在革兰氏阴性菌中构建转座子插入文库用于高通量测序

摘要

我们描述了一种在革兰氏阴性细菌中构建饱和转座子突变文库的方法，以及随后为高通量测序制备DNA扩增子文库的步骤。以ESKAPE病原体Acinetobacter baumannii为例进行说明，但本方案适用于多种革兰氏阴性生物体。

摘要

转座子测序（Tn-seq）是一种强大的方法，结合了转座子诱变与大规模并行测序技术，可用于鉴定在多种环境条件下影响细菌适应性的基因和通路。Tn-seq 的应用广泛，不仅能够在个体生物水平上研究基因型-表型关系，还可扩展至群体、群落及系统水平。革兰氏阴性菌与抗菌耐药表型密切相关，导致抗生素治疗失败事件日益增多。抗菌耐药性定义为细菌在原本致死浓度的抗生素存在下仍能生长的能力。“最后一道防线”抗菌药物多粘菌素（colistin）常用于治疗革兰氏阴性菌感染。然而，包括Acinetobacter baumannii在内的多种革兰氏阴性病原菌可通过多种分子机制产生多粘菌素耐药性，其中部分机制正是通过 Tn-seq 技术得以阐明。此外，调控多粘菌素耐药性的信号转导通路在不同革兰氏阴性菌中存在差异。本文提出一种在A. baumannii中高效进行转座子诱变的方法，通过省去限制性内切酶消化、接头连接和凝胶纯化步骤，简化了饱和转座子插入文库及扩增子文库的构建流程。本文所述方法将有助于深入分析A. baumannii在多粘菌素压力下适应性相关的分子决定因素。该方案同样适用于其他革兰氏阴性 ESKAPE 病原菌，这类病原菌主要与耐药性医院获得性感染相关。

引言

抗生素的发现无疑是20^世纪最具影响力的健康相关事件之一。抗生素不仅能快速消除严重的细菌感染，还在现代医学中发挥着关键作用。重大手术、器官移植以及新生儿医学和化疗领域的进步使患者容易受到危及生命的感染，而这些治疗若无抗生素则无法实现^1,2。然而，人类病原体中抗生素耐药性的迅速发展和传播已显著降低了所有临床重要抗生素类别的疗效³。许多曾经通过抗生素治疗即可轻松清除的细菌感染，如今已不再对经典治疗方案产生反应，对全球公共卫生构成了严重威胁¹。抗菌耐药性（AMR）是指细菌细胞在原本致死浓度的抗生素环境中仍能生长，且不受治疗时间长短的影响^4,5。迫切需要深入了解调控AMR的分子与生化因素，以指导新型抗菌药物的研发。其中，ESKAPE病原体在临床环境中尤为棘手，并与广泛的抗菌耐药性相关。这些病原体包括Enterococcus faecium、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii

方案

1. 细菌菌株制备

1. 将“供体”菌株（E. coli MFD DAP^-/pJNW684，材料表）在添加了600 μM二氨基庚二酸（DAP）、100 mg/L氨苄青霉素和25 mg/L卡那霉素的Luria-Bertani琼脂平板上划线，以获得单菌落。37 °C过夜培养。挑取一个单菌落，接种于250 mL锥形瓶中的50 mL Luria肉汤（LB）液体培养基中，培养基中添加600 μM DAP、100 mg/L氨苄青霉素和25 mg/L卡那霉素，标记为“供体”。
2. 将“受体”菌株（A. baumannii 菌株 ATCC 17978，材料表）在Luria-Bertani琼脂平板上划线，以获得单菌落。37 °C过夜培养。挑取一个单菌落，接种于250 mL锥形瓶中的50 mL LB液体培养基中，标记为“受体”。
3. 将两种培养物（“供体”和“受体”）在37 °C条件下振荡培养过夜。

2. 细菌接合

1. 将过夜培养物转移至50 mL锥形管中。
2. 使用5,000 × g离心力离心收集受体和供体菌液 x g 7 分钟
3. 弃去上清液，将“供体”菌株沉淀重悬于35 mL添加了DAP的LB培养基中，以洗去残留的抗生素。
....

结果

所述方法描述了在高密度转座子文库的构建过程 A. baumannii 通过细菌接合使用菌株ATCC 17978 E. coli MFD DAP^-，该质粒复制了pJNW684质粒（图4B）。详细方案采用双亲本细菌接合方法，将pJNW684从供体菌转移至受体菌 E. coli λpir+ 供体菌株至 A. baumannii 受体菌株。这是一种高效且经济的方法，用于构建高密度的转座子突变文库。细菌按优化比例混合后，将接合反应液点种于Luria-Bertani琼脂平板上孵育1 h（图1A）。在接合过程中，转座子从供体菌株转移至受体菌株，并插入到基因组DNA（gDNA）中。图1B）。收集交配个体，约10个⁵ CFU/mL 进行计数，并涂布于添加卡那霉素的 150 mm × 15 mm 琼脂平板上.

讨论

A. baumannii 由于迅速获得针对多粘菌素等“最后一道防线”治疗药物的抗菌素耐药性，已成为全球公共卫生日益严重的威胁^{10,11,12,23,24,30,31}在近几十年中，Tn-seq 在阐明多种细菌物种中基因型与表型之间的相互作用方面发挥了关键作用，并拓展了我们对细菌遗传学的理解^34,35,42,43

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mM ddCTP，2’,3’-二脱氧胞苷-5’-三磷酸	Affymetrix	77112
100 mM dCTP，2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸	Invitrogen	10217-016
100 bp DNA Ladder 分子量标记物	Promega	PR-G2101
100 mm × 15 mm 培养皿	Corning	351029
150 mm × 15 mm 培养皿	Corning	351058
1× B&W	N/A	N/A	将 2× B&W 溶液稀释一倍得到 1× B&W。
2,6-二氨基庚二酸（2,6-Diaminopimelic acid）	Alfa Aesar	B2239103	使用浓度为 600 µM
2× B&W	N/A	N/A	将 2 M NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA（pH 7.5）溶于水中。与链霉亲和素磁珠联合使用。溶液于室温保存。
50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP / 0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	取 9.5 mL 100 mM dCTP、5 mL 10 mM ddCTP，加水至总体积 85.5 mL。-20°C 保存。
AccuPrimeTM Pfx DNA 聚合酶	Invitrogen	12344
鲍曼不动杆菌 Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS，KanS
氨苄青霉素（100 mg/L）	Fisher Scientific	BP1760	使用浓度为 100 mg/L
AMPure XP PCR 纯化系统	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 分析试剂盒	Agilent	5067-4626
脱氧核苷酸溶液混合物（dNTP）	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 磁力架	Invitrogen	12321D
大肠杆菌 E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP 营养缺陷型，需外源添加 600 mM DAP 才能生长。含有 RP4 转移机制，用于质粒转移。JNW68（36）的载体。
乙醇	Fisher Scientific	A4094
外螺纹冷冻管	Corning	09-761-71
玻璃珠	Corning	72684
甘油	Fisher Scientific	G33
接种环	Fisher Scientific	22-363-602	刮取工具
卡那霉素	Fisher Scientific	BP906	使用浓度为 25 mg/L
LB 琼脂，Miller 型	Fisher Scientific	BP1425
LB 肉汤，Miller 型	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	将 3 mM Tris-HCl、0.2 mM EDTA（pH 7.5）溶于水中。与链霉亲和素磁珠联合使用。溶液于室温保存。
裂解缓冲液	N/A	N/A	9.34 mL TE 缓冲液；600 µL 10% SDS；60 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）
苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1 混合液，pH 6.7/8.0，液体）	Fisher Scientific	BP1752I
磷酸盐缓冲液，10× 溶液	Fisher Scientific	BP39920	稀释至 1× 使用
Qubit 4 荧光计	Thermo Fisher	Q33238
Qubit 检测管	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher	Q32851
配备冷藏水浴的超声波破碎仪	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
链霉亲和素磁珠	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE 缓冲液	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl（pH 8.0）；1 mM EDTA（pH 8.0）
末端脱氧核苷酸转移酶（rTdt）	Promega	PR-M1875