本文展示了利用传统暗场显微镜监测金纳米棒（AuNRs）在细胞膜上动态行为的方法。通过ImageJ和MATLAB检测单个AuNRs的位置和取向，并利用单颗粒追踪分析对其扩散状态进行表征。
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本文内容
摘要
摘要
分析纳米颗粒在细胞膜上的扩散动力学对于深入理解细胞摄取过程具有重要意义，并为纳米药物递送系统的合理设计提供了理论依据。单颗粒追踪（SPT）分析能够探测单个纳米颗粒在细胞膜上的位置和取向，揭示其平移和旋转状态。本文展示了如何利用传统的暗场显微镜监测金纳米棒（AuNRs）在活细胞膜上的动态行为，以及如何使用ImageJ和MATLAB提取AuNRs的位置和取向信息，并表征其扩散状态。对数百个颗粒的统计分析表明，单个AuNRs在U87 MG细胞膜表面表现出布朗运动。然而，对单个长轨迹的分析显示，AuNRs在膜上存在两种明显不同的运动状态，即长距离传输和受限区域内的局域化运动。我们的SPT方法有望用于研究不同生物细胞中颗粒在表面或细胞内的扩散行为，将成为探究复杂细胞机制的有力工具。
引言
纳米颗粒（NPs）在细胞膜上的动态行为与细胞摄取过程密切相关，这对于理解细胞功能、病毒或细菌感染以及人工纳米药物递送系统的开发至关重要1,2。单颗粒追踪（SPT）技术是表征纳米颗粒异质性行为的有力工具3,4。通常情况下，细胞膜具有流动性，这意味着蛋白质和脂质等组分可在质膜平面内进行侧向移动5,6,7。膜结构与组织在时空上的复杂性可能导致纳米颗粒与膜之间相互作用的时空异质性。因此，对纳米颗粒在膜上运动的直接可视化需要兼具高空间分辨率和高时间分辨率。
单粒子追踪显微技术能够以数十纳米的空间分辨率和毫秒级的时间分辨率监测活细胞中单个粒子的定位，已被广泛用于研究纳米颗粒（NPs）或膜分子的动力学行为8,9。基于荧光的显微成像技术已成为在活细胞环境中观察纳米颗粒/分子的有力工具9,
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方案
1. 细胞培养
- 通过向最低必需培养基（MEM）中添加胎牛血清（终浓度 10%）和青霉素-链霉素（终浓度 1%），制备 U87 MG 细胞的完全培养基。使用塑料细胞培养皿进行细胞传代培养。
- 每周传代细胞 2 至 3 次。
- 当细胞融合度达到 80%~90% 时，吸除培养基，并用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）冲洗细胞层 2~3 次。
- 向细胞培养皿中加入 1.0 至 2.0 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞变圆（3~5 分钟）。
- 加入 3.0 mL 已配制的完全培养基，通过轻柔吹打使细胞分散。
- 将细胞悬液（1 mL）接种至新的培养皿中，并加入新鲜细胞培养基（3 mL），重新悬浮细胞。
- 将细胞置于含 5% CO2 的湿润环境中，于 37 °C 培养箱中维持培养。
2. 显微镜载玻片制备
注意：在单粒子追踪（SPT）实验中使用第3至第10代且活性较高的U87 MG细胞。
- 将已用Piranha溶液清洗过的22 mm × 22 mm盖玻片浸入乙醇（99.9%）中进行灭菌。
- 用镊子将盖玻片从乙醇溶液（步骤2.1）中取出，并在火焰上燃烧残留乙醇以完成灭....
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结果
在本实验方案中，使用了未经修饰的40 x 85 nm CTAB-AuNRs。如图2B所示，其纵向等离子体共振最大值位于约650 nm（红色区域），横向共振位于520 nm（绿色区域）。已有文献表明，等离子体金纳米棒（AuNRs）的光学性质（如局域表面等离子体共振强度）会随着其直径发生显著变化20,22。在图2C中，CTAB-AuNRs在U87细胞膜上的散射强度呈现出典型的窄峰高斯分布，且与CTAB-AuNRs在玻璃表面的散射强度一致，表明本实验中追踪的CTAB-AuNRs具有良好的单分散性。
通过暗场显微镜（DFM，12帧/秒）监测CTAB-AuNRs在膜上的动态行为。如图7所示，共获得超过500条轨迹（轨迹长度超过300帧），每细胞可产生约40条轨迹。所有500条轨迹的Rg
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讨论
本方案用于研究金纳米棒（AuNRs）在细胞膜上的动态行为。该方案包括显微成像、数据提取、动力学参数计算和数据分析方法四个部分，各部分均具有良好的灵活性和通用性。因此，该方法具有广泛的应用前景，例如可用于研究纳米颗粒标记的膜分子在膜上的运动、纳米颗粒标记受体的内吞动力学、细胞内纳米颗粒的动力学分析，以及沿微管运输的囊泡包被纳米颗粒的动态过程等。
基本步骤是利用暗场显微镜（DFM）对金纳米棒（AuNRs）在细胞膜上的运动进行成像。目前，已开发出多种用于分析细胞膜动态的成像技术，其中荧光显微镜已被广泛应用24。然而，荧光探针的光漂白特性导致其无法长时间追踪颗粒的动力学行为。本研究中采用了光稳定性良好的等离激元AuNRs。近年来已发展出多种基于等离激元纳米颗粒（NPs）散射特性的成像技术15。特别是采用斜入射照明模式的暗场显微镜（DFM），仅收集来自样品的散射光，因而具有较高的信噪比。
金纳米棒（AuNRs）的平移和旋转动力学均被获取并进行.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（项目编号：21425519、91853105 和 21621003）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CTAB 包被的金纳米棒（CTAB-AuNRs） | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| 彩色 CMOS 相机 | Olympus | DP74 | 日本 |
| 盖玻片 | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| 暗场显微镜 | Nikon | 80i | 正置显微镜 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | 美国国立卫生研究院 | 2.0.0-rc-69/1.52 p | ImageJ 的一个发行版本 |
| 带槽玻璃载片 | Sail 品牌 | 7103 | 单凹型 |
| Image J | 美国国立卫生研究院 | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB 代码 | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| 最低必需培养基（MEM） | Gibco | 10-010-CVR | 含酚红 |
| 最低必需培养基（MEM） | Gibco | 51200038 | 不含酚红 |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 塑料细胞培养皿 | Falcon | 353002 | |
| 塑料细胞培养皿 | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG 细胞 | 美国模式培养物集存库 | ATCC HTB-14 | 一种人源原发性胶质母细胞瘤细胞系 |
参考文献
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341(2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society R....
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