一种革兰氏阴性菌败血症的新生儿影像学模型

摘要

新生小鼠感染发光的 E. coli O1:K1:H7 后，会引发败血症感染，并伴随显著的肺部炎症和肺组织病理变化。本文描述了利用纵向活体成像结合系统性细菌载量计数、炎症因子谱分析及肺组织组织病理学检查，建立并进一步研究新生儿败血症模型的实验方法。

摘要

由于新生儿在生命最初几个月内表现出独特的免疫特征，他们面临更高的细菌性败血症风险。我们建立了一种研究大肠杆菌（E. coli）O1:K1:H7血清型致病机制的实验方案，该血清型在新生儿中可导致高死亡率。本方法利用活体成像技术，在感染进程的不同时间点对新生仔鼠进行动态观察。结合血液中细菌载量测定、炎症因子谱分析及组织病理学检查，该方法为深入理解败血症期间的感染动态提供了严谨的研究体系。在本研究中，我们构建了两种不同感染剂量模型，以比较细菌负荷与疾病严重程度。结果显示，接种后10小时即可观察到肩胛下感染引发的全身播散性感染。至24小时，发光标记的大肠杆菌（E. coli）在血液、肺脏及其他外周组织中均大量存在。肺组织中炎症细胞因子的表达在24小时显著升高，并伴随细胞浸润及组织损伤迹象，且损伤程度随感染剂量增加而加重。活体成像技术虽存在一定局限性，包括发光信号检测阈值以及新生动物在麻醉过程中可能出现的一些技术难题。尽管如此，我们发现该感染模型为深入理解新生儿小鼠败血症过程中纵向感染动态提供了新的视角，而这一过程迄今尚未得到充分研究。我们预计该模型还可进一步拓展用于研究生命早期其他重要的细菌感染性疾病。

引言

新生儿败血症是一个重要问题，因为新生儿在生命最初几天表现出独特的免疫特征，无法为机体提供足够的抗感染保护¹新生儿败血症仍然是美国一项重大的医疗健康问题，仅在美国每年就导致超过75,000例病例²为了深入研究这些感染，需要建立能够模拟人类疾病特征的新型动物模型。我们已建立了一种使用新生小鼠的感染模型 E大肠杆菌 coliO1:K1:H7³. E. coli 是美国新生儿败血症的第二大常见病因，但导致了大多数与败血症相关的死亡病例^4,5然而，对于早产儿和极低出生体重（VLBW）婴儿而言，它是首要病因 婴儿被视为独立个体⁵K1血清型最常与新生儿侵袭性血流感染和脑膜炎相关。^6,7目前，除了抗生素和支持性治疗外，尚无其他治疗方法。与此同时，许多致病菌的抗生素耐药率持续上升，部分菌株的 E. coli 对多种常用于治疗的抗生素具有耐药性⁸因此，我们亟需持续开发研究新生儿脓毒症机....

方案

所有实验程序均经西弗吉尼亚州机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》的建议进行¹⁸。

1. 细菌接种物的制备

1. 用接种环在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上划线，从稳定表达荧光素酶并具有卡那霉素抗性的 E. coli O1:K1:H7-lux 冻存菌种中分离单个菌落³。37 °C 培养过夜。
2. 次日，在生物安全柜中将LB肉汤（Luria broth）恢复至室温（25 °C）。
3. 在生物安全柜内，挑取划线平板上的单个菌落，接种至3 mL含卡那霉素（30 μg/mL）的LB培养基中，37 °C、220 rpm振荡培养过夜。此为种子培养物。
4. 在生物安全柜内，将种子培养物按1:100比例稀释至新鲜的3 mL LB培养基中，37 °C、220 rpm振荡培养2–3小时。此为工作培养物。
5. 使用分光光度计在600 nm处测定空白样和工作培养物的光密度（OD）。取96孔平底检测板的一个孔加入100 µL不含细菌的LB培养基作为空白；另取一个孔加入100 µL工作培养物。每组设两个额外重复。使用酶标仪读取吸光度。
6. 从工作培养物的吸光度值中减去空白对照的吸光度，再与先前建立并验证的生长曲线进行比对，估算工作培养物....

结果

本方案在新生小鼠中诱导了细菌性败血症，我们采用纵向活体成像、血液中细菌计数、病理组织学评估以及炎症细胞因子表达谱分析来研究疾病进程。在接种低剂量（约 2 × 10⁶ CFUs）和高剂量（约 7 × 10⁶ CFUs）E.coli 后，随时间推移可观察到新生仔鼠出现一系列发病症状。接受较高接种剂量的仔鼠表现出更明显的痛苦体征，包括活动能力下降、无法纠正体位，以及在感染后24小时（hpi）难以维持直立姿势。然而，不同仔鼠的发病程度存在差异，部分个体表现更为严重。在感染后立即进行成像以建立基线时，一只接受低剂量接种的动物因异氟烷暴露而死亡。至24 hpi时，六只接受高剂量接种的动物中有两只死于全身性感染（死亡率为33.3%）。无论是接受高剂量还是低剂量接种的感染仔鼠，在24 hpi时的体重均显著低于其对照组同窝仔鼠（图1A,B）。所有接受高剂量接种的仔鼠在24 hpi时均达到实验终点标准，因此该组所有感染仔鼠在成像后被实施安乐死。对部分接受低剂量接种的小鼠以及全部接受高剂量接种的小鼠（因均.......

讨论

我们建立的肩胛下感染模型是一种用于在新生小鼠中诱导细菌性败血症的新型方法，可用于实时研究细菌病原体的纵向播散过程。活体成像技术为实时观察新生个体中细菌的播散提供了可能，这对于理解细菌播散的动力学特征，并在疾病发展的相应阶段进一步研究宿主反应与组织损伤至关重要。实验中，向新生小鼠皮下、肩胛下区域注射细菌接种物。该注射技术相较于其他常用方法（如尾静脉注射和腹腔注射）更为简便，因其对注射位点的精确定位要求较低，这一点在体型微小的幼鼠中尤为重要。通过活体成像，可在不牺牲动物的前提下，对细菌在周围组织及中枢神经系统中的增殖与播散进行长期动态评估。类似成像方法与技术此前已被用于癌症生物学与转移机制的研究^20,21。此外，尽管已有研究报道在新生大鼠E. coli感染过程中使用生物发光成像技术²²，但本研究将该方法应用于新生小鼠，并通过我们的实验体系实现了对小鼠败血症期间细菌动力学特征的评估。细菌的可视化依赖于动物体内细菌在不同波长下发射的生物发光信号（例如细菌荧光素酶活.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 胰岛素注射器	Coviden	1188128012	接种物或 PBS 注射
10% 中性缓冲福尔马林	VWR	89370-094	组织病理学
ACK 裂解缓冲液	Gibco	LSA1049201	细菌清除实验
动物纹身油墨膏	Ketchum	KI1482039	动物识别
绿色动物纹身油墨膏	Ketchum	KI1471039	动物识别
Anti-Ly-6B.2 磁珠	Miltenyi Biotec	130-100-781	细胞分离
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux（表达荧光素酶）	N/A	N/A	在西弗吉尼亚大学内部构建
E.Z.N.A. HP 总 RNA 提取试剂盒	Omega Bio-tek	R6812	RNA 提取
DPBS，1×	Corning	21-031-CV
Difco 胰蛋白胨大豆琼脂	Becton, Dickinson and Company	236950	细菌生长
IL-1β 引物/探针（Mm00434228）	Thermo Fisher Scientific	4331182	细胞因子表达 qPCR
IL-6 引物/探针（Mm00446190）	Thermo Fisher Scientific	4331182	细胞因子表达 qPCR
iQ Supermix	Bio-Rad	1708860	实时定量 PCR
iScript cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad	1708891	cDNA 合成
分离缓冲液	Miltenyi Biotec	N/A	细菌清除实验
IVIS Spectrum CT 及 Living Image 4.5 软件	Perkin Elmer	N/A	活体成像
LB 肉汤，Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	细菌生长
EASYstrainer（尼龙滤网）	Greiner Bio-one	542 040	细胞滤筛
SpectraMax iD3	Molecular Devices	N/A	酶标仪
研磨杵电动马达	Grainger	6HAZ6	组织匀浆
聚丙烯研磨杵	Grainger	6HAY5	组织匀浆
Prime 梯度 PCR 仪	Techne	3PRIMEBASE/02	cDNA 合成
TNF-α 引物/探针（Mm00443258）	Thermo Fisher Scientific	4331182	细胞因子表达 qPCR
TriReagent（GTCP）	Molecular Research Center	TR 118	RNA 提取