于 IR700 偶联 |
| NIR 激光器 | 长春新产业光电技术有限公司 | MRL-III-690R | 用于近红外照射 |
| Novex WedgeWell 4 至 20%，Tris-甘氨酸，1.0 mm，Mini Protein 凝胶，12 孔 | Invitrogen | XP04202BOX | 用于 SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS 样品缓冲液 (×4) | Invitrogen | NP0007 | 用于 SDS-PAGE |
| 光功率计 | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | 用于测量 NIR 激光输出 |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy 成像系统 | Li-Cor Biosciences | 用于采集 700 nm 荧光图像 | |
| 青霉素-链霉素溶液 (×100) | Wako | 168-23191 | 用于细胞培养 |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | ThermoFisher | A1113803 | 用于荧光素酶转染 |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin 慢病毒颗粒 | PerkinElmer | CLS960002 | 用于荧光素酶转染 |
| RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺和酚红） | Wako | 189-02025 | 用于细胞培养 |
| Sephadex G25 柱 (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | 用于 IR700 偶联 |
| UV-1900i | Shimadzu | 用于测定 APC 浓度 |
参考文献
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near....
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重印与许可
