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方法文章

利用单纳米颗粒暗场显微技术可视化金纳米棒在细胞膜上的扩散动力学

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DOI：

10.3791/61603

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2021年3月5日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Tsinghua University

本文内容

摘要

本文展示了利用传统暗场显微镜监测金纳米棒（AuNRs）在细胞膜上动态行为的方法。通过ImageJ和MATLAB检测单个AuNRs的位置和取向，并利用单颗粒追踪分析对其扩散状态进行表征。

摘要

分析纳米颗粒在细胞膜上的扩散动力学对于深入理解细胞摄取过程具有重要意义，并为纳米药物递送系统的合理设计提供了理论依据。单颗粒追踪（SPT）分析能够探测单个纳米颗粒在细胞膜上的位置和取向，揭示其平移和旋转状态。本文展示了如何利用传统的暗场显微镜监测金纳米棒（AuNRs）在活细胞膜上的动态行为，以及如何使用ImageJ和MATLAB提取AuNRs的位置和取向信息，并表征其扩散状态。对数百个颗粒的统计分析表明，单个AuNRs在U87 MG细胞膜表面表现出布朗运动。然而，对单个长轨迹的分析显示，AuNRs在膜上存在两种明显不同的运动状态，即长距离传输和受限区域内的局域化运动。我们的SPT方法有望用于研究不同生物细胞中颗粒在表面或细胞内的扩散行为，将成为探究复杂细胞机制的有力工具。

引言

纳米颗粒（NPs）在细胞膜上的动态行为与细胞摄取过程密切相关，这对于理解细胞功能、病毒或细菌感染以及人工纳米药物递送系统的开发至关重要1,2。单颗粒追踪（SPT）技术是表征纳米颗粒异质性行为的有力工具3,4。通常情况下，细胞膜具有流动性，这意味着蛋白质和脂质等组分可在质膜平面内进行侧向移动5,6,7。膜结构与组织在时空上的复杂性可能导致纳米颗粒与膜之间相互作用的时空异质性。因此，对纳米颗粒在膜上运动的直接可视化需要兼具高空间分辨率和高时间分辨率。

单粒子追踪显微技术能够以数十纳米的空间分辨率和毫秒级的时间分辨率监测活细胞中单个粒子的定位，已被广泛用于研究纳米颗粒（NPs）或膜分子的动力学行为8,9。基于荧光的显微成像技术已成为在活细胞环境中观察纳米颗粒/分子的有力工具9,10,11,12。例如，全内反射荧光显微镜具有高时空分辨率，可对基底/溶液界面处样品的薄层（约100 nm）进行成像，已被广泛应用于膜分子动力学的研究13,14。然而，单个荧光团固有的缺点，如信号强度低和快速不可逆的光漂白，限制了追踪的准确性和持续时间13。因此，由于具有独特的光学特性，作为荧光探针替代物的非荧光等离子体纳米颗粒（plasmonic NPs）在长期成像研究中受到越来越多的关注15。基于等离子体纳米探针的散射信号，已有多种光学显微成像技术被用于研究生物过程的机制，例如暗场显微镜（DFM）16、干涉散射（iSCAT）显微技术17和微分干涉差显微镜（DICM）18。此外，利用DFM和DICM还可获取金纳米棒（AuNRs）的运动与旋转动力学信息18,19,20,21,22。通常，在单粒子追踪实验中，目标物体的运动由光学显微镜记录，随后通过单粒子追踪分析方法进行分析3。单个纳米颗粒产生的随时间变化的轨迹和取向角通常具有随机性和异质性，因此有必要结合多种分析方法呈现丰富的动力学信息。

本文提供了一种整合性实验方案，利用暗场显微技术（DFM）监测金纳米棒（AuNRs）在细胞膜上的动态行为，通过 ImageJ 和 MATLAB 软件提取 AuNRs 的位置与取向信息，并采用单颗粒追踪（SPT）分析方法表征 AuNRs 的扩散特性。作为示例，本文展示了如何应用该 SPT 协议可视化未修饰的 AuNRs（CTAB-AuNRs，以十六烷基三甲基溴化铵分子作为保护剂合成）在 U87 MG 细胞膜上的动态过程。已有研究表明，CTAB-AuNRs 在生物环境中可吸附蛋白质，能够在细胞膜上移动并最终进入细胞2,20,22。U87 MG 细胞是中枢神经系统中最常见且恶性程度最高的肿瘤细胞，其膜受体呈异常表达状态。这些膜受体可与 AuNRs 表面吸附的蛋白质发生相互作用，从而影响 AuNRs 的运动行为。本实验方案具有普适性，可广泛适用于生物学领域的其他单颗粒追踪实验。

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方案

1. 细胞培养

  1. 通过向最低必需培养基（MEM）中添加胎牛血清（终浓度 10%）和青霉素-链霉素（终浓度 1%），制备 U87 MG 细胞的完全培养基。使用塑料细胞培养皿进行细胞传代培养。
  2. 每周传代细胞 2 至 3 次。
    1. 当细胞融合度达到 80%~90% 时，吸除培养基，并用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）冲洗细胞层 2~3 次。
    2. 向细胞培养皿中加入 1.0 至 2.0 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞变圆（3~5 分钟）。
    3. 加入 3.0 mL 已配制的完全培养基，通过轻柔吹打使细胞分散。
    4. 将细胞悬液（1 mL）接种至新的培养皿中，并加入新鲜细胞培养基（3 mL），重新悬浮细胞。
  3. 将细胞置于含 5% CO2 的湿润环境中，于 37 °C 培养箱中维持培养。

2. 显微镜载玻片制备

注意：在单粒子追踪（SPT）实验中使用第3至第10代且活性较高的U87 MG细胞。

  1. 将已用Piranha溶液清洗过的22 mm × 22 mm盖玻片浸入乙醇（99.9%）中进行灭菌。
  2. 用镊子将盖玻片从乙醇溶液（步骤2.1）中取出，并在火焰上燃烧残留乙醇以完成灭菌。待乙醇完全燃尽后，将盖玻片放入盛有2 mL细胞培养基（无酚红）的塑料细胞培养皿（35 × 10 mm）中。
  3. 取50 µL步骤1.2.3所得的细胞悬液滴加于盖玻片上，轻轻前后、左右移动培养皿，使细胞均匀分布。将其置于湿润环境中。
  4. 当盖玻片上的U87 MG细胞达到20%–40%融合度（约12小时）时，向培养皿中加入20 μL CTAB-AuNRs（138 pM），并充分分散。在湿润环境中孵育5分钟。
  5. 从步骤2.4的培养皿中取出100 μL培养基（无酚红），加入经Piranha溶液预清洗的带槽玻璃载玻片的槽内（图1）。
  6. 将盖玻片从培养皿中取出，倒置在显微镜玻璃载玻片的槽上方（图1），用指甲油密封，待其干燥后置于显微镜载物台上进行单颗粒追踪（SPT）实验。

3. 使用暗场显微镜进行单颗粒追踪实验（图1）。

  1. 在油浸暗场聚光镜（NA 1.43-1.20）上滴加一滴油，并转动旋钮使聚光镜与玻片接触。
  2. 在盖玻片顶部滴加一滴油，转动调焦旋钮，使60倍油镜物镜（NA 0.7–1.25）接触油滴。
  3. 打开光源，轻微转动调焦旋钮以聚焦成像平面。
    注意：视野中背景为黑色，细胞呈亮态，CTAB-AuNRs（长径比~2:1，图2）呈现为微小的有色（红色、黄色或绿色）散射光点。
  4. 通过彩色CMOS相机采集样品的散射光。在软件中点击“相机图标”以录制并导出TIFF格式图像进行保存。

4. 数据采集

  1. 提取单条长期轨迹
    1. 按照 图3 所示操作，将时间序列暗场图像从“RGB颜色”模式转换为“8位”模式。在Image J中点击 图像 | 类型 | 8位。为调整对比度，点击 图像 | 调整 | 亮度 | 对比度。
    2. 选择目标颗粒，并通过框选背景后按“Ctrl+X”删除，以截除时间序列中的背景。
    3. 点击“插件 | 粒子追踪经典版 | 粒子追踪器”打开粒子检测与粒子连接窗口。
    4. 将半径设为6，截断值设为0，百分位数设为0.01%。
      注：为检测粒子，可在预览辅助下调整上述三个参数。确保半径略大于目标粒子且小于最小的粒子间间距。百分位数是作为候选粒子的强度分布下限。
    5. 将连接范围设为5，位移设为10。
      注：为在连续相邻帧之间连接粒子，可调整上述两个参数。位移是指粒子在两帧之间可移动的最大像素数，连接范围是指在确定最佳匹配时所考虑的连续帧数。
    6. 点击“确定”以打开ParticleTracker结果窗口查看结果。
    7. 点击“可视化所有轨迹”以检查生成的轨迹。
    8. 若软件生成的轨迹与AuNR的实际运动轨迹不符，可点击顶部的“重新连接粒子”菜单，使用不同的连接范围和百分位数参数重新连接已检测的粒子。
    9. 若软件生成的轨迹与AuNR的运动轨迹一致，则点击“保存完整报告”以保存结果。
      注：使用Image J提取单条长期轨迹的示例如 图4 所示。
  2. 提取多条轨迹
    注：使用Fiji提取多条轨迹的示例如 图5 所示。该过程包含多个阶段，每个阶段构成追踪流程中的一个步骤。每一步的结果会立即显示，当输出不理想时，用户可返回重新调整参数。
    1. 按照 图3 所示操作，将时间序列暗场图像从“RGB颜色”模式转换为“8位”模式。在Image J路径中点击“图像 | 类型 | 8位”。为调整对比度，点击“图像 | 调整 | 亮度 | 对比度”。
    2. 点击“插件 | 追踪 | TrackMate”打开起始面板，然后点击“下一步”。
    3. 从下拉菜单中选择“LoG检测器”，然后点击“下一步”。
    4. 调整检测器配置面板的参数。将估计的斑点直径设为10，阈值设为0，并勾选“进行亚像素定位”。
    5. 点击“下一步”以打开初始斑点过滤面板。
      注：可调整多个参数以进一步优化目标点。本示例中未调整其他参数。
    6. 点击“下一步”，然后从下拉菜单中选择“HyperStack显示器”。
    7. 点击“下一步”以打开斑点过滤面板。将质量设为大于1.88，X坐标大于38.86，Y坐标大于56.54。
    8. 点击“下一步”，然后从下拉菜单中选择“简单LAP追踪器”。通过调整三个参数来配置该追踪器，即连接最大距离 = 15，间隙闭合最大距离 = 15，间隙闭合最大帧间隔 = 5。
      注：连接最大距离是指两点在两帧之间的最大位移。间隙闭合最大距离是指两个片段之间的最大位移。间隙闭合最大帧间隔是指可连接的两点之间的最大帧数。
    9. 点击“下一步”开始追踪。完成后继续点击“下一步”。
    10. 对轨迹设置过滤条件，例如将轨迹中斑点数量设为大于300。
    11. 持续点击“下一步”直至最终保存面板打开。从下拉菜单中选择“将轨迹导出为XML文件”，然后点击“执行”以csv格式保存。
  3. R/G值
    注：通过使用MATLAB编写的代码（https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle），从彩色暗场图像中获取目标AuNR在R和G通道的散射强度，提取原理如 图6 所示。
    1. 使用 xycoordination.m 函数，根据ImageJ/Fiji提取的x-y坐标，确定每帧中AuNR的中心像素坐标。
    2. 使用 RGextraction.m 函数划定一个3 × 3像素的矩阵，提取R或G通道的9个散射强度值，并计算其平均值（μ，定义为R或G）。
      注：该3 × 3像素矩阵以步骤4.3.1中获得的像素坐标为中心。
  4. 偏振角
    注：偏振角是指AuNR的长轴方向与光轴之间的夹角（如 图1 所示），可用于反映AuNR的空间（Z轴）旋转动力学。
    1. 使用 polarangle.m 函数，通过双通道差分法22 计算偏振角（θ），显示光吸收光谱的公式 \( f(R-G) \propto \sin^2 \theta \) 的方程。。

5. 数据分析

注意：系统且稳健的数据分析框架对于单粒子追踪（SPT）分析方法的性能和效率至关重要。使用基于 MATLAB 编写的自定义软件（https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters）。使用绘图与分析软件（见材料表）绘制图表。

  1. 分析参数
    1. 使用 csv_data_extract_dis_vel_ss.m 和 csv_data_MSD.m 脚本，根据表1中所示公式计算动力学参数。
      注意：这些参数用于分析金纳米棒（AuNRs）的动力学行为，包含三个部分。（1）轨迹相关参数：位移、步长、速度、回转半径（Rg）和转向角（Ta）；（2）均方位移（MSD）参数：扩散系数（Dt）和反常扩散指数（α）；（3）旋转相关参数：极角和旋转不稳定性（σ）。
测量指标定义物理意义
位移距离公式方程，d=√((xᵢ−x₁)²+(yᵢ−y₁)²)，用于计算空间中距离的示意图。物体位置的变化
步长方程：使用距离公式计算距离，S=√((xi-xi-1)²+(yi-yi-1)²)。两个相邻点之间的距离
速度速度方程 v=s/τ，物理公式，用于说明速度计算。物体运动的快慢
Rg回转半径公式；Σ方程；聚合物物理分析中的关键概念。物体在特定时间区间内的运动范围
Ta余弦相似性公式，数学方程，向量点积，模长计算。物体在两个相邻点之间的运动方向
MSD均方位移公式，用于统计力学中粒子运动分析的MSD方程。物体在特定时间区间内的平均移动距离
Dt均方位移方程，MSD=4Dt*t^α，用于粒子追踪中的扩散分析。物体的扩散能力
α均方位移方程，MSD=4Dt*t^α，用于粒子追踪中的扩散分析。正常扩散（α~1）
极角静态平衡方程：sin²θ=(R-G)-(R-G)min/(R-G)max-(R-G)min；教学示意图。物体的三维取向信息
σ标准差公式，用于方差与分布计算的统计分析方程。极角数据集的离散程度

表1：分析中使用的三类参数。 包括轨迹相关参数（位移、步长、速度、Rg 和 Ta）、均方位移（MSD）参数（MSD、Dt 和 α）以及旋转相关参数（极角和旋转不稳定性）。

  1. 轨迹的可视化分析
    注意：轨迹可视化可直观展示粒子运动的时空异质性以及动态参数的轨迹（坐标）分布，例如时间映射轨迹、Rg 和 Dt 映射轨迹、极角映射轨迹。映射轨迹使用绘图与分析软件绘制。
    1. 将 x 坐标设为 X，y 坐标设为 Y，时间（Rg、Dt、极角）设为 Z。
    2. 点击“绘图 | 散点图 | 彩色映射图”。
    3. 添加颜色条。
  2. 均方位移（MSD）分析
    注意：通过 MSD 分析可获得粒子的运动活性与运动模式23。Dt 越大，表明粒子的扩散运动越活跃。当 α~1 时，粒子进行正常扩散运动；否则为异常扩散运动。
    1. MSD-τ 图
      1. 将时间间隔（τ）设为 X，MSD 数据设为 Y。
      2. 点击“绘图 | 散点图”
      3. 点击“分析 | 拟合 | 非线性曲线拟合（函数：Allometricl）”以拟合数据。
    2. MSD-τ 双对数图
      注意：MSD-τ 双对数图的斜率为 α，截距为 Dt，可直观展示粒子的运动情况。
      1. 将对数时间间隔设为 X，对数 MSD 设为 Y。
      2. 点击“绘图 | 散点图”。
      3. 点击“分析 | 拟合 | 线性曲线拟合”以拟合数据。
    3. D-τ 图（MSD/4t）
      注意：D = MSD/4τ，是时间 τ 和异常因子 α 的函数，D-τ 图可直接显示扩散系数随时间的变化。当 D 随时间增加时，α 大于 1，粒子进行超扩散运动。
      1. 将对数时间间隔（τ）设为 X，对数 D 设为 Y。
      2. 点击“绘图 | 散点图”。
      3. 点击“分析 | 拟合 | 非线性曲线拟合（函数：“Allometricl”）”以拟合数据。
        注意：轨迹越短，扩散估计的不准确性越高。通常通过长时间间隔（> 30 τ）的 MSD-τ 分析获得 Dt 和 α。然而，简单粗略的拟合会平滑掉运动细节。因此，应进行短时间间隔（< 10 τ）的 MSD-τ 分析，以研究粒子在短时间内的运动行为。
  3. 统计分析
    1. 多粒子统计分析
      注意：多粒子统计分析可反映空间区域内粒子的运动状态，间接指示空间异质性环境。例如，若 Dt 的直方图呈现大范围分布或多峰分布，则表明粒子的运动活性具有异质性。
      1. 将动态参数（如 Dt、Rg、最大位移）设为 Y。
      2. 点击“绘图 | 直方图”。
      3. 双击直方图，设置分组大小或分组数量，点击“应用”。
    2. 单粒子统计分析
      注意：单粒子的统计分析可展示单个粒子的运动行为，也间接反映了其周围环境的时空异质性。
      1. 多帧分析
        1. 计算单条长轨迹所有帧的动态参数（如 Ta、步长、极角），复制到 Origin 表格中并设为 Y。
        2. 点击“绘图 | 直方图”。
        3. 双击直方图，设置分组大小或分组数量，点击“应用”。
          注意：若 Ta 和步长均呈现小值分布，则粒子进行小步长超扩散运动。
      2. 滑动窗口分析
        1. 通过滑动窗口法（11 帧）计算单条长轨迹所有帧的动态参数（如 Rg、Dt），复制到 Origin 表格中并设为 Y。
        2. 点击“绘图 | 直方图”。
        3. 双击直方图，设置分组大小或分组数量，点击“应用”。
  4. 时间序列分析
    注意：统计分析可揭示纳米粒子（NPs）的运动状态，而时间序列分析可作为补充展示其运动行为。结合多个时间序列参数，可在时间和空间层面上区分纳米粒子的运动行为。
    1. 将时间设为 X，时间序列参数设为 Y（如位移、极角和 Rg）。
    2. 点击“绘图 | 多面板图 | 堆叠图 | 线条 + 符号”。

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结果

在本实验方案中，使用了未经修饰的40 x 85 nm CTAB-AuNRs。如图2B所示，其纵向等离子体共振最大值位于约650 nm（红色区域），横向共振位于520 nm（绿色区域）。已有文献表明，等离子体金纳米棒（AuNRs）的光学性质（如局域表面等离子体共振强度）会随着其直径发生显著变化20,22。在图2C中，CTAB-AuNRs在U87细胞膜上的散射强度呈现出典型的窄峰高斯分布，且与CTAB-AuNRs在玻璃表面的散射强度一致，表明本实验中追踪的CTAB-AuNRs具有良好的单分散性。

通过暗场显微镜（DFM，12帧/秒）监测CTAB-AuNRs在膜上的动态行为。如图7所示，共获得超过500条轨迹（轨迹长度超过300帧），每细胞可产生约40条轨迹。所有500条轨迹的Rg

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讨论

本方案用于研究金纳米棒（AuNRs）在细胞膜上的动态行为。该方案包括显微成像、数据提取、动力学参数计算和数据分析方法四个部分，各部分均具有良好的灵活性和通用性。因此，该方法具有广泛的应用前景，例如可用于研究纳米颗粒标记的膜分子在膜上的运动、纳米颗粒标记受体的内吞动力学、细胞内纳米颗粒的动力学分析，以及沿微管运输的囊泡包被纳米颗粒的动态过程等。

基本步骤是利用暗场显微镜（DFM）对金纳米棒（AuNRs）在细胞膜上的运动进行成像。目前，已开发出多种用于分析细胞膜动态的成像技术，其中荧光显微镜已被广泛应用24。然而，荧光探针的光漂白特性导致其无法长时间追踪颗粒的动力学行为。本研究中采用了光稳定性良好的等离激元AuNRs。近年来已发展出多种基于等离激元纳米颗粒（NPs）散射特性的成像技术15。特别是采用斜入射照明模式的暗场显微镜（DFM），仅收集来自样品的散射光，因而具有较高的信噪比。

金纳米棒（AuNRs）的平移和旋转动力学均被获取并进行...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（项目编号：21425519、91853105 和 21621003）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CTAB 包被的金纳米棒（CTAB-AuNRs）NanoseedzNR-40-65085 nm * 40 nm
彩色 CMOS 相机OlympusDP74日本
盖玻片Citoglasz10212222C22*22 mm
暗场显微镜Nikon80i正置显微镜
胎牛血清（FBS）Gibco10099141
Fiji美国国立卫生研究院2.0.0-rc-69/1.52 pImageJ 的一个发行版本
带槽玻璃载片 Sail 品牌7103单凹型
Image J美国国立卫生研究院1.52 j
MATLABMathWorksR2019b
MATLAB 代码https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
最低必需培养基（MEM）Gibco10-010-CVR含酚红
最低必需培养基（MEM）Gibco51200038不含酚红
OriginOriginLabOrigin Pro 2018C
青霉素-链霉素Gibco15140122
塑料细胞培养皿Falcon353002
塑料细胞培养皿Falcon35300135*10 mm
U87 MG 细胞美国模式培养物集存库ATCC HTB-14一种人源原发性胶质母细胞瘤细胞系

参考文献

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