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基于光电二极管的光学成像技术用于在非转基因无脊椎动物中以单神经元分辨率记录神经网络动态

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DOI：

10.3791/61623

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2020年7月9日

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1Cell Biology and Anatomy, Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Center for Brain Function and Repair, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种利用吸收型电压敏感染料和光电二极管阵列，在非转基因无脊椎动物物种中以单细胞分辨率成像神经元群体活动的方法。该方法可实现快速的工作流程，可在一天内完成成像与分析。

摘要

利用光遗传学手段记录并操控特定神经元群活动的转基因无脊椎动物模型的建立，为研究行为的神经基础带来了革命性进展。然而，这一进展的不足之处在于，容易使研究人员过度集中于极少数“设计型”模式生物（例如 C. elegans 和 Drosophila），可能对跨物种的比较研究造成不利影响，而后者对于揭示神经网络功能的普遍规律至关重要。本文展示了在非转基因腹足类物种的大脑中，如何利用电压敏感染料进行光学记录，快速（即在单次实验的时间尺度内）以单细胞分辨率揭示其神经网络功能组织的特征。我们详细阐述了实验室所采用的解剖、染色和记录方法，可在多种腹足类物种（包括一种神经科学领域的新物种——裸鳃类 Berghia stephanieae）的中枢神经系统中，于行为相关的运动程序期间，同时获取数十至约150个神经元的动作电位信号。成像使用吸收型电压敏感染料和一个包含464个光电二极管元件的阵列，采样速率达1,600帧/秒，足以完整捕捉所记录神经元产生的全部动作电位。每份样本可进行多次持续数分钟的记录，且几乎不出现信号漂白或光毒性。通过本文所述方法获得的原始光学数据，可进一步采用多种图示化方法进行分析。我们所采用的光学记录方法可便捷地用于多种非转基因物种的神经网络活动探测，因而特别适用于比较不同物种大脑如何产生行为的研究。

引言

无脊椎动物转基因品系（如 Drosophila 和 C. elegans）的发展为以光学手段检测和操控行为的神经基础提供了强大的研究系统。然而，这些特殊品系可能存在局限性，可能降低人们对非转基因物种神经环路研究的兴趣，尤其是在将新物种引入神经科学研究方面。仅专注于一两种模式生物不利于发现神经网络功能的普遍规律，因为比较研究是揭示此类规律的基本途径1,2,3,4。本文旨在展示一种大规模成像方法，以快速获取腹足类动物神经网络功能结构的深入认识，从而促进神经网络功能的比较研究。 

腹足类软体动物，例如 Aplysia，Lymnaea，Tritonia，Pleurobranchaea 以及其他生物长期以来被用于研究神经网络功能的原理，主要原因是它们的行为由位于神经节表面的大型、通常可单独识别的神经元介导，这使得  使其易于进行记录技术操作5.  20世纪70年代，人们开发出了可嵌入细胞质膜的电压敏感性染料（VSDs），这很快实现了对多个神经元产生的动作电位进行首次无电极记录6在此，我们展示了利用电压敏感染料（VSDs）在多种腹足类动物中检测神经网络活动的方法，其中包括一种首次应用于神经科学研究的物种。 Berghia stephanieae成像设备为一款商用的464元光电二极管阵列（PDA），采样速率为每秒1,600帧（图1），当与快速吸光度电压敏感染料结合使用时，可揭示所有记录神经元的动作电位7所有二极管记录的信号在采集后会立即显示，并叠加在PDA采集软件中神经节图像上，从而可在同一制备样本中利用尖锐电极对感兴趣神经元进行研究。8,9. 

在原始PDA数据中，许多二极管会冗余地记录较大的神经元，同时也有许多二极管包含来自多个神经元的混合信号。一个关键的突破是开发出一种基于独立成分分析的自动去峰分离方法 ，可快速将每个原始的464通道PDA数据集处理为一组新的信号轨迹，使得每个被记录的神经元仅出现在单独的轨迹中，且该轨迹仅包含其动作电位10,11。

本文概述了利用光电二极管阵列和快速吸收型电压敏感染料（VSD），从腹足类动物神经系统获取大规模动作电位记录的关键步骤。  此外，我们还展示了可用于对光学记录的神经元按其功能集合进行聚类与映射的分析方法，以及用于表征群体水平特征的方法——这些特征通常无法通过简单观察放电轨迹而被察觉12,13。

方案

注意：下述工作流程总结于图2中。

1. 减少振动

  1. 如果可能，确保装置位于建筑的底层，并使用基于弹簧的隔振台，其阻尼的振动频率范围比气浮台更宽。
  2. 若使用基于弹簧的隔振台，需确保其处于悬浮状态（每次在台面上添加或移除物品后均需重新调节）。
  3. 尽可能降低成像室内由振动引起的噪声，必要时甚至可在成像过程中关闭气流。尽量减少灌流系统中流体湍流引起的任何振动。
    注意：神经标本在数据采集过程中必须保持静止。任何形式的移动都会导致对比度边缘在光电二极管上发生位移，从而产生伪影信号。如果实验过程需要在数据采集期间施加刺激，则该刺激不得引起标本移动。

2. 运行针孔测试，以实现视网膜神经节细胞照片与PDA数据的正确对齐

  1. 在显微镜载玻片上放置一片带有三个小孔的铝箔。使用安装在齐焦摄影端口的数码相机拍摄这三个小孔的图像。
  2. 使用PDA配套的成像软件采集一段短时间文件（例如5秒）。在采集过程中轻敲实验台，以引入振动伪影，这些伪影将在针孔边缘周围非常明显，从而可以将针孔图像与光学数据精确对齐。
  3. 在成像软件中使用叠加功能（位于菜单项“显示 | 页面叠加 | 叠加迹线与外部图像 | 叠加图像”中），将光电二极管数据叠加到针孔照片上，然后迭代调整照片的x、y位置和放大倍数设置，直到针孔图像恰好与光电二极管数据中的针孔伪影完全重合。
    1. 保存这些参数，以便在后续实验中将相机拍摄的样本图像与光电二极管数据对齐。
      注意：PDA的针孔对齐仅需在PDA安装到显微镜后进行一次，除非PDA被旋转或移除，否则无需重复；若发生旋转或移除，则必须重新执行对齐。

3. 三种海洋腹足类物种的解剖

  1. 对于体型较大的物种，例如 Tritonia 和 Aplysia，应选用较小个体，因其神经节较薄且透明度更高，有助于获得足够的光线以实现最佳信噪比。
  2. 准备好经过过滤的人工海水，用于解剖和成像实验中的灌流液。
    注意：在本实验方案的所有后续步骤中，“灌流液”均指人工海水。
  3. Tritonia diomedea 的解剖
    1. 将动物置于冰箱中约 20 分钟以进行麻醉。
    2. 对于较大的动物，用手握住动物，使其头部悬于食指之上，暴露“颈部”以显露脑部；对于较小的动物，则先将其背侧朝上固定在涂蜡的解剖皿中，再暴露脑部。
    3. 使用解剖剪在动物背侧、口球上方（可通过体壁触摸到）做一条 3–4 cm 的正中切口。
      注意：所需中枢神经系统（CNS）部分由融合的双侧脑-足脑神经节和足神经节组成，呈橙色，外观上明显区别于周围组织；位于嗅角后方，紧贴口球上方。
    4. 使用镊子和显微解剖剪切断支配动物身体的神经，以分离CNS，同时保持连接中央神经节的所有神经完整。保留较长的足神经3（PdN3），或计划刺激的其他神经。
    5. 使用微细针将CNS固定在盛有灌流液、内衬弹性体的培养皿底部，用于进一步解剖。通过蠕动泵驱动的反馈控制式在线帕尔贴冷却系统向培养皿灌注灌流液，维持标本温度在 11 °C。
    6. 使用镊子和显微解剖剪小心去除CNS周围松散附着的结缔组织层，保留紧贴神经节的精细鞘膜。
    7. 将神经节短暂（约 10 秒）浸入含 0.5% 戊二醛的灌流液中。随后将神经节放回盛有灌流液并持续灌注的弹性体包被培养皿中，用灌流液冲洗去除戊二醛，再开始电压敏感染料（VSD）染色。
      注意：对结缔组织及其内在肌肉进行轻微固定有助于防止成像过程中组织移动。
  4. Aplysia californica 的解剖
    1. 通过腹面（足部）向约 40 g 的动物体内注射约 20 mL 的 350 mM MgCl2 溶液以实现麻醉。
    2. 使用固定针将动物腹侧朝上固定在涂蜡的解剖皿中。
    3. 使用解剖剪沿足部最前端做一条 2–3 cm 的正中切口。将切口两侧的足部组织瓣固定，以暴露部分中枢神经系统和口球。
      注意：所需中枢神经系统部分由融合的脑神经节以及紧密相邻的双侧足脑神经节和足神经节组成，呈黄橙色，外观上明显区别于周围组织；位于膨大的肌肉性口球的背侧及后外侧。
    4. 使用镊子和解剖剪小心剥离口球，暴露脑神经节。
    5. 使用镊子和显微解剖剪切断支配动物身体的神经以分离CNS，同时保持连接中央神经节的所有神经完整。保留较长的足神经9（PdN9），或计划刺激的其他神经。
    6. 使用微细针将CNS固定在盛有灌流液、内衬弹性体的培养皿中。通过使灌流液流经帕尔贴冷却装置，持续灌注以维持标本温度在 15–16 °C。
    7. 使用镊子和显微解剖剪去除CNS上多余的结缔组织，并剥离待成像神经节或神经节群表面部分鞘膜。操作时需格外小心，避免在鞘膜上造成破孔，否则会导致神经元外溢。
    8. 将神经节短暂（约 20 秒）浸入含 0.5% 戊二醛的灌流液中。随后将神经节放回盛有灌流液并持续灌注的弹性体包被培养皿中，用灌流液冲洗去除戊二醛，再开始电压敏感染料（VSD）染色。
  5. Berghia stephanieae 的解剖
    1. 将动物置于冰箱中约 20 分钟以进行麻醉。
    2. 在盛有室温灌流液的弹性体包被培养皿中，用微细针固定头部和尾部。
    3. 使用显微解剖剪在中枢神经系统（CNS）浅层背侧做一条 5–7 mm 的切口。
      注意：眼睛为位于动物体内、紧邻CNS的深色斑点，可方便地标记所需CNS部分的位置；该部分由双侧融合的脑-足脑神经节和足神经节组成，位于口球上方。
    4. 使用镊子和显微解剖剪切断支配动物身体的神经以分离CNS。保留用于刺激的神经足够长度，以便连接吸电极。

4. 使用电压敏感性染料对制备样本进行染色

  1. 配制 RH155（也称为 NK3041）或 RH482（也称为 NK3630 或 JPW1132）的储备溶液。
    1. RH155：将 5.4 mg 固体染料溶解于 1 mL 100% EtOH 中，用移液器将 29 µL 溶液分装至 34 个微量离心管中。将每根管子的管口暴露于空气中，在避光条件下过夜干燥。盖上管盖，将得到的 RH155 固体分装物（每份含 0.15 mg）置于 -20 °C 冰箱中保存。
    2. RH482：将 2 mg 固体染料溶解于 100 µL DMSO 中，将溶液分成 20 份，每份 5 µL，每份含 0.1 mg RH482，储存于 -20 °C 冰箱中。
      注：对于 Tritonia 和 Aplysia，可通过浴式灌流或压力法将电压敏感染料 RH155 加载到制备样本的神经元膜上。压力法的优势在于仅使被成像的神经节暴露于电压敏感染料。
  2. 若采用浴式灌流，向上述两份 RH155 固体分装物中各加入 5 mL 生理盐水，涡旋混匀，得到总体积为 10 mL、含 RH155 0.03 mg/mL 的混合溶液。
    1. 在避光条件下（防止光漂白）进行灌流，Tritonia 在 11 °C 下灌流 1 至 1.5 小时，Aplysia 在 16 °C 下灌流 1 至 1.5 小时。通过帕尔帖冷却系统调节灌流液温度，以维持所需实验温度。
  3. 若采用压力法，向一份 RH155 分装物中加入 500 µL 生理盐水，涡旋混匀，得到浓度为 0.3 mg/mL 的染料溶液。
    1. 使用手持式微量移液器吸取约 200 µL 溶液至聚乙烯管中，确保管径与待染色神经节的直径匹配良好。
    2. 使用显微操作器将管子末端小心放置于目标神经节上方，缓慢下放直至与神经节形成紧密密封。使用上述类型的冷却系统，使神经节保持在所需温度。
    3. 调暗室内灯光以避免光漂白，每隔 5 分钟转动一次微量移液器施加装置的旋钮，以推动更多染料作用于神经节。
    4. 在 30 分钟时检查染色效果，确认染色良好后继续染色，总染色时间约为 1 小时。
  4. 对 Berghia 进行染色时，向一份冷冻保存的 RH482 分装物中加入 1 mL 生理盐水，涡旋溶解。
    1. 取 200 µL 该溶液加入另一含有 800 µL 生理盐水的微量离心管中，涡旋混匀，最终得到含 0.02 mg/mL RH482 和 0.1% DMSO 的生理盐水染色溶液。
    2. 将整个中枢神经系统放入该微量离心管中，用铝箔包裹管子以避免光漂白，手动轻轻振荡，每隔 5–6 分钟一次，持续约 1 小时。将剩余的 800 µL 初始溶液保存于冰箱中，可在接下来的 3 天内用于后续样本的染色。

5. 展平标本并设置神经刺激

注意：本节中的步骤应在最小光照条件下或在绿光下进行，以尽量减少光漂白。

  1. 染色后，将中枢神经系统（CNS）浸入成像室中的生理盐水中，并置于解剖显微镜下。
  2. 在待成像的神经节或神经节群左右两侧放置硅胶块（用于Tritonia或Aplysia）或凡士林团块（用于Berghia）。
  3. 将适当大小的玻璃或塑料盖玻片压在样品上，使其展平。施压应充分但不可过重，以免损伤神经元。
    注意：通过此方式展平样品的凸面，可使更多神经元处于同一焦平面，从而增加可记录的神经元数量；此外，还有助于在成像过程中固定样品，减少移动。
  4. 若需刺激神经以诱发拟态运动程序，请预先制备一个前端尖端直径约等于神经直径的吸吮电极。具体方法为：将一段PE-100聚乙烯管在火焰上小心加热熔化，同时轻拉管段两端，形成锥形，随后在所需位置切断锥形部分。
    1. 将聚乙烯吸吮电极的锥形末端吸入少量生理盐水，再吸入待刺激神经的末端。操作时，将一段厚壁柔性聚合物管连接至电极后端，通过口吸施加负压。
    2. 确认电极内的生理盐水中无气泡，以免影响电传导。

6. 成像前的准备与优化

  1. 将记录室移至成像装置上。启动通过记录室的生理盐水灌流，并将温度探头放置在标本附近。根据所成像物种设定温度控制器的目标温度（Tritonia 为 11 °C，Aplysia 为 15–16 °C，Berghia 为 26–27 °C）。
  2. 将一根氯化银导线插入吸电极内，确保其与电极内的生理盐水接触，并将另一根 Ag-AgCl 导线（回路电极）插入浴槽中的生理盐水，靠近吸电极的位置。
  3. 将水浸物镜浸入生理盐水中。关闭基座光圈，然后上下调节聚光镜并调整焦距，直至光圈边缘清晰聚焦，形成科勒照明。
    1. 对标本中需要成像的区域进行聚焦。优先聚焦较小的神经元而非较大的神经元，因为即使略微失焦，较大神经元产生的光学信号仍较容易被检测到。
    2. 使用共焦数字相机拍摄待成像神经节的图像。
    3. 将控制面板的增益开关设置为 1x，通过点击成像软件中的 “RLI” 按钮检查静息光强度（RLI），并查看光电二极管的平均 RLI 值。调节刺激器发送至 LED 灯电源的电压，并持续监测平均 RLI 水平，直至其处于理想范围（通常约为 3–4 V）。
      注：PDA 上约 3–4 V 对应的高 RLI 值较为理想。光照越强，光学信号的信噪比越高，但需权衡高 RLI 下光漂白速度加快的风险。使用高数值孔径（NA）物镜可将此风险降至最低。所用水浸物镜规格分别为 10x/0.6 NA、20x/0.95 NA、40x/0.8 NA 和 40x/1.15 NA。
  4. 将控制面板的增益开关设置为 100x 以开始记录。
  5. 若需刺激神经，请使用独立于光源强度调节的刺激器，设定所需的电压、频率和持续时间。确认控制面板与刺激器之间的 TTL 触发信号已正确配置。
    注：各物种典型的神经刺激参数如下：Tritonia PdN3，2 秒，10 Hz 脉冲串，脉冲宽度 5 ms，电压 10 V；Aplysia PdN9，2.5 秒，20 Hz 脉冲串，脉冲宽度 5 ms，电压 8 V；Berghia 足神经，2 秒，10 Hz 脉冲串，脉冲宽度 5 ms，电压 5 V。
  6. 再次检查弹簧台或气浮台是否处于浮动状态。

7. 光学记录

  1. 关闭或调暗房间内的灯光，包括所有顶部的荧光灯。
  2. 在成像软件中设置所需的文件持续时间、路径和文件名，然后单击“采集数据”按钮，以采集最多占用计算机可用RAM容量的数据文件。在光学记录过程中保持静止，因为微小的振动可能在光学记录数据中引入显著的伪迹。
    注意：对于超出计算机可用RAM容量的采集任务，可通过乔治城大学的Jian-young Wu博士获取定制的C++采集程序。
  3. 采集完成后如需立即查看数据，请使用成像软件中的叠加功能，将464个二极管采集到的数据叠加到此前获取的神经节制备图像上7。单击软件中任一二极管的表示图标，可在独立的轨迹窗口中展开其记录结果。
    1. 通过输入此前由针孔测试确定的x、y坐标及放大倍率参数，实现二极管与制备样本之间的精确对齐。
    2. 为最大化动作电位的可见性并提高后续 spike-sorting14 的神经元信号产出率，使用成像软件中提供的5 Hz和100 Hz截止频率的带通Butterworth滤波器，以去除低频和高频噪声。
    3. 若要将滤波后的光学数据保存为文本文件，以便在科学计算平台中进一步分析，请首先在成像软件的“页”屏幕下方选中“TP滤波”复选框，然后在“输出”选项卡中选择“将页保存为ASCII”，并在弹出的对话框中输入所需的文件名。

结果

Tritonia
当Tritonia diomedea的皮肤接触到其海星捕食者时，会触发其逃避游泳行为，表现为一系列有节律的全身屈曲运动，从而推动身体远离危险（图3A）。在离体脑标本中，对同侧第三足神经（PdN3）施加短暂刺激即可诱发该行为的节律性游泳运动程序（SMP），该程序可在足脑神经节的光学记录中清晰识别。图3B展示了电压敏感染料（VSD）成像实验的布局，用于记录对侧（右侧）PdN3刺激诱发SMP时，左侧Tritonia足脑神经节背侧表面神经元的放电活动，其中光电二极管阵列（PDA）被放置于该神经节上方。图3C,D分别显示了在刺激PdN3前后及期间，由20个二极管记录到的原始信号和经滤波处理后的信号（带通巴特沃斯滤波器，截止频率为5 Hz和100 Hz）。神经刺激在2分钟记录文件的第20秒施加。采集完成后，成像软件可将记录阵列中全部464个二极管测得的信号以拓扑图形式叠加显示在标本图像上（图3E）。此时，许多记录轨迹中包含来自同一神经元的重复动作电位，部分轨迹则包含多个神经元的放电信号。通过对滤波后的二极管信号采用独立成分分析（ICA）进行峰电位分类，共分离出53个独立的神经元信号轨迹，其中30个如图3F所示。图3G放大展示了图3F中红框内的四个轨迹片段，可清晰观察单个峰电位的动力学特征；此前通过同时进行的尖锐电极细胞内记录已验证ICA峰电位分类算法的准确性，结果表明分类后的所有峰电位均对应于单个神经元的细胞内记录信号11,14。

Aplysia
对中国台湾产Aplysia californica施加强烈的厌恶性尾部刺激，会引发一种刻板的、由两个部分组成的节律性逃避反应15。该反应的第一阶段为“疾走”，表现为数次头部前冲与尾部回缩的循环动作，使动物快速向前移动。随后通常进入“爬行”阶段，通过头部至尾部方向的反复肌肉收缩波，以较慢速度持续前移数分钟（图4A）。为在光学记录中捕捉这些逃避运动程序，将PDA聚焦于离体脑标本右侧足脑神经节的背侧表面，并在对侧（左侧）足神经9（PdN9）上放置吸电极（图4B）。在持续20分钟的光学记录开始1分钟后（图4C），对PdN9进行刺激以诱发疾走-爬行运动程序序列。将81个记录神经元信号的概率性高斯空间分布映射到神经节上（图4D）。对完整记录数据进行降维分析显示，在主成分空间中，逃避程序的疾走相（青色）和爬行相（深蓝色）占据不同的区域，并分别形成螺旋状和环状轨迹（图4E）。

基于图4中Aplysia记录的三个视频展示了可对这类数据集进行的其他类型分析。视频1对整个记录期间所有被记录神经元的放电活动进行了动画演示。逃逸运动程序最初的刺激后阶段表现为一种“小跑”模式，其特征是神经节内不同功能簇的放电呈现交替性爆发（视频2）。随后，“小跑”过渡为“爬行”模式，此时神经元簇之间的活动总体仍呈相位性，但在神经节内呈现出逆时针旋转的活动轨迹（视频3）。后两个视频还整合了共识聚类分析，分别揭示了逃逸反应中小跑和爬行阶段不同功能神经集群的放电模式及其位置分布。需要注意的是，在小跑和爬行两个阶段中被归入同一聚类的许多神经元在神经节内彼此之间表现出明显的空间邻近性，这与先前的研究结果一致12。

Berghia
海蛞蝓 Berghia stephanieae （图5A）是一种神经科学领域的新模型系统。典型的 Berghia 实验成像装置如 图5B 所示。为了诱发大范围的神经元活动，在2分钟记录开始后30秒，将一个负压电极放置于最显著的左侧足神经上并施加神经刺激。独立成分分析（ICA）处理后的信号轨迹显示了55个神经元的自发性活动以及刺激诱发的活动（图5C）。通过共识聚类进行的模块检测识别出十个不同的功能神经元群，这些神经元群在 图5D 的网络图中展示，并在 图5E 中根据聚类分配结果对 图5C 所示的信号轨迹进行了重新排列。所有记录到的神经元信号的高斯分布叠加在样本图像上，如 图5F 所示，以标明全部55个被记录神经元的空间位置。

显微镜装置与用于光谱学的光电二极管阵列；包含齐焦相机和光纤。
图 1：光学成像系统与光电二极管阵列（PDA）示意图。（A）光学成像系统，包含PDA、数字相机、显微镜和载物台。（B）PDA的内部结构，其中光纤将成像孔径连接至464个光电二极管，光电二极管上方设有一排放大器。（C）成像孔径的六边形端面，待成像区域被聚焦于此。 请点击此处查看此图的放大版本。

视觉信号解剖过程；VSD成像示意图；步骤包括设置和计算分析。
图2：获取光学记录的关键工作流程示意图。该流程图展示了VSD成像实验方案中的关键步骤，涵盖从组织解剖与染色到成像细节的全过程。请点击此处查看该图的放大版本。

用于感觉分析的神经刺激记录、电极设置示意图及神经反应图
图3：结果来自 Tritonia diomedea，展示原始数据、滤波ed，以及经过峰电位分类的数据。 (A) Tritonia 逃离捕食性海星 Pycnopodia helianthoides 通过其游动实现，这种游动由身体的背侧和腹侧交替屈曲构成。B) 成像装置示意图。Ce = 脑足神经节的脑叶；Pl = 脑足神经节的足叶；Pd = 足神经节。C) 来自20个光电二极管的原始数据，显示对侧PdN3刺激（箭头所示）时左侧足部神经节的活动。D) 来自与上述相同二极管的过滤后数据 C （5 和 100 Hz 带通巴特沃斯滤波器）。E成像软件输出结果，其中由全部464个二极管采集的压缩信号在制备体图像上以拓扑方式叠加显示。这20个二极管信号轨迹所示位置的 C 和 D 用红色标出。F通过独立成分分析（ICA）进行峰电位分类生成的30条选定的单神经元信号轨迹。G四个单个神经元信号轨迹的放大视图，对应于红色方框区域 F，以更高的时间分辨率显示其动作电位。 请点击此处以查看此图的放大版本。

蜗牛运动分析；电生理记录示意图；神经活动图和PCA图。
图4：Aplysia californica 的实验结果，展示长时间记录、信号定位及降维分析。（A）Aplysia 逃逸运动程序的两个阶段：跳跃式移动（gallop）和爬行（crawl）。（B）成像系统的示意图。Ce = 脑神经节；Pl = 侧神经节；Pd = 足神经节。（C）右侧足神经节中81个神经元对同侧PdN9刺激（箭头所示）响应的20分钟记录。轨迹下方的绿色、青色和深蓝色条分别表示刺激前时期、逃逸运动程序中的跳跃式移动阶段和爬行阶段。（D）实验样本图像，显示通过独立成分分析（ICA）识别出的全部81个神经信号源位置的概率性高斯分布。绿色轮廓表示PDA六边形面相对于神经节的位置。每个高斯分布上的数字对应于（C）中的轨迹编号。（E）使用主成分分析（PCA）进行降维，绘制20分钟记录期间前三个主成分两两之间的关系图。刺激前基线期、跳跃式移动期和爬行期分别以绿色、青色和深蓝色表示。参见视频1-3，查看与此记录相对应的神经元放电动画。请点击此处查看该图的放大版本。

神经网络分析，连接图，电生理学，刺激反应，神经数据
图5：来自 Berghia stephanieae，一种用于神经科学的新物种，展示网络图谱与功能聚类，以及双侧信号映射. (AA 贝氏海蛞蝓 样本。 (B) 成像装置示意图。Ce = 脑侧足神经节的脑叶；Pl = 脑侧足神经节的侧叶；Pd = 足神经节；Rh = 触角神经节。 (C) 显示脑-足叶神经节中55对双侧神经元的自发活动及刺激诱发活动的记录（箭头指示刺激施加时刻）。D) 通过共识聚类识别出的十个功能集群，每个集群分配一种独特颜色，以网络图形式展示。该图中的节点代表神经元，节点在网络空间中的距离表示集群内及集群间放电相关性的程度。 (E) 图中所示的轨迹在 C 重新排列并按颜色编码（遵循颜色方案） D）形成功能性复合物。F) 显示每个记录神经元信号位置图谱及迹线编号的制备图像，以及 C 和 E 与其对应的 请点击此处以查看此图的放大版本。

视频 1： 完整20分钟动画 Aplysia 逃逸运动程序. 右足神经节中覆盖81个单个神经元的白色图形的不透明度由相应的神经元活动轨迹（右图）驱动，并随平均峰电位频率呈线性变化（以每0.61秒真实时间进行时间分段）。对于每个神经元，完全不透明度以其在整个记录期间的最大放电率归一化。视频中每1秒的播放时间代表12.2秒的真实时间。比例尺对应真实时间，轨迹下方的绿色、青色和深蓝色线条分别表示逃逸运动程序的刺激前基线期、快跑（gallop）和爬行（crawl）阶段。围绕快跑阶段及部分爬行阶段的黄色框标示了用于生成动画的记录片段 视频 2 和 3. 请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）

视频 2：Aplysia 逃跑运动程序“飞奔”阶段的动画演示。采用文献12中描述并公开的方法与软件，仅针对运动程序的飞奔阶段记录的全部 81 个神经元进行共识聚类分析，以确定功能神经元群。在本视频中，省略了在逃跑程序该阶段表现出明显紧张性或不规则放电模式的神经元群。属于黑色和橄榄绿色神经元群的神经元动作电位可在视频的音频轨道中听到，对应的神经元及其轨迹在视频中已高亮显示。平均放电频率的归一化处理方式与视频 1相同，并采用等效的时间分箱；视频中流逝的 1 秒对应实际时间的 6.1 秒。请点击此处观看此视频。（右键单击可下载。）

视频 3：Aplysia 逃逸运动程序爬行阶段的动画演示。仅针对运动程序的爬行阶段中记录的全部 81 个神经元进行共识聚类分析，以确定其功能神经元集群。在该运动程序阶段中表现为强直性或不规则放电模式的集群未包含在本视频中。平均脉冲频率的归一化处理方法与视频 1和视频 2相同，时间分箱也一致；视频中 1 秒的时长对应约 12.2 秒的实际时间。请点击此处观看该视频。（右键可下载。）

讨论

在实施我们的大规模电压敏感染料（VSD）成像方法时，最重要的细节之一是尽量减少振动，因为振动会导致对比度边缘在光电二极管阵列上移动，从而产生较大的伪影信号。由于基于吸光度的VSD信号在动作电位期间仅引起光强度的微小百分比变化，若不加以抑制，振动伪影可能完全掩盖感兴趣的神经信号。我们采用了多种方法来最小化振动伪影。首先，我们的成像实验室位于建筑的底层，使实验装置远离建筑通风设备及其他多种振动源。其次，我们使用基于弹簧的隔振台，其他PDA用户已证实其减振效果优于更常见的气浮隔振台16。第三，采用水浸物镜，以消除由液体表面波纹引起的图像波动。第四，将待成像的标本轻轻压在记录腔的盖玻片底部与上方的一小片盖玻片之间，上方盖玻片由硅胶塞或凡士林固定，从而进一步稳定标本。这种方法还可压平被成像神经节或多个神经节的凸面，使更多神经元处于物镜的焦平面上，从而增加可记录的神经元数量。

为了最大限度地提高因动作电位引起电压敏感染料（VSD）光吸收度极微小变化时的信噪比，必须使通过标本到达光电二极管阵列（PDA）的光照接近饱和，同时尽量减少染料的光漂白。为此，我们通常将静息光强设置为3–4 V，该值是在PDA控制面板增益开关处于1x位置时测得（PDA的464个放大器在10 V光照下达到饱和）。在数据采集期间，此增益因子会切换至100x。要使到达PDA的光强足够高，从而测得3–4 V的信号，可通过多种方式实现。首先，使用超亮LED光源，其发射波长应与所用吸收型染料的吸收特性相匹配。因此，我们采用了波长为735 nm的准直LED灯，该波长与RH155和RH482染料的最佳吸收波长范围重叠。其次，如有必要，使用可翻转的台下聚光镜，将LED光源的光线聚焦到更小的区域。第三，调节聚光镜高度以实现科勒照明（Köhler illumination），确保获得高而均匀的亮度以及最佳图像质量。第四，确保光路中未放置热滤光片，以免衰减LED灯的735 nm波长。第五，若需更强光照，可从光路中移除漫射片。第六，使用高数值孔径（NA）物镜，其不仅提供高空间分辨率，还能在较低光源强度下使足够光量到达PDA。这些措施使我们能够将光漂白降至最低，从而在同一标本上、使用相同光强连续获取多个持续10–20分钟的数据文件，且信号幅度无明显衰减，也无需重新染色。至关重要的是，若实验者希望在这些长时间记录中追踪同一神经元，必须确保焦平面不发生变化，且标本无移动。最后，另一种增加到达PDA光量的方法是使用更年轻的动物，因其神经节更薄，透明度更高。

有时我们会发现光信号的信噪比下降和/或运动程序节律不理想（例如过慢或异常）。当这种情况开始持续出现时，我们会重新配制新的电压敏感染料（VSD）溶液。VSD分装样品在-20 °C冰箱中通常可保持活性约6个月。此外值得注意的是，对于 Berghia，迄今为止使用吸收型VSD RH482获得的效果最佳。由于RH482比RH155更具脂溶性，它可能更有效地染色Berghia相对较小的神经元，或在该热带物种所用的较高记录灌流液温度下更稳定地保留在神经元膜中。

基于PDA的神经活动成像的一个局限性在于，电压信号在100倍预放大步骤之前的硬件中采用交流耦合（AC coupling）：尽管这种设计对于消除该技术所需高静息光强所产生的巨大直流偏移是必要的，但PDA固有的交流耦合会阻碍对膜电位缓慢变化的测量，例如与突触输入相关的电位变化。如果需要记录缓慢或稳态的电位变化，可采用直流耦合（DC-coupled）的CMOS相机成像系统来捕获亚阈值活动。Byrne及其同事最近使用RH155结合此类系统，对Aplysia腹神经节中的神经元活动进行了成像17,18。我们已使用过这两种系统，发现由于CMOS相机的探测器密度更高（128 × 128），在相同成像时间内产生的数据文件比PDA大50倍7。PDA较小的数据文件更有利于快速处理和分析，也使得长时间的单次试验记录（图4）以及学习相关研究成为可能——在这些研究中，多个试验的数据被连接成一个大型文件后再进行峰电位分类，从而能够在学习过程中持续追踪神经网络的组织变化19。

在其他基于相机的研究中，Kristan 及其同事曾使用荧光电压敏感染料（VSD）来研究水蛭节段神经节中的神经网络功能。在一项具有重要影响的研究中，这种方法帮助鉴定出一种参与动物决定游泳或爬行行为的神经元20。在另一项研究中，Kristan 等人探讨了水蛭的游泳和爬行行为在多大程度上由多功能神经回路与特化神经回路所驱动21。最近，Wagenaar 及其同事采用了一种双面显微镜进行电压成像，使其能够记录水蛭节段神经节中几乎所有神经元的活动22。与许多基于相机的成像方法相比，我们基于 PDA 的成像方法的一个优势在于，可通过独立成分分析（ICA）实现快速且无偏倚的动作电位分类；ICA 是一种盲源分离技术，在结果处理过程中无需对神经元边界做出人为判断。

关于电压敏感染料（VSD）的选择，吸收型染料RH155和RH482的一个优势是其几乎无光毒性23,24，因此可实现比荧光VSD更长的记录时间。此外，我们所使用的快速吸收型VSD非常适合记录腹足类动物标本中典型的幅值约为80 mV的超射性胞体动作电位。如图3G所示，我们的光学方法能够记录动作电位的负后电位（我们的所有记录均未进行迹线平均）：这表明我们使用的VSD应能分辨在其他模型系统中传播至胞体时已部分衰减、因而不再呈现超射特性的动作电位。然而，对于已知在胞体记录时动作电位高度衰减的物种，我们的光学方法可能并非理想选择。

当前许多关于神经网络的研究都集中在少数几种经过基因设计的转基因物种上。然而，神经科学的发展得益于对多种系统发育上不同的物种进行研究。通过研究多种不同物种，可以深入了解神经回路如何演化25,26，并揭示可能在不同门类之间普遍存在的网络功能原理1,2,3,4,27。迄今为止，我们已将成像方法应用于多种腹足类物种，包括 Aplysia californica8,11,12,13,14,28、Tritonia diomedea8,9,11,14,19,28、Tritonia festiva28、Pleurobranchaea californica（未发表数据），以及最近的 Berghia stephanieae（图5）。该方法的优势在于可轻松应用于多种物种，且无需使用转基因动物。我们希望指出，我们采用电压敏感染料结合光电二极管阵列（PDA）进行VSD成像的方法，继承了早期在半完整且具有行为能力的 Navanax29 和 Aplysia30 标本中实现此类成像的开创性工作。我们强调本方法的快速性，部分原因在于回应一种普遍担忧：许多研究人员可能因担心在探索神经科学领域广泛感兴趣的科学问题之前，需耗费数年时间来表征新物种的基本网络结构，而越来越不愿意启动针对新物种的网络研究31。因此，本文的目标是展示一种能极大加快研究进程的技术——其速度之快，使得从单个标本中即可在同一天内获得关于网络组织的重要见解。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国家科学基金会（NSF 1257923）和美国国立卫生研究院（NIH 1U01NS10837）资助。作者谨此感谢Jean Wang在实验室中的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
消色差0.9 NA摆动式聚光镜NikonN/A
双极温度控制器Warner InstrumentsCL-100 with SC-20控制灌流盐水温度
腔室温度计PhysitempBAT-12 with IT-18微探头
数字相机OptronicsS97808
解剖镊Dumont#5
解剖剪刀American Diagnostic Corp.ADC-3410Q
成像显微镜OlympusBX51WIF
成像灌流腔室SiskiyouPC-H
Instant OceanInstant OceanSS6-25一次可配制25加仑
Master-8脉冲刺激器A.M.P.I.Master-8
微量移液器Drummond Scientific3-000-752用于压力染色的染料施加装置
显微解剖剪刀Moria15371-92
微型固定针（0.1 mm）Fine Science ToolsNC9677548用于定位和稳定中枢神经系统
电动显微镜载物台ThorlabsGHB-BXGibraltar载物台
NeuroPlex成像软件RedShirtImagingNeuroPlex与WuTech光电二极管阵列兼容
物镜OlympusXLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340
PE-100聚乙烯管VWR63018-726用于制作吸吮电极的导管
灌流泵InstechP720 with DBS062SDBSU管路组件
凡士林EquateNDC 49035-038-54
带控制面板的光电二极管阵列WuTech Instruments469-IV光电二极管阵列订购信息请联系 jianwu2nd@gmail.com
RH155Santa Cruz Biotechnologysc-499432电压敏感性染料
RH482Univ of Conn. Health CenterJPW-1132电压敏感性染料；向Leslie Leow特别订购
硅胶耳塞Mack's型号7用于制备时的压缩
染色用PE导管VWR63018-xxx根据适配情况选择不同尺寸
Sylgard 184硅橡胶弹性体套件Dow CorningSylgard 184硅橡胶弹性体套件
Thorlabs LED光源及驱动器ThorlabsM735L2-C1, DC2100LED灯及驱动器
Tygon导管Fisher Scientific14-171-xxx
振动隔离台Kinetic SystemsMK26基于弹簧的隔离系统

参考文献

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基于光电二极管的光学成像技术用于在非转基因无脊椎动物中以单神经元分辨率记录神经网络动态
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