使用单纳米粒子暗场显微镜可视化细胞膜上金纳米棒的扩散动力学

Summary

在这里，我们展示了使用传统的暗场显微镜来监测金纳米棒（AuNR）在细胞膜上的动态。使用 ImageJ 和 MATLAB 检测单个 AuNR 的位置和方向，AuNR 的扩散状态以单个粒子跟踪分析为特征。

Abstract

分析纳米粒子在细胞膜上的扩散动力学，对于更好地了解细胞吸收过程具有重要作用，为纳米药物输送的合理设计提供了理论依据。单粒子跟踪（SPT）分析可以探测单个纳米粒子在细胞膜上的位置和方向，并揭示其转化和旋转状态。在这里，我们展示了如何使用传统的暗场显微镜来监测活细胞膜上的金纳米棒（AuNR）的动态。我们还展示了如何使用 ImageJ 和 MATLAB 提取 AuNR 的位置和方向，以及如何描述 AuNR 的扩散状态。对数百个粒子的统计分析表明，单个AuNR在U87MG细胞膜表面执行布朗运动。然而，单个长轨迹分析表明，AuNR在膜上有两种截然不同的运动状态，即远程传输和有限区域禁闭。我们的SPT方法可用于研究不同生物细胞的表面或细胞内粒子扩散，并可以成为研究复杂细胞机制的有力工具。

Introduction

纳米粒子（NPs）在膜上的动力学与细胞吸收过程密切相关，这对了解细胞功能、病毒或细菌感染以及人工纳米医学输送系统^{的发展至关重要。}单粒子跟踪 （SPT） 技术是描述 NP^3、4的异质行为的可靠工具。一般来说，细胞膜是流动的，这意味着蛋白质和脂质等成分可以在等离子膜平面^5、6、7中横向移动。膜组织和结构的空间复杂性可能导致NP和膜之间相互作用的空间异质性。因此，在膜上直接可视化 NP 的运动需要高空间和时间分辨率。

单粒子跟踪显微镜监测活细胞中单个粒子的定位，空间分辨率为几十纳米，时间分辨率为几毫秒，已得到很好的开发，以研究NP或膜分子的动力学^8，9。荧光显微成像技术已成为观测活细胞环境中的NPs/分子的宝贵工具^。

Protocol

1. 细胞培养

1. 通过添加胎儿牛血清（最终浓度10%）为U87MG细胞准备完整的介质青霉素-链霉素（最终浓度1%）到最低限度的基本介质（MEM）。使用塑料细胞培养皿进行细胞亚培养。
2. 通道单元每周2到3次。
   1. 取出培养基，用杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）冲洗细胞层2~3倍（80%~90%）。
   2. 在细胞培养皿中加入1.0至2.0 mL的Trypsin-EDTA溶液，在倒置显微镜下观察细胞，直到细胞变圆（3~5分钟）。
   3. 加入3.0 mL的预制完全介质，并通过轻轻吹笛分散细胞。
   4. 将细胞悬浮物（1 mL）加入使用新鲜细胞介质（3 mL）的新培养皿中，然后重新悬浮细胞。
3. 在加湿的大气中将细胞保持在 37 °C 和 5% CO_2。

2. 显微镜幻灯片准备

注:第三代至第十代高活性U87MG细胞用于SPT实验。

1. 通过浸入乙醇（99.9%）对已经用皮兰哈溶液清洗的22毫米×22毫米盖片进行消毒。
2. 使用钳子从乙醇溶液（步骤 2.1）中取出盖滑，并通过在火焰上燃烧乙醇进行消毒。一旦所有乙醇被烧毁，将盖片放入塑料细胞培养皿（35 x 10 mm）中，填充2 mL的细胞介质（无苯酚红色）。

Results

在协议中，使用了未经修改的 40 x 85 nm CTAB-AuNR。如图2B所示，其纵向质离子最大值为 650 nm（红色区域），横向共振为 520 nm（绿色区域）。以往的文献显示，质子AuNR的光学特性（如LSPR强度）将发生显著变化，其直径为^20，22。在图2C中，U87细胞膜上CTAB-AuNR的散射强度显示了典型的高斯分布，宽度狭窄，与玻璃上的CTAB-AuNR分布一致，这表明本实验中跟踪的CTAB-AuNR分布良好。

DFM（12 fps）监测了膜上的CTAB-AuNR动态。如 图7所示，获得了500多个轨迹（轨迹长度超过300帧）。此外，每个单元格可以生成大约 40 个轨迹。所有 500 个轨迹的 R_g 显示小值分布，平均 R_g .......

Discussion

所展示的协议用于研究细胞膜上的AuNR的动态。该协议由四个部分组成，包括微观成像、数据提取、动态参数计算和数据分析方法，每个部分都是灵活和通用的。因此，未来有许多可能的应用，例如，研究膜上NP相关膜分子的运动、NP标记受体的内分泌动力学、细胞内NP和囊泡涂层的NPs沿着微管运输的动态分析等。

基本步骤是使用DFM来映像细胞膜上的AuNR运动。目前，已开发出多种细胞膜动力学分析成像技术，其中荧光显微镜已广泛应用²⁴种。然而，荧光探头的光漂白特性导致长期无法跟踪粒子动力学。在这里，使用光稳定质离子奥NR。基于质离子^NPs15的散射特性，已经开发出多种成像技术。特别是具有斜照明模式的DFM仅从样品中收集散射光，因此具有较高的信号噪声比。

获得并分析 AuNR 的转化和旋转动力学。大多数研究的重点是研究NP在膜上的位置波动，而忽略了方向变化^{的影响25。}此外，在大多数情况下，细胞膜平面和成像平面.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB 涂层金纳米棒 （CTAB-AuNRs）	Nanoseedz	NR-40-650	85 nm * 40 nm
彩色 CMOS 相机	奥林巴斯	DP74	日本
盖玻片	Citoglas	z10212222C	22*22 mm
暗场显微镜	尼康	80i	正置显微镜
胎牛血清 （FBS）	Gibco	10099141
斐济	国立卫生研究院	2.0.0-rc-69/1.52 p	a 分布 ImageJ
凹槽载玻片	Sail 品牌	7103	单凹
Image J	美国国立卫生研究院	1.52 j
MATLAB	MathWorks	R2019b
MATLAB 代码			https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
最低必需培养基 （MEM）	含酚红	Gibco	10-010-CVR
最低必需培养基 （MEM）	Gibco	51200038	无酚红
来源	OriginLab Origin Origin Lab	Origin Pro 2018C
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
塑料细胞培养皿	Falcon	353002
塑料细胞培养培养皿	Falcon	353001	35*10 mm
U87 MG 细胞	美国型培养物保藏	ATCC HTB-14	一种人原代胶质母细胞瘤细胞系