小鼠全层皮肤缺损伤口愈合模型及组织形态计量学伤口分析

摘要

本方案描述了如何在小鼠身上制备双侧全层切除性伤口，以及如何随后对伤口进行监测、采集和处理，以进行形态计量学分析。文中还包括如何利用连续组织学切片精确定义、定量检测形态计量缺陷的详细说明。

摘要

小鼠切除性伤口模型已被广泛用于研究伤口愈合过程中依次重叠的各个阶段：炎症期、增殖期和重塑期。小鼠伤口具有组织学上定义清晰且易于识别的伤口床，便于对愈合过程的各个阶段进行量化测量。在该研究领域中，通常会任意选取伤口的“中点”进行组织学分析。然而，伤口是一个三维结构，且在组织学上往往并不对称，因此需要一种定义明确且稳健的定量方法，以检测具有较小效应量的形态计量学缺陷。在本实验方案中，我们描述了在小鼠身上制备双侧全层切除性伤口的操作步骤，并详细说明如何利用图像处理软件对选定的连续切片进行形态计量参数的测量。通过结合已知的切片间距，对伤口长度、表皮长度、表皮面积和伤口面积等二维测量值进行计算，进而推算出覆盖伤口的三维表皮面积、总体伤口面积、表皮体积和伤口体积。尽管这种详细的组织学分析比传统方法更耗时耗力，但其严谨性显著提高了在固有复杂的伤口愈合过程中发现新表型的可能性。

引言

皮肤伤口愈合是一个具有依次重叠阶段的复杂生物学过程。该过程需要协调在时间和空间上受到调控的细胞与分子事件，以恢复受损上皮的屏障功能。在第一阶段即炎症阶段，中性粒细胞和巨噬细胞迁移至伤口部位，激活局部和全身防御机制¹。增殖阶段紧随炎症阶段并与其部分重叠，成纤维细胞开始快速增殖并迁移至肉芽组织中。远离伤口前沿的角质形成细胞定向向伤口方向增殖，同时前沿处已分化的角质形成细胞迁移以实现伤口再上皮化²。最后进入重塑与成熟阶段，在此期间肉芽组织中的成纤维细胞开始合成并沉积胶原蛋白。新生基质的重塑与有序排列可在损伤后持续长达1年³。由于涉及多种细胞类型间相互作用的事件高度复杂且相互重叠，尽管已有多年研究，伤口愈合过程中许多细胞与分子机制仍尚未完全阐明。

小鼠模型是研究伤口愈合机制的主要哺乳动物模型，因其使用方便、相对成本较低且具有遗传可操作性^1,4,5。尽管已有多种类型的伤口在小鼠模型中被描述，但最常见的是切除性伤口（包括双侧打孔或直接打孔活检），其次是切开性伤口模型⁴。与切开性模型相比，切除性伤口模型具有明显优势，....

方案

所有实验均按照联邦法规以及爱荷华大学的政策和程序进行，并已获得爱荷华大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 动物与饲养

1. 使用毛囊处于休止期的8-10周龄所需品系的成年小鼠。
2. 手术当天，将小鼠分至清洁笼具中单独饲养，以尽量减少对伤口的干扰。

2. 手术

注意：无需维持无菌手术条件。尽管应在动物之间注意保持无菌，但打孔活检本身是在洁净但非无菌的表面上进行的。每只动物的手术持续时间为10至15分钟。

1. 麻醉
   1. 将动物置于诱导室中麻醉1-2分钟，异氟烷蒸发器的流速设为4-5%，氧气流量计设为每分钟1升。有关其他麻醉方案，请参见讨论部分。
   2. 在开始操作前确认麻醉效果充分。可通过牢固地捏压脚趾来判断麻醉深度。
   3. 将小鼠从诱导室转移至鼻罩，并将异氟烷流速降至1.5%，氧气流量计调至0.5 L/min。
   4. 由于操作时间超过5分钟，需在双眼涂抹眼用软膏。
   5. 使用加热垫维持小鼠正常体温。
2. 伤口部位准备
   1. 使用电动理毛剪沿尾侧向头侧方向，剃除小鼠肩部背部的毛发。若需制作两个以上伤口，可根据需要....

结果

图5展示了由不同外科医生在不同小鼠品系中制造的野生型伤口，经多位研究人员进行形态测量分析后所得的实测值与计算值的范围。如我们在本研究及文献中所述^9,10，不同品系的野生型小鼠可能表现出统计学上的差异。基于这些代表性结果，我们建议在同一项研究中仅使用同一品系的小鼠。尽管我们建议由同一名研究人员完成特定研究中的全部造模操作，但只要不同操作者在第0天所制造的伤口面积之间无统计学差异，也可由多名人员担任外科操作者。最后，由于本实验方案中描述的形态测量分析工作量较大，可由多名人员分别分析同一实验的部分数据，但前提是他们对两个样本的分析结果差异不得超过5%。然而，更理想的做法是由单一名研究人员以盲法方式完成所有伤口的分析，以避免偏倚。

图6 展示了一项荟萃分析，比较了按照本研究中所述方案获得的伤口测量数据¹¹ 通.......

讨论

双侧切除性伤口模型是一种高度可定制的实验方法，可用于研究伤口愈合的多种不同方面。在开展伤口愈合研究项目之前，研究人员应进行功效分析，以确定检测特定效应大小缺陷所需的伤口数量。目前文献中对于应将单只小鼠还是单个伤口作为生物学重复存在不一致，但最近一项研究表明，同一只动物身上的两个伤口之间不存在显著相关性⁴。这表明来自同一只动物的伤口彼此独立，可被视为生物学重复，从而减少检测缺陷所需的小鼠数量。当研究效应较小、需要大量伤口才能达到统计学显著性时，这一点尤为重要⁴。此外，功效计算的结果可能会影响每只动物身上制造的伤口数量，目前每只动物制作2个或4个伤口最为常见。

手术方案本身也具有高度灵活性。尽管我们推荐使用异氟烷挥发器进行麻醉，因为手术时间短且恢复迅速（每只小鼠约10–15分钟），但对于没有挥发器的实验人员，也可选用注射类麻醉剂，如氯胺酮/赛拉嗪或戊巴比妥钠。选择合适的镇痛药物尤为关键，因其与伤口愈合的炎症阶段密切相关。应谨慎使用非甾体抗炎药（NSAIDs），例如氟尼辛葡甲胺或美洛昔康，因为.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100% 乙醇
70% 乙醇
80% 乙醇
95% 乙醇
酒精预处理剂	NOVAPLUS	V9100	70% 异丙醇，无菌
氢氧化铵
活检垫片	Cellpath	22-222-012
黑色塑料板			大小约等于一张纸，质地坚硬但可操作
明场显微镜			具备数字成像功能和 4X 物镜
棉签
盖玻片			22 × 60 #1
牙科蜡片
数码相机			如适用，应包含标尺以显示比例
解剖分离针（直头）
包埋模具			22 × 22 × 12
包埋环	Simport Scientific Inc.	M460
伊红 Y
冰醋酸
毛发剪
加热垫	Conair		干湿两用加热垫
苏木精
切片机
切片机刀片
画笔
石蜡 Type 6
多聚甲醛
Permount
磷酸盐缓冲液（PBS）
聚维酮碘	Aplicare	82-255
组织处理盒	Simport Scientific Inc.	M490-2
剃须刀片	ASR		.009 常规规格
手术刀片 #10
手术刀柄
锋利的外科剪刀			无菌，用于手术
皮肤活检打孔器			尺寸由研究人员确定
载玻片盒
载玻片加热台
防脱载玻片	Fisher Scientific	22 037 246
温控水浴锅
组织包埋工作站			至少包括石蜡分配器和冷台
组织处理仪			至少包括带真空泵的烘箱
三重抗生素眼膏
镊子，弯头尖端			无菌，用于手术
镊子，锥形尖端			无菌，用于手术
WypAll X60	Kimberly-Clark	34865