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方法文章

在革兰氏阴性菌中构建转座子插入文库用于高通量测序

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DOI：

10.3791/61612

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2020年7月7日

 ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

本文内容

摘要

我们描述了一种在革兰氏阴性细菌中构建饱和转座子突变文库的方法，以及随后为高通量测序制备DNA扩增子文库的步骤。以ESKAPE病原体Acinetobacter baumannii为例进行说明，但本方案适用于多种革兰氏阴性生物体。

摘要

转座子测序（Tn-seq）是一种强大的方法，结合了转座子诱变与大规模并行测序技术，可用于鉴定在多种环境条件下影响细菌适应性的基因和通路。Tn-seq 的应用广泛，不仅能够在个体生物水平上研究基因型-表型关系，还可扩展至群体、群落及系统水平。革兰氏阴性菌与抗菌耐药表型密切相关，导致抗生素治疗失败事件日益增多。抗菌耐药性定义为细菌在原本致死浓度的抗生素存在下仍能生长的能力。“最后一道防线”抗菌药物多粘菌素（colistin）常用于治疗革兰氏阴性菌感染。然而，包括Acinetobacter baumannii在内的多种革兰氏阴性病原菌可通过多种分子机制产生多粘菌素耐药性，其中部分机制正是通过 Tn-seq 技术得以阐明。此外，调控多粘菌素耐药性的信号转导通路在不同革兰氏阴性菌中存在差异。本文提出一种在A. baumannii中高效进行转座子诱变的方法，通过省去限制性内切酶消化、接头连接和凝胶纯化步骤，简化了饱和转座子插入文库及扩增子文库的构建流程。本文所述方法将有助于深入分析A. baumannii在多粘菌素压力下适应性相关的分子决定因素。该方案同样适用于其他革兰氏阴性 ESKAPE 病原菌，这类病原菌主要与耐药性医院获得性感染相关。

引言

抗生素的发现无疑是20世纪最具影响力的健康相关事件之一。抗生素不仅能快速消除严重的细菌感染，还在现代医学中发挥着关键作用。重大手术、器官移植以及新生儿医学和化疗领域的进步使患者容易受到危及生命的感染，而这些治疗若无抗生素则无法实现1,2。然而，人类病原体中抗生素耐药性的迅速发展和传播已显著降低了所有临床重要抗生素类别的疗效3。许多曾经通过抗生素治疗即可轻松清除的细菌感染，如今已不再对经典治疗方案产生反应，对全球公共卫生构成了严重威胁1。抗菌耐药性（AMR）是指细菌细胞在原本致死浓度的抗生素环境中仍能生长，且不受治疗时间长短的影响4,5。迫切需要深入了解调控AMR的分子与生化因素，以指导新型抗菌药物的研发。其中，ESKAPE病原体在临床环境中尤为棘手，并与广泛的抗菌耐药性相关。这些病原体包括Enterococcus faecium、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa 和 Enterobacter spp.。尽管多种机制共同导致ESKAPE病原体的AMR，但后四种微生物属于革兰氏阴性菌。

革兰氏阴性菌会组装一种特有的外膜，以保护其免受不利环境条件的影响。外膜作为通透性屏障，可限制有毒分子（如抗生素）进入细胞。与其他生物膜不同，外膜具有不对称性：其外小叶富含暴露于表面的脂多糖，而内小叶则由多种磷脂组成6。脂多糖分子通过一个保守的脂质A基团锚定在外膜上，该基团嵌入脂双层中7。Escherichia coli 脂多糖的经典脂质A结构域对大多数革兰氏阴性菌的生长至关重要，其合成依赖于一个九步酶促通路，该通路是革兰氏阴性生物中最基本且最保守的代谢通路之一6,7,8。

多粘菌素是一类带正电荷的抗菌肽，可靶向脂多糖的脂质A区域，破坏细菌外膜并导致细胞裂解。多粘菌素所带的正电荷残基与脂质A磷酸基团的负电荷之间发生静电相互作用，从而破坏细菌细胞膜，最终导致细菌死亡9,10,11,12,13。黏菌素（多粘菌素E）是一种用于治疗多重耐药革兰氏阴性医院内病原体（如 Acinetobacter baumannii）所致感染的最后手段抗菌药物14,15,16。多粘菌素最早于1947年被发现，由土壤细菌 Paenibacillus polymyxa 产生17,18,19。在因临床报道存在显著的肾毒性和神经毒性而限制使用之前，多粘菌素曾被长期用于治疗革兰氏阴性菌感染20,21。

A. baumannii 是一种医院内感染的革兰氏阴性病原体，在近几十年来显著增加了患者的发病率和死亡率22。这种曾被视为低威胁性的病原体，如今因其极强的获得抗菌药物耐药性（AMR）的能力以及高流行风险，已成为全球范围内医院获得性感染的重要威胁23,24。A. baumannii 在美国导致的医院内感染占比超过10%。该菌可引发肺炎、菌血症、尿路感染、皮肤和软组织感染、脑膜炎以及心内膜炎等疾病表现25。由于对几乎所有抗生素类别（包括β-内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素类和氨基糖苷类）产生耐药，A. baumannii 感染的治疗选择已大幅减少23,24。多重耐药、广泛耐药以及全耐药 A. baumannii 分离株的流行使得多粘菌素（colistin）治疗重新受到重视，该药物曾被认为是仍对多重耐药 A. baumannii 有效的少数治疗手段之一。然而，A. baumannii 分离株中多粘菌素耐药性的增加进一步加剧了其对全球公共卫生的威胁10,11,12,13,27,30,31。

近年来，高通量测序技术（如转座子测序，Tn-seq）的进展为我们深入理解细菌在体外（in vitro）和体内（in vivo）的适应性提供了重要工具。Tn-seq 是一种强大的技术，可用于研究细菌中的基因型-表型相互作用。该技术广泛适用于多种细菌病原体，它将传统的转座子诱变与大规模并行测序相结合，能够快速定位插入位点，从而在全基因组范围内将DNA突变与表型变异关联起来32,33,34,35。尽管转座子诱变方法已有先前提及，但其基本步骤大致相似33。首先，通过转座子诱变构建一个插入文库，使群体中每个细菌细胞的基因组DNA（gDNA）内仅含有单个转座子插入。完成诱变后，将各个突变株混合成池。从插入突变体混合池中提取gDNA，扩增转座子连接区域，并进行高通量测序。测序所得的读段代表插入位点，可被比对至参考基因组。那些降低适应性的转座子插入会迅速从群体中消失，而具有优势的插入则会在群体中富集。Tn-seq 在推动我们理解基因如何影响细菌在应激条件下的适应性方面发挥了关键作用33。

编码在 pJNW684 中的 Himar1 mariner 转座子系统是专门为转座子诱变而构建并优化的。该系统包含一个 mariner 家族转座子，其两侧环绕着卡那霉素抗性基因，用于在 A. baumannii 中筛选转座子插入突变体。此外，它还编码一个 A. baumannii 特异性的启动子，驱动转座酶编码基因的表达36。基于 mariner 的转座子还在卡那霉素抗性基因下游包含两个翻译终止子，可防止插入位点下游的通读表达37。pJNW684 还携带一个 RP4/oriT/oriR6K 条件性复制起点，其复制依赖于供体菌株提供的 λpir 基因38。在缺乏 λpir 基因的情况下，携带转座机制的 pJNW684 载体将无法在 A. baumannii 受体菌株中复制10,36,38。因此，在细菌接合过程中，只有转座子被插入受体基因组，而携带转座酶基因的质粒本身不会发生背景插入。这一点非常重要，因为随着转座酶活性及质粒本身的丢失，只会发生一次稳定的转座事件，从而防止转座子在插入受体基因组后再次移动到其他位置。

pJNW648 还在另一种革兰氏阴性生物 E. coli 中测试了其活性。在 E. coli 菌株 W3110 中成功构建饱和的 Tn-seq 文库，表明该系统适用于在包括肠杆菌科在内的多种病原体中进行诱变。此外，驱动转座酶表达的 A. baumannii 特异性启动子可快速替换为其他物种特异性启动子。最后，可根据所研究生物的抗菌药物耐药（AMR）表型，将卡那霉素抗性基因替换为其他抗性盒。

导致多粘菌素耐药性的一个因素是 A. baumannii 给药剂量不足，导致细菌在非致死浓度下暴露于选择性压力之中39一些研究报告表明，亚抑制浓度的抗菌剂可诱导产生调控性反应，改变细胞生理状态，从而降低整个细菌群体的易感性11,12,30,31通过Tn-seq技术，我们发现了调控黏菌素耐药性的相关因子 A. baumannii 暴露于抑制剂后菌株ATCC 1797810 以及黏菌素的亚抑制浓度。本示例详细描述了一种Tn-seq方法，该方法简化了使用饱和转座子突变文库的构建与富集过程 mariner基于转座子的家族40,41虽然多种Tn-seq方案可产生20,000至100,000个突变株35,42,43,44,45,46，本文所述方案可快速构建包含超过400,000个突变体的转座子文库，相当于每10个碱基对插入一个转座子 A. baumannii10此外，文库规模可扩大而无需付出显著的额外工作量。该方法还无需使用限制性内切酶、接头连接和凝胶纯化步骤，从而避免了这些环节可能造成的文库最终多样性降低。

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方案

1. 细菌菌株制备

  1. 将“供体”菌株（E. coli MFD DAP-/pJNW684，材料表）在添加了600 μM二氨基庚二酸（DAP）、100 mg/L氨苄青霉素和25 mg/L卡那霉素的Luria-Bertani琼脂平板上划线，以获得单菌落。37 °C过夜培养。挑取一个单菌落，接种于250 mL锥形瓶中的50 mL Luria肉汤（LB）液体培养基中，培养基中添加600 μM DAP、100 mg/L氨苄青霉素和25 mg/L卡那霉素，标记为“供体”。
  2. 将“受体”菌株（A. baumannii 菌株 ATCC 17978，材料表）在Luria-Bertani琼脂平板上划线，以获得单菌落。37 °C过夜培养。挑取一个单菌落，接种于250 mL锥形瓶中的50 mL LB液体培养基中，标记为“受体”。
  3. 将两种培养物（“供体”和“受体”）在37 °C条件下振荡培养过夜。

2. 细菌接合

  1. 将过夜培养物转移至50 mL锥形管中。
  2. 使用5,000 × g离心力离心收集受体和供体菌液 x g 7 分钟
  3. 弃去上清液，将“供体”菌株沉淀重悬于35 mL添加了DAP的LB培养基中，以洗去残留的抗生素。
  4. 使用5,000 × g离心力离心收集“供体”菌株细胞 x g 7 分钟
  5. 弃去上清液，将“供体”菌株沉淀重悬于 4.5 mL 添加 DAP 的 LB 培养基中。使用 10 mL 血清移液管。
  6. 将重悬的“供体”菌株转移至含有沉淀“受体”细胞的“受体”菌株管中。使用步骤2.5中的同一支10 mL血清学移液管混匀菌液。立即进入下一步操作。
    注意：最终悬浮液的总体积应为 5 mL。
  7. 将交配悬浮液以每份100 μL的液滴形式分别滴加到添加DAP的LB琼脂平板上（每板5-7个液滴）图1A).
  8. 将培养板在室温下孵育30分钟。
  9. 在不扰动液滴的情况下，小心将培养板转移至37 °C培养箱中，使菌液交配1小时.
    注意：孵育时间超过1小时可能会导致姐妹突变体的产生。
  10. 孵育后，向每块平板加入1.5 mL LB培养基，用1 mL微量移液器重悬菌体以进行收集。最终体积应约为12–15 mL。
  11. 将收集的细胞合并至一个50 mL离心管中。
  12. 通过5,000 × g离心沉淀交配后的细胞 x g 7 分钟
  13. 弃去上清液，将细胞重悬于50 mL LB培养基中以去除残留的DAP。
  14. 通过5,000 × g离心收集交配产物 x g 7 分钟
  15. 重复洗涤步骤（步骤 2.13 和 2.14）。
  16. 使用10 mL血清移液管，将沉淀重悬于10 mL添加了25%甘油的LB培养基中。
  17. 使用洗涤后的细胞，在LB肉汤中进行五次连续的10倍梯度稀释（1:10、1:100、1:1,000、1:10,000、1:100,000）。
  18. 将每种稀释液各取 100 μL，用无菌玻璃珠分别涂布于 4 种不同的平板：含卡那霉素的 LB 琼脂、含氨苄青霉素的琼脂、含 DAP 的琼脂及仅含琼脂的平板。
  19. 37 °C 过夜培养平板。
  20. 将剩余的交配液按每份1 mL分装，于-80 °C保存。

3. 确定转座子文库的合适稀释度

  1. 记录过夜培养平板上的菌落形成单位（CFU）。
  2. 对每种不同平板条件的可计数菌落平板进行成像（图2A）。
    注意：“供体”和“受体”菌株均应在添加了DAP的琼脂平板上生长，因此大多数接种的稀释液将形成菌苔。只有“受体”菌株能够在琼脂平板上生长。无论是“供体”还是“受体”菌株，均不能在添加氨苄青霉素的琼脂平板上生长，因此应无生长或仅有极少生长。只有携带转座子插入的目标菌株细胞才能在添加卡那霉素的琼脂平板上生长。菌落大小应有所差异，表明转座子插入了影响在含卡那霉素琼脂上适应性的基因。
  3. 通过计数LB琼脂平板（添加卡那霉素）上的菌落数量，计算冷冻接合反应中转座子突变体的数量。
    注意：对于A. baumannii基因组（约4 Mbps），目标是获得约400,000个菌落，以构建高分辨率的突变体文库（约每10个碱基对插入一个转座子）。然而，该数量应根据目标物种的基因组大小进行优化。

4. 最终细菌突变文库的构建

  1. 将冻存的杂交菌液分装物置于冰上解冻。
  2. 根据步骤 3.1 计算出的 CFU 数值，将杂交菌液接种至含有卡那霉素的 150 mm LB 琼脂平板上。接种前用 LB 培养基调整体积，使每 150 µL 样品产生 13,333 个菌落。
    注意：此处测定的菌液浓度约为 105 CFU/mL，因此调整杂交菌液体积以确保每块平板获得 13,333 个菌落，这样可在 30 块平板上获得高分辨率突变文库所需的菌落数量，同时避免菌落过度密集。
  3. 使用无菌玻璃珠将 150 µL 稀释菌液均匀涂布于 30 块含卡那霉素的 150 mm LB 琼脂平板上，以获得总计 400,000 个菌落（图 1C）。
    注意：可使用无菌涂布棒或任何类型的无菌涂布工具（例如玻璃珠）将细菌均匀涂布于平板表面。
  4. 妥善处理盛有剩余杂交菌液的离心管。
    注意：反复冻融会增加细菌培养物的选择压力，可能导致 Tn-seq 实验结果出现偏差。每次操作应使用新鲜分装的菌液。
  5. 将平板置于 37 °C 培养 14 小时。
    注意：该培养时间已优化，以防止菌落过度生长（相互接触）。建议通过缩短培养时间来控制菌落生长程度。

5. 估算文库密度及用于储存的混合

  1. 计数每块平板上的菌落形成单位（CFU），以估算转座子文库中的总突变体数量。至少选取3块平板，计数其中20%的菌落，以推算所有平板的菌落总数（图2A）。确保菌落之间互不接触。
  2. 计算出预估的菌落产量后，向每块平板中加入3–5 mL LB培养基（如需要可更多），使用无菌刮菌工具刮下细菌。
    注：使用无菌接种环可高效刮取平板上的菌体。
  3. 将所有平板的细菌悬液汇集至50 mL锥形管中（图1D）。此过程需要多个50 mL锥形管，至少3个。
  4. 将汇集的细菌悬液在5,000 x g 条件下离心7分钟，收集菌体沉淀。
  5. 弃去上清液，并将沉淀重悬于5 mL添加了30%甘油的LB培养基中。
  6. 将转座子文库悬液以每管1 mL分装至冻存管中，于-80 °C保存。

6. 鉴定调控多粘菌素耐药性的因素 A. baumannii

  1. 准备4个250 mL的锥形瓶，每个瓶中加入50 mL LB液体培养基，并标记为（图2B）
    1. A. baumannii 菌株 ATCC 17978 Tn-seq 文库；(-) 多粘菌素_1
    2. A. baumannii 菌株 ATCC 17978 Tn-seq 文库；(-) 多粘菌素_2
    3. A. baumannii 菌株 ATCC 17978 Tn-seq 文库；(+) 多粘菌素_1
    4. A. baumannii 菌株 ATCC 17978 Tn-seq 文库；(+) 多粘菌素_2
      注：在此描述的挑战性生长实验中，每种条件——(-) 多粘菌素对照和 (+) 多粘菌素处理——均设置两个重复。因此，实验共需4个250 mL锥形瓶，每种条件使用两个。
  2. 向 (+) 多粘菌素组的锥形瓶（6.1.3 和 6.1.4）中加入50 µL浓度为0.5 mg/L的多粘菌素，向 (-) 多粘菌素组的锥形瓶（6.1.1 和 6.1.2）中加入50 µL水。
  3. 将步骤5中保存的冷冻Tn-seq文库分装样品置于冰上解冻。
  4. 用移液器将1 µL解冻后的文库加入1 mL PBS中。
  5. 测定600 nm处的光密度（OD600），并将读数乘以1,000。
    注：此步骤用于确定1 μL Tn文库的OD600值。
  6. 根据步骤6.5的计算结果，将每个含50 mL LB培养基的锥形瓶接种至终浓度OD600为0.001。
  7. 将培养物置于37 °C摇床培养箱中培养至OD600达到0.5。
    注：必须确保培养物始终处于对数生长期。若菌株在指数生长期的OD600值与此不同，则需调整目标OD600值，以确保培养物在对数生长期内尽可能多地完成分裂。理论上，若培养物仅分裂3次，则检测突变体适合度缺陷的能力最多只能识别3倍的差异。由于不同细菌的倍增时间不同，因此必须以固定的OD600值接种，以标准化初始接种量，从而确保所有培养物中Tn文库的代表性一致。
  8. 在4 °C条件下，以5,000 x g离心7分钟收集菌体。
  9. 弃去上清液，并用50 mL PBS洗涤一次。
  10. 在4 °C条件下，以5,000 x g离心7分钟重新收集菌体。
  11. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于1 mL PBS中，分装约200 µL至5个微量离心管中。
  12. 在4 °C条件下，以5,000 x g离心5分钟收集菌体，使用移液器吸头彻底去除所有上清液。
  13. 将菌体沉淀储存于-20 °C，或立即进行基因组DNA提取。

7. 基因组DNA提取

  1. 将一个细胞沉淀在冰上解冻。
  2. 加入 0.6 mL 裂解缓冲液（材料表），涡旋振荡以完全重悬沉淀。
  3. 在 37 °C 下孵育 1 小时。
  4. 向样品中加入 0.6 mL 苯酚/氯仿/异戊醇，剧烈涡旋振荡。
  5. 在室温下，使用微量离心机以最大转速离心 5 分钟，分离各相。
  6. 将上层水相转移至新离心管中。转移过程中避免扰动相界面。
  7. 向上一步获得的水相中加入等体积的氯仿，剧烈涡旋振荡。
  8. 在室温下，使用微量离心机以最大转速离心 5 分钟，分离各相。
  9. 将上层水相转移至新离心管中。
    注意：转移过程中务必避免扰动界面。
  10. 加入 2.5 倍水相体积的冰冷 100% 乙醇，轻轻混匀。此时可见 DNA 沉淀析出。
  11. 将离心管置于 -80 °C 下至少 1 小时。
  12. 在 4 °C 下以最大转速离心 30 分钟，沉淀 DNA。
  13. 小心移除上清液，避免扰动 DNA 沉淀，然后用 150 μL 70% 乙醇通过移液洗涤沉淀。
  14. 在 4 °C 下以最大转速离心 2 分钟，再次沉淀 DNA。
  15. 小心移除上清液。
  16. 重复步骤 7.14 一次，彻底移除残留的乙醇。
  17. 在室温下孵育 5–10 分钟，使 DNA 沉淀干燥。
  18. 用移液器将 DNA 沉淀重悬于 100 μL TE 缓冲液中。

8. DNA 剪切（图 3A）

  1. 用TE缓冲液将基因组DNA稀释至250 ng/mL的浓度，总体积为200 µL。
  2. 将离心管放入水浴超声仪中。
  3. 对DNA进行超声处理，以获得约300个核苷酸长度的片段。超声参数：功率60%，总时间20分钟，循环模式：开启10秒，关闭10秒，温度4 °C（图3A）。
  4. 取10 µL未剪切的DNA和10 µL已剪切的DNA，在1%琼脂糖凝胶上电泳，以确认DNA剪切效果是否合适。如需进一步优化，可重复超声处理或调整参数（图3B）。

9. 在3’末端添加Poly-C尾（图3A）

  1. 根据表1设置poly-C反应。
  2. 在37 °C下孵育反应1小时。
  3. 使用40 µL尺寸选择性顺磁珠对poly-C反应产物进行纯化（图3A），步骤如下：
    1. 向每个样品中加入40 µL尺寸选择性顺磁珠。涡旋约5秒或反复吹打混匀。
    2. 在室温下孵育样品5分钟。
    3. 短暂离心以使液体聚集于管底（约2秒）。
    4. 将管子置于磁力架上，在室温下孵育约2分钟，直至溶液澄清。
    5. 保持管子在磁力架上，小心移除上清液。
    6. 保持管子在磁力架上，加入200 µL新鲜配制的80%乙醇（勿扰动磁珠）。
    7. 孵育至少30秒，直至溶液澄清。
    8. 保持管子在磁力架上，小心移除上清液。
    9. 重复洗涤步骤（步骤9.3.6–9.3.8）。
    10. 通过短暂离心将液体收集至管底（约2秒）。
    11. 将管子转移至磁力架，去除残留液体。
    12. 在室温下孵育2–5分钟以干燥样品。切勿过度干燥。
    13. 从磁力架上取下管子，向每管中加入25 µL水。涡旋约5秒或反复吹打混匀。
    14. 短暂离心以使液体聚集于管底（约2秒）。
    15. 将管子转移至磁力架，静置约2分钟，直至溶液澄清。
    16. 保持管子在磁力架上，移除液体（勿扰动磁珠），并将液体转移至新管中（约23 µL DNA）。

10. 转座子连接区扩增（图3A）

  1. 按照 表1 所述设置第一次巢式 PCR 的 PCR 1（表2）。
  2. 使用 表1 中所述条件进行 PCR 1。
  3. 使用 40 μL 大小选择性顺磁珠纯化 PCR 产物（步骤 9.3.1 – 9.3.12）。用 50 μL 水洗脱（步骤 9.3.13 – 9.3.16）。此时样品可在 -20 °C 下保存。
  4. 准备链霉亲和素偶联的顺磁珠：
    1. 通过剧烈振荡重悬链霉亲和素磁珠。
    2. 将每份样品 32 μL 磁珠加入新的微量离心管中。
      注意：6 个以上样品的磁珠可在同一管中配制。
    3. 将管子置于磁力架上，孵育约 2 分钟，直至溶液澄清。
    4. 保持管子在磁力架上，移除上清液。
    5. 将管子从磁力架上取下，通过上下吹打，用 1 mL 1x B&W 缓冲液重悬磁珠以洗涤。
    6. 将管子放回磁力架，孵育约 2 分钟，直至溶液澄清。
    7. 保持管子在磁力架上，移除上清液。
    8. 重复步骤 10.4.5 – 10.4.7，用 1 mL 1x B&W 缓冲液再洗涤两次，共洗涤三次。
    9. 将管子从磁力架上取下，每份样品用 52 μL 2x B&W 缓冲液重悬磁珠。
  5. 将 50 μL 制备好的磁珠与 50 μL 纯化的 PCR1 产物（来自步骤 10.3）混合，用移液器吹打混匀。
  6. 室温下旋转孵育 30 分钟。
  7. 洗去未结合的 DNA：
    1. 短暂离心，使液体聚集于管底（约 2 秒）。
    2. 将管子置于磁力架上，孵育约 2 分钟，直至溶液澄清。
    3. 保持管子在磁力架上，移除上清液。
    4. 将管子从磁力架上取下，用 100 μL 1x B&W 缓冲液重悬磁珠，并上下吹打洗涤。
    5. 将管子放回磁力架，孵育约 2 分钟，直至溶液澄清。
    6. 保持管子在磁力架上，移除上清液。
    7. 重复步骤 10.7.4 – 10.7.6，用 100 μL LoTE 缓冲液再洗涤两次，共洗涤三次。
  8. 按照 表1 所述设置 PCR 2，以扩增转座子连接区域，并为每个样品添加单一标签（表2 和 表3）。
  9. 使用 表1 中所述条件进行 PCR 2。
  10. 使用 40 μL 大小选择性顺磁珠纯化（步骤 9.3.1 – 9.3.12），用 17 μL 水洗脱（步骤 9.3.13 – 9.3.16），收集约 15 μL。
  11. 使用荧光计测定 DNA 浓度。最终浓度应在 ~50 至 250 ng/μL 范围内。
  12. 使用基于芯片的毛细管电泳评估 DNA 质量（图4A）。

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结果

所述方法描述了在高密度转座子文库的构建过程 A. baumannii 通过细菌接合使用菌株ATCC 17978 E. coli MFD DAP-，该质粒复制了pJNW684质粒（图4B）。详细方案采用双亲本细菌接合方法，将pJNW684从供体菌转移至受体菌 E. coli λpir+ 供体菌株至 A. baumannii 受体菌株。这是一种高效且经济的方法，用于构建高密度的转座子突变文库。细菌按优化比例混合后，将接合反应液点种于Luria-Bertani琼脂平板上孵育1 h（图1A）。在接合过程中，转座子从供体菌株转移至受体菌株，并插入到基因组DNA（gDNA）中。图1B）。收集交配个体，约10个5 CFU/mL 进行计数，并涂布于添加卡那霉素的 150 mm × 15 mm 琼脂平板上.

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讨论

A. baumannii 由于迅速获得针对多粘菌素等“最后一道防线”治疗药物的抗菌素耐药性，已成为全球公共卫生日益严重的威胁10,11,12,23,24,30,31在近几十年中，Tn-seq 在阐明多种细菌物种中基因型与表型之间的相互作用方面发挥了关键作用，并拓展了我们对细菌遗传学的理解34,35,42,43

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（资助号：AI146829，授予 J.M.B.）的资金支持，特此致谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mM ddCTP，2’,3’-二脱氧胞苷-5’-三磷酸Affymetrix77112
100 mM dCTP，2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸Invitrogen10217-016
100 bp DNA Ladder 分子量标记物PromegaPR-G2101
100 mm × 15 mm 培养皿Corning351029
150 mm × 15 mm 培养皿Corning351058
1× B&WN/AN/A将 2× B&W 溶液稀释一倍得到 1× B&W。
2,6-二氨基庚二酸（2,6-Diaminopimelic acid）Alfa AesarB2239103使用浓度为 600 µM
2× B&WN/AN/A将 2 M NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA（pH 7.5）溶于水中。与链霉亲和素磁珠联合使用。溶液于室温保存。
50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管Fisher Scientific12-565-271
9.5 mM dCTP / 0.5 mM ddCTPN/AN/A取 9.5 mL 100 mM dCTP、5 mL 10 mM ddCTP，加水至总体积 85.5 mL。-20°C 保存。
AccuPrimeTM Pfx DNA 聚合酶Invitrogen12344
鲍曼不动杆菌 Acinetobacter baumannii ATCC 17978ATCCN/AAmpS，KanS
氨苄青霉素（100 mg/L）Fisher ScientificBP1760使用浓度为 100 mg/L
AMPure XP PCR 纯化系统BECKMAN COULTERA63881
BioAnalyzerAgilentG2939B
Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 分析试剂盒Agilent5067-4626
脱氧核苷酸溶液混合物（dNTP）New England Biolabs (NEB)N0447L
DynaMag-2 磁力架Invitrogen12321D
大肠杆菌 E.coli MFD Dap-N/AN/ADAP 营养缺陷型，需外源添加 600 mM DAP 才能生长。含有 RP4 转移机制，用于质粒转移。JNW68（36）的载体。
乙醇Fisher ScientificA4094
外螺纹冷冻管Corning09-761-71
玻璃珠Corning72684
甘油Fisher ScientificG33
接种环Fisher Scientific22-363-602刮取工具
卡那霉素Fisher ScientificBP906使用浓度为 25 mg/L
LB 琼脂，Miller 型Fisher ScientificBP1425
LB 肉汤，Miller 型Fisher ScientificBP1426
LoTEN/AN/A将 3 mM Tris-HCl、0.2 mM EDTA（pH 7.5）溶于水中。与链霉亲和素磁珠联合使用。溶液于室温保存。
裂解缓冲液N/AN/A9.34 mL TE 缓冲液；600 µL 10% SDS；60 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）
苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1 混合液，pH 6.7/8.0，液体）Fisher ScientificBP1752I
磷酸盐缓冲液，10× 溶液Fisher ScientificBP39920稀释至 1× 使用
Qubit 4 荧光计Thermo FisherQ33238
Qubit 检测管Thermo FisherQ32856
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo FisherQ32851
配备冷藏水浴的超声波破碎仪Qsonica SonicatorsQ2000FCE
链霉亲和素磁珠New England Biolabs (NEB)S1420S
TE 缓冲液N/AN/A10 mM Tris-HCl（pH 8.0）；1 mM EDTA（pH 8.0）
末端脱氧核苷酸转移酶（rTdt）PromegaPR-M1875

参考文献

  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478(2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263(1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24(1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503(2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28(2017).
  30. Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163(2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578(2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033(2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291(2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251(2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315(2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298(2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

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