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一种用于大规模表观遗传学研究的半自动化ChIP-Seq实验流程

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DOI：

10.3791/61617

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2020年8月13日

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1Division of Vaccine Discovery, La Jolla Institute for Immunology

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摘要

本文介绍了一种半自动化的微量染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）方案，该方案利用ChIP液体处理平台，针对与特定组蛋白修饰（H3K27ac）相关的DNA区域进行检测，随后采用标签化片段化（tagmentation）方法构建文库。该流程包含对产物质量和数量的质量控制评估步骤，且可适用于其他组蛋白修饰或转录因子的研究。

摘要

染色质免疫沉淀结合测序（ChIP-Seq）是一种强大且广泛应用的方法，用于分析与特定组蛋白修饰（如H3K27ac）相关的染色质DNA，从而帮助鉴定顺式调控DNA元件。传统的手动ChIP-Seq操作过程劳动密集、技术难度高，且通常需要大量细胞（>100,000个细胞）。本文所述方法有助于克服这些挑战。本文详细描述了一种完整的半自动化、微量化H3K27ac ChIP-Seq流程，包括细胞固定、染色质片段化、免疫沉淀及测序文库制备，适用于每批48个样本、细胞输入量少于100,000个细胞的实验条件。该半自主平台可降低技术变异、提高信噪比，并显著减少人工操作。该系统通过减小反应体积，减少酶、磁珠、抗体等昂贵试剂的使用量以及缩短人工操作时间，从而降低实验成本。这些对ChIP-Seq方法的改进，使其非常适用于对细胞数量有限的临床样本进行大规模、高重复性的表观遗传学研究。

引言

ChIP-Seq检测被广泛用于鉴定与特定组蛋白修饰相关的DNA片段，部分原因在于其能够识别顺式调控DNA元件，包括活性增强子、启动子、沉默子、异染色质等1,2,3,4全基因组范围内非编码调控区域的鉴定为深入理解健康与疾病状态下的基因调控机制提供了重要见解4. 实验室先前的研究已采用ChIP-Seq技术表明，cis-调控元件在不同细胞类型中可能发挥重要作用5转录因子（TF）ChIP 实验已被用于揭示与疾病相关风险的单核苷酸多态性6.

在人类临床样本中使用ChIP-Seq具有挑战性，主要受限于细胞数量或目标组织样本的获取。因此，该领域已集中努力改进并实现这些技术的微型化，从而催生了多种检测方法，例如CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12。该方法利用转座酶对特定抗体结合的基因组区域进行标签化和分离9。该技术已能将所需细胞数量减少至数千个，某些情况下甚至达到单细胞水平；然而，该技术在转化研究和临床应用中仍存在局限性，主要由于该方法需要使用活细胞9,12。活细胞的要求使得临床样本在操作上存在物流困难，并且如果样本未在同一时间处理，可能引入批次效应。其他研究者已针对甲醛固定的细胞优化了微型化技术，包括ChIPmentation11的开发，本文在此基础上以高通量方式加以改进。使用固定细胞可使样本在收集后储存，并在后续统一处理所有样本，从而最大限度减少批次效应。

本文介绍了一种半自动化的微量化 ChIP-Seq 检测方法，可显著减少实验操作时间，用于分析组蛋白修饰10。该半自动化方法支持高通量 ChIP-Seq 检测，使用 ChIP 液体处理仪可在短短 5 天内完成多达 48 个样本的全流程处理并准备测序，每个样本仅需 10,000 个细胞。该液体处理仪可自主完成免疫沉淀（IP）及后续洗涤步骤，有助于降低样本间的变异。该方法不仅将 48 个样本的手动操作时间减少超过 15 小时，还降低了技术重复性误差，使得针对原代细胞或培养细胞的大规模表观遗传学研究能够以可重复且高效的方式开展。本方案详细阐述了高质量 ChIP-Seq 实验从开始到结束的完整流程。即使特定仪器不可及，该方案仍可作为手动建立和排查 ChIP-Seq 实验问题的有用参考资源。

本实验使用了三种不同的人类原代免疫细胞和一种培养的细胞系（HUT78 – ATCC: TIB-161）。为便于理解，本方案分为七个部分：细胞固定、通过超声处理剪切染色质、自动化染色质免疫沉淀、DNA片段标签化建库、文库扩增、文库纯化，以及后续的DNA定量。缓冲液配方请参见补充表1。

方案

拉霍亚过敏与免疫学研究所（LJI；IRB方案编号 SGE-121-0714）的机构审查委员会（IRB）批准了本研究。在获得书面知情同意后，招募了健康志愿者并采集其白细胞分离样本。

1. 细胞固定

  1. 在15 mL离心管（悬液量 <10 mL）或50 mL离心管（细胞量10–30 mL）中，用完全细胞培养基将细胞悬液浓度调整至1至2 × 106 个细胞/mL。若细胞数 <1 × 106 个，使用1.5 mL离心管并加入0.5 mL培养基。
  2. 轻轻涡旋混匀细胞悬液，逐滴加入10倍浓缩的细胞固定缓冲液（1:10，体积比），室温（RT）低速旋转孵育10分钟。
  3. 再次轻轻涡旋以终止反应，按1:20（体积比）加入2.5 M甘氨酸。反复倒置离心管数次，并在冰上孵育至少5分钟。
  4. 后续步骤均在4 °C或冰上操作。在4 °C下以800 × g离心5分钟，弃去上清液。
  5. 用5 mL预冷的1× PBS轻柔重悬细胞沉淀，冰上孵育2分钟。
  6. 用1 mL预冷的1× PBS重复步骤1.4和1.5，然后将样品转移至预冷的1.5 mL离心管中（标记用于长期保存）。如适用，建议分装保存。
  7. 在4 °C下以1,200 × g离心，尽可能吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将沉淀在液氮中速冻，随后于-80 °C保存。
    注意：操作液氮时应采取适当防护措施。

2. 染色质剪切

注意：本方案适用于在 0.65 mL 低吸附离心管中对含有 0.3 至 3 × 106 个细胞的沉淀进行染色质剪切。

  1. 从 -80 °C 取出含有冷冻细胞沉淀的样品管，并置于干冰上保存，以避免在加入裂解缓冲液前细胞沉淀发生任何融化。此步骤至关重要。
  2. 向沉淀中加入 70 µL 新鲜的室温完全裂解缓冲液，于室温放置 1 分钟。
  3. 充分重悬沉淀 1 分钟，避免引入气泡，然后将细胞悬液在室温孵育 1 分钟，再将样品置于冰上。
  4. 将重悬后的沉淀转移至 0.65 mL 低吸附管中，并置于冰上。
    注意：为获得可重复的超声处理效果，在对样品进行超声前，应先使用空管运行超声仪 3–6 个循环以预热仪器。
  5. 将样品放入超声仪的管架中，并用装有 70 µL 水的平衡管填充空隙。在开始超声前，将样品在水浴中静置约 1 分钟。
  6. 根据细胞类型进行 x 个循环 的超声处理，每个循环为 16 秒开启 / 32 秒关闭。
    注意：此步骤需通过验证实验确定实现有效超声处理的最佳循环次数。
  7. 每完成 3 个循环后，将样品从超声仪中取出，轻轻涡旋并短暂离心，然后再放回管架中。确保管外壁无小液滴，以免产生气泡。
  8. 完成所需循环后，在 4 °C 下以 >14,000 x g 离心 15 分钟。将上清液转移至新的预冷低吸附 0.65 mL 管中，并置于冰上保存。
  9. 取部分超声处理后的样品进行解交联，以检测超声效率。
    1. 取 1–7 µL 上清液（相当于约 250 ng 剪切染色质）转移至 0.2 mL PCR 管中，用室温短期裂解缓冲液补足至 10 µL。
    2. 加入 1 µL RNase A，在 37 °C、800 rpm 条件下孵育 30 分钟，然后加入 1 µL 蛋白酶 K。
    3. 在 55 °C 摇床（1,000 rpm）中孵育 2 小时。
  10. 取 2 µL 解交联后的样品，使用荧光定量法进行 DNA 定量10（不推荐使用分光光度计，因为皂化物和降解蛋白可能导致结果偏差）。
  11. 将剩余样品在 1.2% 琼脂糖凝胶中以 70 V 电泳 1 小时。用核酸染料（1:20,000）染色，并使用紫外透射仪观察凝胶。
  12. 准备染色质储备液分装（用完全裂解缓冲液将样品稀释至 25 ng/µL，终体积 20 µL）。所有剪切染色质均应储存于 -80 °C。

3. 组蛋白修饰的自动化 ChIP-Seq

注意：本实验方案专为染色质免疫共沉淀（ChIP）液体处理仪设计。尽管该系统可使用定制缓冲液，但所有缓冲液均随ChIP试剂盒提供。本节中使用的含8个管的ChIP条板专用于ChIP液体处理仪。

  1. 从 -80 °C 取出含有 500 ng 剪切染色质的 16 个样品分装液（每份 20 µL），置于冰上缓慢解冻。完全解冻后，短暂涡旋振荡并瞬时离心。
  2. 染色质的制备
    1. 将 100 µL tC1 缓冲液（添加 1× 蛋白酶抑制剂和 20 mM 丁酸钠，即完全 tC1 缓冲液）移入两个 ChIP 8 孔管条中。
    2. 将每个染色质样品的 20 µL 转移至含有 100 µL 完全 tC1 缓冲液的 ChIP 8 孔管条的相应管中。通过向原染色质管中加入 80 µL 完全 tC1 缓冲液洗涤，并将洗液全部转移回 ChIP 8 孔管条的相应管中，最终体积为 200 µL。
  3. 抗体的制备
    1. 计算抗体体积，使每管中含有 0.5 µg 抗体。
      抗体体积 = (样品数 × 每反应抗体用量) / 抗体浓度
    2. 将计算好的抗体体积加入 500 µL tBW1 缓冲液中。迅速涡旋振荡并瞬时离心。
    3. 向两个 ChIP 8 孔管条的每管中加入 70 µL tBW1 缓冲液，再向每管加入 30 µL 抗体 + tBW1 混合液。每管总体积将达 100 µL。
  4. 磁珠的制备
    1. 充分涡旋重悬蛋白 A 磁珠溶液。针对 0.5 µg 抗体，取 5 µL 磁珠加入一组新的 ChIP 8 孔管条中，并瞬时离心。
  5. 在 ChIP 液体处理仪的最后一行放置已标记的空 ChIP 8 孔管条。 
  6. 按照 ChIP-16-IPure-200D 程序要求，将所有管条放置于 ChIP 液体处理仪中。将缓冲液置于正确位置，但使用 tW4 缓冲液代替 tE1 缓冲液。
    注意：合理安排时间，使 ChIP 液体处理仪可在夜间自动运行 ChIP 程序。16 个样品的程序运行时间约为 16 小时。至此，第一天实验结束。

4. 文库构建中用于文库接头转座酶整合

  1. 将恒温混匀仪预设至 37 °C 和 500 rpm。将用于 0.2 mL 管条的磁力架置于冰上预冷。
  2. 对于 16 个样本，在冰上配制 440 µL 标记化缓冲液。用移液器吸取 53 µL 至一条新的 8 孔管条中，并保持在冰上。
  3. 在一条新的 0.2 mL 8 孔管条中加入 220 µL 冷的 tC1 缓冲液，并置于冰上。该 8 孔管条可容纳此体积并仍能盖紧管盖。
  4. 从 ChIP 液体处理仪（第 12 行）中取出“IP 样本”管条，盖紧管盖后短暂离心。使用适用于 8 孔管条的磁力架吸附磁珠 2 分钟，小心移除上清液。
  5. 使用多通道移液器将 25 µL 标记化缓冲液转移至磁珠中，从磁力架上取下后轻轻吹打混匀，直至磁珠均匀悬浮（用设定为 20 µL 的移液器上下吹打约 5 次）。
  6. 盖紧管盖，将管条放入预热的恒温混匀仪中，孵育 3 分钟。延长孵育时间会降低文库构建效率。
  7. 将管条转移至预冷的金属架上，向每个样本中加入 100 µL 预冷的 tC1 缓冲液。将多通道移液器设定为 80 µL，吹打混匀至磁珠均匀分散，以终止标记化反应。
  8. 将样本重新放回 ChIP 液体处理仪，继续执行洗涤程序 Washing_for_IP-reacts_16_Ipure。确保使用 tC1 缓冲液洗涤两次，tW4 缓冲液洗涤两次。按照程序设定的布局完成洗脱步骤，使用缓冲液 tE1 进行洗脱。
  9. DNA 去交联
    1. 从 ChIP 液体处理仪最后一行取出 ChIP 8 孔管条，向每个样本中加入 2 µL RNase A。
    2. 盖紧管盖，短暂离心，用多通道移液器轻轻吹打使磁珠混匀至溶液均匀，然后重新盖紧管盖。
    3. 将样本置于恒温混匀仪中，在 37 °C、900 rpm 条件下孵育 30 分钟。
    4. 从恒温混匀仪中取出样本，加入 2 µL 蛋白酶 K。加入后按照步骤 4.9.2 的相同流程操作。
    5. 将样本在恒温混匀仪中于 55 °C、1,250 rpm 条件下孵育 4 小时，随后在 65 °C、1,000 rpm 条件下过夜孵育。
      注意：第 2 天操作至此结束。

5. 转座酶处理后DNA片段的纯化

  1. 用相应的样本编号标记十六个1.5 mL离心管，并向每管中加入400 µL DNA纯化试剂盒中的DNA结合缓冲液。
  2. 从温控混匀仪上取下8联管条，短暂离心以确保任何蒸发的产物均被收集。将8联管条置于8联磁力架上以捕获磁珠。
  3. 将100 µL解交联的DNA转移至每个1.5 mL离心管中。向8联管条中加入100 µL DNA结合缓冲液以洗涤磁珠，随后将洗涤液转移至对应的1.5 mL离心管中。
  4. 涡旋振荡约10秒，并对1.5 mL离心管进行短暂离心。
  5. 将含有DNA结合缓冲液和ChIP样品的600 µL溶液上样至离心柱中。 
  6. 在10,000 x g条件下离心20秒，收集穿流液并重新上样至同一离心柱。在相同条件下再次离心，随后弃去穿流液。
  7. 用200 µL洗涤缓冲液洗涤离心柱两次（离心条件同前一步），每次洗涤后弃去穿流液。
  8. 在12,000 x g条件下离心2分钟，以干燥离心柱。
  9. 将离心柱转移至新的1.5 mL收集管中，并直接向柱基质中加入9 µL预热至55 °C的温热TE缓冲液。室温孵育1分钟后，在10,000 x g条件下离心1分钟。
  10. 将9 µL洗脱液转移至对应的新的8联管条中。 
  11. 再次用8 µL TE缓冲液进行洗脱，操作同前。将洗脱液转移至对应的8联管条中（每样本最终体积为17 µL），并置于冰上保存。

6. 纯化样品的扩增与片段大小筛选

  1. 以下步骤使用qPCR来确定达到最佳扩增所需的循环数（CtD – Ct值测定）
  2. 通过将 CtD 混合缓冲液的成分乘以样本数量，为所有样本配制 CtD 混合液。
  3. 将3.6 µL CtD混合液加入qPCR板中，再加入1.4 µL片段化DNA样本（约占总体积的10%）。进行以下qPCR程序：98 °C预变性3 min，72 °C延伸5 min，98 °C变性30 s，随后进行26个循环：98 °C变性10 s，63 °C退火30 s，72 °C延伸30 s。
  4. 根据样本数量，将AMP Mix缓冲液的各组分按样本数倍量配制。向PCR板的各个孔中分别加入14 µL片段化DNA，然后向每个样本中加入2.5 μL的两种测序索引引物（25 μM），最终反应体系为50 µL。
  5. 使用多通道移液器混匀样品，并采用 CtD 中设定的扩增程序进行相应循环数的扩增。 
    注意：这是一个合适的暂停点，因为扩增后的样品可在 -20 °C 保存数周。然而，纯化步骤也可在同一天内完成。对于 48 个样品，步骤 3 至 6.5 分为另外两个独立批次完成，随后按以下说明在同一批次中进行扩增。
  6. 按照下述方法对经标签化（tagmented）的DNA进行扩增后纯化、片段大小筛选及定量。该步骤通常可处理48个样本（可根据需要处理更少数量的样本）。
    1. 向每个孔中加入90 µL磁性微珠（1:1.8比例），混匀，并在室温下孵育2分钟。
    2. 使用板式磁铁捕获磁珠，并弃去上清液。用200 µL新鲜的80%乙醇洗涤磁珠3次，注意不要扰动磁珠沉淀。
    3. 使用20 µL枪头在最后一次洗涤后去除多余的乙醇，并将磁珠静置干燥10分钟，或直至磁珠沉淀出现裂纹。
    4. 将培养板仍置于磁铁上，向每孔加入40 µL预热的水。密封培养板，充分涡旋振荡，然后短暂脉冲离心。 
    5. 将平板重新放回磁力架上捕获磁珠，并将40 µL洗脱液转移至新的“样品”板中。样品现已纯化，后续步骤将富集长度在200-1,000 bp范围内的片段。
    6. 可选的质量控制步骤：从样品中取出 4 µL 转移至质量控制板中，然后向样品中加回 4 µL 水。此步骤用于确定大片段所占的百分比。
    7. 加入22 µL磁性微珠（1:0.55比例）至样品中，轻轻混匀，室温孵育2分钟。
    8. 置于磁力架上捕获磁珠5分钟，将上清转移至“样本”板的7-12号孔。从磁力架上取下板，加入30 µL磁珠（终比例为1:1.3）。轻轻混匀，室温静置2分钟。
    9. 捕获磁珠5分钟，然后弃去上清液。  
    10. 将所有珠子用 200 µL 新鲜的 80% 乙醇洗涤 3 次，操作同前（步骤 6.6.2 – 6.6.3）。
    11. 待沉淀干燥后，仍在磁力架上时，向每孔加入8 µL预热的TE缓冲液以洗脱DNA。
    12. 将培养板从磁铁上取下，密封后充分涡旋。室温孵育2分钟，短暂离心，再将培养板放回磁铁上静置2分钟。将上清液转移至新的培养板（培养板2）。
    13. 为获得最大回收率，用额外8 µL预热的TE缓冲液重复洗脱。将样品加入相应的孔中，使每个样品的最终文库体积为16 µL。
      注意：此步骤结束时应得到两块板（若未完成质控板，则仅需一块）。质控板中应含有片段大小选择前的产物，第二块板应含有最终文库的48个孔（每孔16 µL，共48孔）。

7. 使用荧光检测法对最终文库和质控样本进行定量

  1. 使用荧光定量检测法或类似方法完成DNA定量。
  2. 如果已完成质控定量，则确定样本损失的百分比 < 1,000 bp。损失量不应超过约20%；若超过此范围，则可能存在磁珠比例使用不当的问题。
  3. 使用毛细管电泳仪测定各样品片段的大小。通过以下公式计算摩尔浓度：[文库浓度（ng/μL）× 106]/[660 × 中位片段大小（bp）])
    注意：文库已准备好进行等摩尔混合，并按照标准的下一代测序流程进行测序。

结果

作为概念验证，对六名人类供体的三种免疫细胞类型——初始CD4 T细胞（CD4）、经典单核细胞（MO）和自然杀伤细胞（NK）——进行了ChIP-Seq实验，这些细胞通过FACS分选富集，方法如前所述13。下述流程包括九个不同的步骤，如图1所示。

染色质免疫沉淀流程示意图，包含超声处理、测序等步骤
图1：实验流程总览。（A）整体实验流程示意图（使用BioRender生成）。（B）本实验方案所有主要步骤的流程图，以及每天所需的实际操作时间和总耗时估算。测序可在第5天结束时或之后进行，可进行多轮。时间线也可分散安排在整周内，例如可在一周内多次完成连续的第3至第4天步骤，以制备48个ChIP样品。请点击此处查看该图的放大版本

通过流式细胞术分离细胞后13，将分选的细胞进行离心，并按照上述方法固定和保存。待所有样本收集完成后，将样本分批进行裂解并准备染色质剪切，每批处理12个样本，操作步骤同上。针对每个样本，均完成达到最佳超声处理效果所需的循环次数10。定量测定以及剪切后染色质片段大小的检测结果表明，本方法在三组免疫细胞中均具有极好的可重复性（图2A）。不同的人类免疫细胞分别在不同批次中进行超声处理，结果高度一致：经过14个循环（每个循环超声16秒，间歇32秒）后，超过>70%的样本片段长度分布在100–500 bp范围内。若超声处理后样本中大片段比例较高（即100–500 bp范围内的片段<70%），则视为失败样本。此类样本可再进行1–2个额外超声循环，或予以弃用，并后续替换为另一细胞沉淀中的细胞。本方法中所有样本均无需额外超声处理，也无一被淘汰，表明该实验流程具有极高的稳定性与可靠性。

电泳、荧光图谱、DNA分析；CD4细胞、单核细胞、NK细胞比较示意图。
图2：测序前质量控制示例。（A）1.2% 琼脂糖凝胶显示了超声处理的可重复性。对6名供体的三种细胞类型进行超声处理：初始CD4 T细胞（CD4）、经典单核细胞（MO）和自然杀伤细胞（NK）。超声处理参数为14个循环（每个循环开启16秒，关闭32秒）。每份样品上样约200 ng去交联染色质至1%琼脂糖凝胶。若超过70%的片段大小在100–500 bp范围内，则认为样品质量合格。（B）上图——通过分析qPCR扩增曲线确定扩增的最佳循环数（Ct值定义为达到最大荧光强度一半时的循环数）。理想样品的Ct值约为15，扩增循环数可比测得的Ct值多2个循环。箭头所示为Ct值大于18的不合格示例。下图——展示一组Ct值大于18的较差样品示例，这些样品同时表现出较低的荧光强度。（C）左图——片段分析仪电泳图谱显示经扩增和片段大小选择后的最终标签化文库的分布情况。若超过85%的文库片段大小位于200–1,000 bp范围内，则视为合格样品。荧光信号峰值强度也被视为重要的质控参数；若信号过低，则样品测序效果可能不佳。右图——展示了CD4、MO和NK细胞中的合格样品示例。请点击此处查看该图的放大版本。

定量后，将样品在配备 H3K27ac 抗体的 ChIP 液体处理仪上进行操作，随后使用 Tn5 转座酶进行标签化（tagmentation）。为了通过 qPCR 确定合适的扩增循环数，取 10% 的标签化样品用于分析。在确定样品扩增所需循环数时，我们选择样品信号强度达到循环数测定平均最大值一半时所对应的循环数（图 2B）。测序后表现不佳的样品其 Ct 值通常超过 18，因此该 Ct 值可提示 ChIP 实验失败。这些样品在扩增后通常也获得较少的 DNA 量。对于起始细胞数为 100,000 的样品，Ct 值小于或等于 15 者为理想样品，Ct 值介于 15 至 18 之间的样品可接受，但在测序后结果一致性较差。对于起始细胞数少于 100,000 的样品，Ct 值通常在 15 至 18 之间，但无需超过 18 个循环即可获得足够用于测序的产物。

DNA转座子扩增后，对文库进行纯化和片段大小筛选，以获得适合下一代测序（NextGen sequencing）的理想片段分布，目标片段长度范围为200至1,000 bp。对每个文库的片段大小分布进行了评估，当超过85%的DNA片段长度处于200至1,000 bp范围内时，可获得最佳测序数据（图2C）。值得注意的是，由于上样时DNA用量相同（通过荧光定量测定），荧光强度较低的样本通常测序效果较差（图2C）。

测序完成后，根据ENCODE ChIP-Seq指南进行标准的质量控制5,14,15。

基因表达分析；显示CD4、MO、NK谱型及用于数据比较的相关性矩阵的图表。
图3：免疫细胞样本的可重复性。（A）每种细胞类型（CD4、MO和NK）中6名供体（每个重复100,000个细胞）的H3K27ac信号轨迹（UCSC基因组浏览器，最大强度，平滑函数为4，Y轴等比例缩放）。展示了四个代表性基因座，其中两个具有H3K27ac富集（IL2RA基因座和PTPRC），另两个无明显富集（CCR4和MS4A1）。（B）各供体之间的皮尔逊相关性，以及使用MEDIPS软件包中300 bp延伸和500 bp窗口生成的相应相关性图，针对每种细胞类型的重复样本进行分析16。（C）每种细胞类型合并后的供体文件，显示细胞类型特异性区域（CD4中的IL17R、MO中的CCR2、NK中的KLRC1）以及在所有细胞类型中均表达的看家基因B2M的H3K27ac信号轨迹（UCSC基因组浏览器最大强度，平滑函数为4）。请点击此处查看该图的放大版本。

为进行可视化质量控制，制备了用于在 UCSC 基因组浏览器中显示的 H3K27ac 富集轨迹。在四个基因位点上，每个样本的独立轨迹均显示出高比对质量和信噪比，反映出本实验的高度一致性和稳健性（图 3A）。左侧两个位点包含在这些细胞类型中高表达的基因，而右侧两个位点中的基因不表达，作为背景对照（图 3A）13。此外，采用 MEDIPS 分析软件包作为测序后分析变量，用于评估技术重复样本之间的相关性指数（图 3B）5,16,17，以建立 500 bp 窗口内读段富集水平的相关程度16。在大多数成对比较中，Pearson 相关系数显示相关性超过 90%，表明生物学重复样本之间具有高度一致性（图 3B）。将具有可接受相关性的重复样本合并，以提高信噪比。细胞类型特异性位点在相应细胞中显示出高度富集，而看家基因（B2M）则表现出非常一致的组蛋白修饰模式（图 3C）。在分析中，合并来自重复样本的轨迹可增强富集信号，强化特异性信号（包括重要的细胞类型特异性增强子），并降低人类样本固有的个体间变异性5。

尽管本研究使用了100,000个细胞，但在人源培养的T细胞系（HUT78）中，仅使用低至10,000个细胞也表现出高度的可重复性。对少于100,000个细胞的样本进行ChIP-Seq数据集的相关性分析显示，直至10,000个细胞仍具有高度的可重复性和相关性（图4A）。

基因分析、信号定量；A：比对图，B：重复实验图表，C：合并数据图。
图4：低起始量样本的可重复性。（A）HUT-78细胞（一种T细胞淋巴瘤细胞系）中H3K27ac ChIP-Seq在100,000至10,000个细胞范围内的重复性示例。图中轨迹（UCSC基因组浏览器，最大强度，平滑函数为4，Y轴等比例）显示IL4基因座区域。（B）使用MEDIPS软件包中的300 bp延伸和500 bp窗口计算重复样本间的皮尔逊相关性16。（C）使用与（B）相同的MEDIPS参数，不同细胞数量组（100,000、50,000和10,000个细胞）之间的皮尔逊相关性16。请点击此处查看该图的放大版本。

Pearson 相关性分析显示高度相关指数（83% 至 92%），表明在细胞数量较少的样本中信号得以保持。然而，随着细胞数量减少，背景信号升高，同时相关系数下降（图 4B）。为保持较低的背景信号，将技术重复样本合并，并在组间进行相关性检验（图 4C）。

10X 细胞固定缓冲液
化合物终浓度
甲醛溶液11%
NaCl100 mM
EDTA, pH 8.01 mM
EGTA, pH 8.00.5 mM
HEPES, pH 7.550 mM
完全裂解缓冲液
化合物终浓度
Tris-HCI, pH 8.050 mM
EDTA, pH 8.010 mM
SDS0.25%
丁酸钠20 mM
蛋白酶抑制剂混合物1X
短期裂解缓冲液
化合物终浓度
Tris-HCI, pH 8.050 mM
EDTA, pH 8.010 mM
SDS0.25%
片段化反应混合液
化合物终浓度
Tris-HCI, pH 8.010 mM
MgCl25 mM
N,N-二甲基甲酰胺10%
Illumina 片段化酶1:24 体积比
CtD 反应混合液
化合物每样本 (µL)
NextEra Index 引物 A (25 µM)0.275
NextEra Index 引物 B (25 µM)0.275
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix2.75
1:1000 SYBR Green 染料0.11
ROX 被动染料0.11
水加至 4 µL
AMP 反应混合液
化合物每样本 (µL)
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix27.5
水加至 31 µL

补充表 1：缓冲液配方。

补充表2：6名供体及每种细胞类型的Spearman和Pearson样本相关性。请点击此处下载该表格。

讨论

本文所述方法在ChIPmentation流程11的基础上进行了扩展，通过自动化和微型化操作，将原本在DNA纯化前实施的标签化（tagmentation）文库构建步骤进一步优化。自ChIP-Seq技术问世以来，所需细胞数量已大幅减少，从最初组蛋白研究所需的约2000万个细胞降至数百个乃至单个细胞1,7,10,12,18,19,20,21。这些新开发的方法显著提升了检测灵敏度，使得对稀有临床细胞群体的研究成为可能，从而加深了人们对细胞内cis-调控机制运作方式的理解5,6,12,17。例如，近年来较为流行的一种方法CUT&TAG，作为一种稳健且高灵敏度的ChIP-Seq替代方案9，因其Tn5酶共价结合于蛋白A，并能以高特异性识别ChIP抗体的Fc片段，从而产生优异的信噪比9。由于Tn5酶在未结合靶标抗体前不具备活性，其背景活性得以显著降低9。然而，该方法在临床环境中的应用受到限制，因其需要使用未经固定的活细胞。此外，在低渗性细胞核中释放DNA片段的过程可能对染色质结构造成不利影响，因该过程发生在检测过程中。必须使用新鲜活细胞这一要求，对于稀有临床样本以及大规模样本队列的研究构成了挑战，因为大规模队列的收集往往需要数年时间5。另一种方法drop-ChIP则巧妙地利用微流控装置，在进行ChIP处理前生成基于液滴的标签化反应19。然而，该方法依赖高度专业化的微流控设备，尽管能够实现单细胞ChIP-Seq，但仍局限于使用活细胞7,8,9,18,19。更新的一些基于ChIP-Seq的技术，如PLAC-Seq或HiChIP，致力于解析ChIP-Seq峰之间的三维（3D）相互作用22,23。这些3D方法令人振奋，因其正在揭示全基因组范围内cis­-调控元件或转录因子介导的相互作用，从而深化了人们对健康组织及疾病背景下特定细胞类型中基因表达调控机制的理解。

要使该实验方案成功，有几个关键步骤需要考虑，例如超声处理后染色质的质量以及抗体的质量。剪切效率至关重要，如果染色质未充分超声处理，实验效率将显著降低24。由于所需细胞数量较多，超声处理是ChIP-Seq中一个具有挑战性的环节。在本方案所使用的超声仪上，当细胞数量少于30万个时，超声效率显著下降。这在ChIP-Seq中是一个难题，因为低于该细胞数量时通常需要采用酶切法进行片段化，而酶切法的偏倚性更高。因此，超声处理成为真正实现微型化ChIP-Seq的主要限制因素。尽管已测试了其他超声平台和市售试剂盒用于染色质超声处理，但本方案所用的超声仪获得了最稳定且可重复的结果。该超声仪的另一优势在于无需购买专用超声管，从而在处理大量样本时降低了成本。为了实现最佳超声效果，首先，应按照前述方法预先预热超声仪。其次，在裂解细胞沉淀时，建议将移液枪头接触管底进行裂解，以通过更强的物理作用力打散细胞。第三，超声前若产生气泡，会影响样本被均匀超声的效果。如果在裂解过程中形成气泡，必须使用移液器将其去除。在不损失过多样本的前提下完成此操作具有一定挑战性，但若将枪头轻轻接触气泡，可缓慢吸取气泡而几乎不损失样本。最后，在确定超声循环次数时，应进行时间进程实验，即每进行三个循环，取出部分样本，纯化后在琼脂糖凝胶上电泳分析。应避免样本超声过度或不足，因为这会降低ChIP效率。若超声不足，较大的片段可能对ChIP-Seq结果质量产生负面影响24；反之，若超声过度，则目标表位可能在过程中丢失。

ChIP-Seq 的另一个关键因素是抗体的质量。在开展任何大规模研究之前，必须对抗体进行优化。优化的目标之一是获得基因组已知区域较高的信噪比，另一个目标是结果的可重复性。如果抗体产生大量背景信号，建议使用更大的起始样本量，或尝试不同批次/供应商的抗体。虽然这会在启动大规模实验前增加准备时间，但这是必不可少的步骤。为检测信噪比，建议采用 qPCR 方法，分别检测已知为该抗体靶向的基因组区域和已知不含靶点的区域。据观察，组蛋白修饰的信号通常比转录因子（TFs）更稳定，且更容易优化。

上述方案提供了一种在半自动化、微量化条件下进行高通量组蛋白修饰ChIP-Seq的可靠方法。该方法减少了人工操作时间，并提高了相对于手动ChIP-Seq的可重复性。实验室先前的研究在技术重复样本中采用手动ChIP，获得的Spearman相关性平均值为0.505；然而，使用半自动系统时，不同供体的自然杀伤细胞（NK细胞）之间的Spearman相关性平均达到0.66（补充表2），且操作时间减少了约40%。本文所述方法已针对组蛋白修饰（本文展示的是H3K27ac，但该方案应无需修改即可适用于其他组蛋白修饰）进行了优化，若用于转录因子（TF）ChIP-Seq，仅需进行少量调整。尽管抗体质量是关键因素，主要的调整可能在于超声破碎时间以及免疫沉淀（IP）过程中所使用的缓冲液。通常情况下，对于转录因子ChIP实验，染色质片段稍长可能效果更佳（片段长度范围约为350–800 bp），因为转录因子与DNA的复合物在剧烈超声处理下更难以维持完整6。此外，缓冲液也可能需要更换为定制混合液或其他商业化试剂盒中的缓冲体系，因为转录因子的行为可能与组蛋白修饰存在差异。

尽管自动化ChIP液体处理仪已测试可用于低至10,000个细胞的样本，但在染色质浓度较低时，其重复性明显下降。因此，不建议将本方案用于少于10,000个细胞的样本，而以100,000个细胞为最佳条件。本方案使用了行业标准的ChIP缓冲液，虽然增加了成本，但可获得更高质量的数据。本方案可根据超声条件进行调整（只要剪切后的染色质片段保持在相同范围内），缓冲液可根据免疫沉淀（IP）需求进行定制（可能需要优化），或选择不使用ChIP液体处理仪。本方案的一个局限性在于依赖ChIP液体处理仪，该设备投资成本较高，且每次最多只能处理16个样本。ChIP液体处理仪仅适用于小规模反应，不建议用于超过一百万个细胞的样本。然而，也可不使用该设备，通过手动完成免疫沉淀和洗涤步骤来实施本方案。若手动完成IP和洗涤步骤，实验耗时将增加，且重复性可能降低，但本指南对于开展高质量的ChIP-Seq实验仍具有重要参考价值。值得注意的是，其他液体处理仪也可经调整后用于半自动化ChIP反应。

总之，该系统的主要优势在于其高通量特性，因为免疫沉淀（IP）和洗涤步骤均可自动完成。因此，可连续进行多轮ChIP实验，最多可在5天内完成48个样本的全部处理并准备好测序，相较于手动操作的ChIP-Seq实验，所需人工操作时间显著减少。另一优势是提高了实验的可重复性，因为ChIP-Seq通常难以获得高度可重复的结果。其他方法要么需要活细胞，要么依赖复杂的微量移液系统，或完全依赖手工操作。该系统尚需针对低起始量样本（<10,000个细胞）进行优化，最终实现单细胞水平的ChIP反应。此外，该系统还可适配于较新的ChIP技术，如PLAC-Seq和HiChIP22,23。 

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Vijayanand实验室成员提供的技术支持和富有建设性的讨论，感谢Diagenode公司的Sharron Squazzo博士和Geoffrey Berguet先生在超声破碎仪、ChIP液体处理仪及相关实验方案方面提供的技术协助。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金资助，项目编号为AI108564、R01HL114093、S10RR027366（BD FACSAria II）和S10OD016262（Illumina HiSeq 2500）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
200 µl 管条（每条 8 管）＋管盖条DiagenodeC30020002用于IP Star的条状管；ChIP 8联管条
用于PCR纯化的AMPure XP贝克曼库尔特A63880SPRI 磁珠
Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock 微型离心管康宁MCT-060-C0.65 mL 低吸附管
Bioruptor Pico 超声波破碎仪DiagenodeB01060010实验室中使用的超声波破碎仪，但也可使用其他型号
ChIP DNA 纯化 &浓缩仪（带盖柱）Zymo ResearchD5205DNA纯化试剂盒
用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein A赛默飞世尔科技10001D
EDTA（0.5 M），pH 8.0，无RN酶赛默飞世尔科技AM9260G
EGTA pH 8.0Millipore SigmaE3889-25G
Eppendorf ThermoMixer CEppendorf2231000667
甲醛溶液Millipore Sigma252549-1L
甘氨酸Millipore Sigma50046-250G
H3K27ac 多克隆抗体 - 优质DiagenodeC15410196
HEPES（1 M）pH 7.5赛默飞世尔科技15630080
IDT 用于 Illumina Nextera DNA 独特双端索引Illumina20027213
Illumina Tagment DNA 酶和缓冲液小型试剂盒Illumina20034197
IP-Star全自动核酸提取纯化系统DiagenodeB03000002用于ChIP-Seq研究的自动化系统；ChIP液体处理仪
KAPA HiFi HotStart ReadyMix罗氏KK2601PCR反应体系
SX-8G IP-Star Compact 用中等试剂容器DiagenodeC30020003
MgCl2（氯化镁）（25 mM）赛默飞世尔科技R0971
N,N-二甲基甲酰胺Millipore SigmaD4551-250ML警告——低闪点
NaCl (5 M)，无RNase赛默飞世尔科技AM9760G
PBS（10倍浓度），pH 7.4ThermoFisher70011044
PCR 免封膜 8联管，带独立光学管盖USA Scientific1402-47008联管，0.2 mL 8联管条
蛋白酶抑制剂混合物Millipore SigmaP8340
蛋白酶K溶液（20 mg/mL），RNA级赛默飞世尔科技25530049
PureLink RNase A（20 mg/mL）ThermoFisher12091021
Quant-iT PicoGreen dsDNA 试剂ThermoFisherP7581用于荧光定量
QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统赛默飞世尔科技4485699qPCR
ROX 参比染料赛默飞世尔科技12223012
丁酸钠Millipore Sigma303410-100G
SYBR Gold 核酸凝胶染料（DMSO 中 10,000 倍浓缩液）赛默飞世尔科技S11494核酸染料
SYBR Green I 核酸凝胶染料 - DMSO 中的 10,000X 浓缩液ThermoFisherS7563
TE缓冲液赛默飞世尔科技12090015
提示（批量）DiagenodeC30040020IP Star 使用技巧
True MicroChIP试剂盒DiagenodeC01010130包含免疫沉淀（IP）和染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒所需的所有缓冲液
UltraPure 1M Tris-HCl，pH 8.0ThermoFisher15568025
10% UltraPure SDS 溶液赛默飞世尔科技24730020

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
Posted by JoVE Editors on 9/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. An author's name was updated.

The name was corrected from:

Pandurangan Vijayanad

to:

Pandurangan Vijayanand

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