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方法文章

近红外光免疫治疗在胸膜播散小鼠模型中的应用

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DOI：

10.3791/61593

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2021年2月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Respiratory Medicine, Nagoya University Graduate School of Medicine, 2Nagoya University Institute for Advanced Research, 3B3-Unit, Advanced Analytical and Diagnostic Imaging Center (AADIC)/Medical Engineering Unit (MEU), Nagoya University Institute for Advanced Research

本文内容

摘要

近红外光免疫治疗（NIR-PIT）是一种新兴的癌症治疗策略，利用抗体-光吸收剂（IR700Dye）偶联物和近红外光选择性杀伤癌细胞。本文介绍一种利用生物发光成像评估NIR-PIT在胸膜播散性肺癌和恶性胸膜间皮瘤小鼠模型中抗肿瘤效应的方法。

摘要

与皮下小鼠模型相比，原位小鼠模型能更准确地评估光免疫治疗的疗效。胸膜播散模型可用于评估肺癌或恶性胸膜间皮瘤等胸腔内疾病的治疗方法。

近红外光免疫治疗（NIR-PIT）是一种新近开发的癌症治疗策略，该方法将肿瘤靶向抗体的特异性与光吸收剂（IR700染料）在近红外光照射后产生的毒性作用相结合。已有多种抗体应用于NIR-PIT并报道了其疗效；然而，目前仅有少数研究报道了该策略在原位模型中的治疗效果。在本研究中，我们展示了NIR-PIT治疗胸膜播散性肺癌模型的疗效评估实例。

引言

尽管经过数十年的研究，癌症仍然是导致死亡的主要原因之一。其原因之一在于放疗和化疗属于高度侵入性的治疗手段，可能限制其治疗效果。相比之下，细胞或分子靶向治疗作为侵入性较小的技术，正受到越来越多的关注。光免疫疗法是一种将免疫疗法与光疗相结合，以协同增强治疗效果的治疗方法。免疫疗法通过增强肿瘤微环境的免疫原性并减轻免疫调节抑制，从而诱导机体对肿瘤的破坏。光疗则利用光敏剂与光射线的组合来摧毁原发性肿瘤，同时肿瘤细胞释放的肿瘤特异性抗原可进一步增强抗肿瘤免疫反应。由于光敏剂对靶细胞具有特异性和选择性，因此可实现对肿瘤的靶向治疗。光疗的模式包括光动力疗法（PDT）、光热疗法（PTT）以及基于光化学的疗法1。

近红外光免疫疗法（NIR-PIT）是一种新近开发的抗肿瘤光疗方法，结合了基于光化学的治疗与免疫治疗1,2。NIR-PIT 是一种分子靶向治疗，通过将近红外硅酞菁染料 IRdye 700DX（IR700）与单克隆抗体（mAb）偶联，靶向特异性细胞表面分子。当靶细胞受到近红外光（690 nm）照射时，其细胞膜会被破坏3。

将传统光敏剂与抗体结合以实现靶向光疗，即靶向光动力疗法（PDT），这一概念已有三十多年历史4,5。以往研究曾尝试通过将传统PDT试剂与抗体偶联来实现靶向递送，但由于光敏剂具有疏水性，这些偶联物易被肝脏截留，因而收效甚微6,7。此外，近红外光免疫治疗（NIR-PIT）的作用机制与传统PDT完全不同。传统光敏剂通过吸收光能产生氧化应激，其过程包括能量转换、跃迁至激发态、再回到基态，最终引发细胞凋亡。而NIR-PIT则通过光化学反应使光敏剂在细胞膜上聚集，直接破坏细胞膜，导致细胞迅速发生坏死8。在多个方面，NIR-PIT优于传统的靶向PDT。传统光敏剂的消光系数较低，因此需要在一个抗体分子上连接大量光敏剂，这可能降低其结合亲和力。大多数传统光敏剂具有疏水性，难以在不损害其免疫反应性或体内靶向富集能力的前提下与抗体有效结合 in vivo 。此外，传统光敏剂通常在可见光波段吸收光能，组织穿透深度有限。

已有若干研究报道了近红外光免疫治疗（NIR-PIT）在靶向肺癌和恶性胸膜间皮瘤（MPM）细胞等胸腔内肿瘤中的应用9,10,11,12,13,14,15,16,17。然而，仅有少数研究描述了NIR-PIT在胸膜播散性MPM或肺癌模型中的疗效9,10,11,12。皮下移植瘤异种移植模型被认为是标准的肿瘤模型，目前被广泛用于评估新疗法的抗肿瘤效果18。然而，皮下肿瘤微环境不利于形成能够准确模拟真实恶性表型的适当组织结构或生理条件19,20,21,22。理想情况下，应建立原位疾病模型，以更精确地评估抗肿瘤治疗的效果。

本文展示了一种在胸膜播散性肺癌小鼠模型中评估近红外光免疫疗法（NIR-PIT）疗效的方法。通过将肿瘤细胞注射至胸腔内建立胸膜播散小鼠模型，并利用荧光素酶发光进行确认。小鼠经静脉注射与IR700偶联的单克隆抗体，随后对胸部进行近红外光照射治疗。治疗效果通过荧光素酶发光信号进行评估。

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方案

所有 in vivo 实验均按照名古屋大学动物护理与使用委员会《实验动物资源护理与使用指南》的要求进行（批准号：#2017-29438、#2018-30096、#2019-31234、#2020-20104）。六周龄的纯合型无胸腺裸鼠购自名古屋大学动物中心并由该中心饲养。对小鼠进行操作时，使用异氟烷麻醉（诱导：4-5%，维持：2-3%）；通过镊子夹压足掌以确认麻醉深度。

1. IR700 与单克隆抗体的偶联

  1. 将单克隆抗体（1 mg，6.8 nmol）与 IR700 NHS 酯（66.8 mg，34.2 nmol，DMSO 中 5 mmol/L）在 0.1 mol/L Na 中孵育2HPO4 (pH 8.6) 条件下，15–25 °C 反应 1 小时。
  2. 使用层析柱（如 Sephadex）纯化混合物。用 PBS 准备并洗涤层析柱，然后将混合物上样至柱中，收集流出液，其中含有纯化的 IR700 偶联抗体。该 IR700 偶联抗体称为抗体-光敏剂偶联物（antibody photosensitizer conjugate, APC）。
  3. 测定APC中的蛋白和IR700浓度。
    1. 使用分光光度计制备蛋白质和IR700的校准曲线。
    2. 按照试剂盒说明书，将已知浓度的标准白蛋白与蛋白检测试剂盒混合（参见 材料表，考马斯亮蓝（CBB）蛋白质染色法）。测定白蛋白在595 nm波长处的吸光度，并使用以下方程绘制蛋白质的标准曲线（线性近似公式）：y = ax + b（x：浓度，y：吸光度）。
    3. 使用相同方法获得IR700在690 nm处吸光度的校准曲线。建议IR700的标准浓度范围为0.1–5 µM（0.1954–9.77 µg/mL）。
    4. 使用标准曲线 [x = (y-b)/a（x：浓度，y：吸光度）] 测定APC中的蛋白浓度和IR700浓度。
    5. 根据摩尔浓度的测定结果，确定每个单克隆抗体（mAb）结合的IR700染料分子数量。
      注意：确定每个单克隆抗体（mAb）分子上偶联的IR700分子的最佳数量至关重要。通常，单个mAb分子上结合约三个IR700分子即可有效发挥双重作用 体外 和 体内每个抗体结合多个IR700（例如六个）会更容易在肝脏中被截留 体内 实验中，抗体与IR700的结合比例在1:2至1:4范围内。如有必要，可降低IR700的比例。
  4. 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以确认 APC 的形成。使用荧光成像仪在 700 nm 波长下对凝胶成像，并根据试剂盒说明书使用蛋白质染色试剂盒对凝胶中的蛋白质进行染色（参见 材料表，考马斯亮蓝蛋白质染色。

2. 胸膜播散模型的建立

  1. 制备表达荧光素酶的靶细胞，并将细胞重悬于 1.0 × 106 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中的靶细胞
    注意：胸腔内肿瘤细胞，如肺癌细胞和恶性胸膜间皮瘤（MPM）细胞，适合作为靶细胞。通过荧光素酶基因转染制备表达荧光素酶的细胞，并在转染后确认荧光素酶的高表达。 > 10 代细胞传代。细胞培养于添加了10%胎牛血清以及青霉素（100 IU/mL）和链霉素（100 mg/mL）的培养基中。根据肿瘤生长速率及治疗时间进程调整细胞数量（1.0 × 105-6.0 × 106 细胞/体重
  2. 准备8至12周龄的雌性纯合型裸鼠（athymic nude mice），体重以19–21 g为宜。
  3. 使用异氟烷麻醉小鼠（诱导：4-5%，维持：2-3%）；用镊子夹住尾巴以确认无反应。
  4. 用聚苯乙烯泡沫制作一个塞子，并将该塞子固定在30 G针头上，使针尖露出5 mm，以防止损伤肺部。将针头弯曲 用经70%乙醇清洁的干净镊子轻触，或将其按压在经70%乙醇清洁的硬物表面 为避免气胸（图1).
    警告：注意不要刺伤自己。使用镊子弯曲针头。将堵头连接到针头时，不要用手直接握住堵头。在将细胞装入注射器之前，先将堵头插入针头会更安全。
  5. 用1 mL注射器吸取目标细胞，并安装带有堵头的30G针头。
  6. 用70%乙醇对动物胸部进行消毒后再进行操作。
  7. 通过肋间隙将针头刺入小鼠胸腔。由于针尖触及肋骨时遇到阻力，导致针尖上下移动。穿过肋间隙后，将注射器紧压小鼠身体并注入100 µL目标细胞图2).
    注意：当针头正确进入胸腔时，小鼠会出现深呼吸。通过弯曲针尖，可避免气胸以及细胞误注入肺组织。
    注意：建议进行右侧胸壁穿刺，以避免心脏壁穿刺的风险。
  8. 将小鼠滚动2-3次，使细胞在胸腔内均匀分布。
  9. 将小鼠放回清洁且温暖的环境中 将小鼠放回笼中并监测直至可自主活动。术后，小鼠将从麻醉中苏醒并恢复正常行为。

3. 生物发光的测量

注意：数据采集所用软件列于 材料表中。

  1. 为确认胸膜播散模型的建立，自细胞注入胸腔后每日进行生物发光成像评估。
  2. 麻醉小鼠（步骤 2.3），并腹腔注射 D-荧光素酶底物（15 mg/mL，200 µL）。
  3. 成像前后均需确保小鼠呼吸正常。必要时使用加热装置，防止麻醉期间发生低体温。 
  4. 注射后 10 分钟，将小鼠置于生物发光成像（BLI）检测设备中。为获取图像，在软件中打开 Acquisition Control Panel 。选择 Luminescent、 Photograph 和 Overlay （图 3）。
  5. 将曝光时间设为 Auto，二乘二像素合并（Binning）设为较小值。
  6. 发光成像的光圈值（f/stop）设为 1 ，拍照成像设为 8 ；光圈值用于控制电荷耦合器件（CCD）检测器接收的光量。
  7. 视野（Field of View）设为 C。
  8. 待小鼠样本准备就绪后，点击 Acquire 开始图像采集。选择具有足够荧光素酶活性的小鼠用于后续研究。
    注：理想的胸膜播散模型在腹侧观察时，胸部弥散区域应呈现强发光信号。若生物发光成像显示信号未在胸腔内弥散，而仅局限于注射部位，则肿瘤可能为皮下移植。
  9. 图像显示后，将显示格式设为 Radiance。打开 Tool Palette 面板（图 4A）。
  10. 选择 ROI Tools。建议使用 Circle 工具在图像上圈定生物发光区域。
  11. 点击 Measure ROIs 以测量表面生物发光强度（图 4B）。
  12. 在 ROI 测量面板左上角使用 Configure Measurement 功能选择所需测量值/信息，并将该数据表导出为 .csv 文件（图 4C）。
  13. 在 .csv 文件中，使用 Total Flux (p/s) 的数值作为生物发光强度的定量指标。

4. 漫透射发光成像断层扫描（DLIT）

注意：数据采集所用软件列于 材料表中。

  1. 打开 X-ray Armed 按钮。
  2. 对小鼠进行麻醉（步骤2.3），然后经腹腔注射D-荧光素钠（15 mg/mL，200 µL）。若需从3.2至3.7连续拍摄DLIT，则跳过此步骤。
  3. 注射10分钟后，将小鼠放入BLI设备中。
  4. 打开软件的 Acquisition Control Panel 。选择 Luminescent、 Photograph、 CT、 Standard-One Mouse以及 Overlay。其他设置与3.4–3.6相同（图5A）。
  5. 在 Acquisition Control Panel上选择 Imaging Wizard 。
  6. 选择 Bioluminescence ，然后选择 DLIT （图5B）。
  7. 选择 Firefly 作为待测波长（图5C）。
  8. 将成像对象设为 Mouse，曝光参数设为 Auto Settings，视野设为 C-13.4 cm，动物高度设为 1.5 cm （图5D）。
  9. 按下 X-rays will be produced when energized. Acquire。
  10. 打开CT序列图像数据。
  11. 在工具面板中打开 Surface Topography ，选择 Show （图6A）。
  12. 调整阈值，使紫色显示仅覆盖身体表面（图6B）。然后选择对象 Nude Mouse ，并点击 Generate Surface。确保小鼠轮廓被准确绘制（图6C）。
  13. 打开 Tool Palette，进入 DLIT 3D Reconstruction Properties 选项卡。将组织属性设为 Mouse Tissue ，光源光谱设为 Firefly （图6D）。接着，打开 Analyze 选项卡，确认每个选定波长的数据。最后，点击 Reconstruct 按钮（图6E）。
  14. 在生成的DLIT图像中确认胸部腔内是否存在BLI信号。

5. 体内 胸膜播散模型 的近红外光免疫治疗（NIR-PIT）

  1. 使用功率计测量波长为690 nm（近红外，NIR）激光的光剂量，并将输出功率调节至100 mW/cm2。
    注意：激光具有相干性且光束发散角小，因此在50 cm范围内，光能量几乎不随距离改变。若出现较多不良事件（如灼伤），可将输出功率降低至40 mW/cm2范围内。
  2. 用70%乙醇清洁小鼠尾部，并在近红外照射前24小时经尾静脉注射APC（100 µg） via 尾静脉。注射后对注射部位施加压力以控制出血。
    注意：根据实际情况，将APC注射体积调整为50–200 µL。
  3. 对小鼠进行麻醉（见步骤2.3），并使其仰卧。为避免非靶部位受到近红外照射，使用铝箔遮蔽其他区域（图7A）。使用激光进行100 J/cm2的近红外光照射；若肿瘤扩散至腹部背面，可将近红外光照射剂量分多个方向施加（图7B）。
    注意：根据体外实验结果以及灼伤等不良事件情况，将照射剂量调整为30–150 J/cm2 范围内 in vitro 。
  4. 完成近红外照射且小鼠清醒后，将其放回笼中。
  5. 观察生物发光成像（BLI）信号，并随时间（每日）测量感兴趣区域（ROI）的信号强度（参见3.2–3.12）。
  6. 对于 ex vivo 成像，在APC注射后24小时（即近红外照射前立即）使用二氧化碳处死小鼠。
    1. 为观察小鼠胸腔内部，移除胸壁并剪开肋骨和胸骨。在未给予APC的对照组基础上，同步采集荧光图像（700 nm）。随后，将D-荧光素（150 µg/mL）涂抹于暴露的胸腔表面，并进行生物发光成像（参见3.2–3.7）。

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结果

将抗podoplanin抗体NZ-1与IR700偶联，制备出NZ-1-IR700。我们通过SDS-PAGE证实了NZ-1与IR700的结合（图8）。通过将荧光素酶基因转染至恶性间皮瘤细胞（H2373）中，获得表达荧光素酶的H2373细胞（H2373-luc）10。

我们对8至12周龄的雌性纯合型裸鼠进行了麻醉，并将1 × 105个H2373-luc细胞注入胸腔。将肿瘤细胞注射到小鼠体内的当天记为第1天。

第4天，在注射D-荧光素钠（15 mg/mL， 200 µL)通过腹腔注射，选择胸腔内具有足够荧光素酶活性的小鼠进行后续研究（图9）。100 微克 NZ-1-IR700（100 µL通过静脉注射 通过 尾静脉。对照组注射 PBS（100 µL).

在第5天，采用二氧化...

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讨论

本研究中，我们展示了一种用于评估近红外光免疫治疗（NIR-PIT）在恶性胸膜间皮瘤（MPM）胸膜播散模型中治疗效果的方法。NIR-PIT可实现高度选择性的细胞杀伤，因此对正常组织几乎无损伤23,24,25。由于这种选择性细胞杀伤特性，NIR-PIT在播散性模型中已被证明具有良好的安全性9,26。然而，在某些步骤中可能存在其他可替代的方法。目前已有多种建立胸膜播散模型的报道27,28,29,30。我们选择了注射建模法，因...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25w/v% 胰蛋白酶-1mmol/L EDTA 4Na 酚红溶液Wako209-016941用于细胞培养
1mL 注射器TERUMOSS-01T用于小鼠实验
30G 针头Nipro1907613用于小鼠实验
BALB/cSlc-nu/nuJapan SLC
胶体蓝染色试剂盒InvitrogenLC6025用于凝胶蛋白染色
Coomassie (Bradford) Plus 蛋白检测试剂Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)PI-23200用于测定 APC 浓度
二甲基亚砜 (DMSO)Wako043-07216用于 IR700 偶联
D-荧光素（钾盐）Cayman Chemical14681用于生物发光成像和 DLIT
GraphPad Prism7GraphPad Software用于统计分析
Image StudioLi-Cor Biosciences用于分析 700 nm 荧光图像
IRDye 700DX 酯红外染料LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)929-70011
异氟烷Wako095-06573用于小鼠麻醉
IVIS Spectrum CTPerkinElmer用于采集生物发光图像和 DLIT
Living ImagePerkinElmer用于分析生物发光图像和 DLIT
Na₂HPO₄SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)S9763用于 IR700 偶联
NIR 激光器长春新产业光电技术有限公司MRL-III-690R用于近红外照射
Novex WedgeWell 4 至 20%，Tris-甘氨酸，1.0 mm，Mini Protein 凝胶，12 孔InvitrogenXP04202BOX用于 SDS-PAGE
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (×4)InvitrogenNP0007用于 SDS-PAGE
光功率计Thorlabs (Newton, NJ, USA)PM100用于测量 NIR 激光输出 
PBS(-)Wako166-23555
Pearl Trilogy 成像系统Li-Cor Biosciences用于采集 700 nm 荧光图像
青霉素-链霉素溶液 (×100)Wako168-23191用于细胞培养
嘌呤霉素二盐酸盐ThermoFisherA1113803用于荧光素酶转染
RediFect Red-Fluc-Puromycin 慢病毒颗粒PerkinElmerCLS960002用于荧光素酶转染
RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺和酚红）Wako189-02025用于细胞培养
Sephadex G25 柱 (PD-10) GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)17-0851-01用于 IR700 偶联
UV-1900iShimadzu用于测定 APC 浓度

参考文献

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胸膜播散模型生物发光成像近红外光照射抗体-光敏剂偶联物肿瘤细胞注射胸腔治疗原位小鼠模型IR700染料激光荧光素酶活性检测
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