本方案提供了用于可视化囊性纤维化患者痰液中细菌细胞及多糖合成位点（Psl）多糖的方法。
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摘要
摘要
早期检测与根除 铜绿假单胞菌 囊性纤维化患者肺部内的慢性感染发生几率可能因此降低。慢性感染的形成 P. aeruginosa 感染与肺功能下降及发病率升高相关。因此，阐明无法彻底清除感染的原因备受关注 P. aeruginosa 使用抗生素治疗时发生的情况，在约10-40%的儿科患者中出现。诸多可能影响宿主清除能力的因素之一是 P. aeruginosa 抗生素敏感性的差异与空间结构（如聚集或生物膜形成）以及多糖产生有关。因此，我们希望对这些现象进行可视化观察 原位 特征 P. aeruginosa 在中国台湾患者的痰液中。将痰液样本包埋于水凝胶基质中以保留其相对于宿主细胞的三维结构，随后应用组织透明化技术。组织透明化后，加入荧光标记物和染料以实现可视化。荧光 原位 杂交用于可视化细菌细胞，荧光标记的抗Psl抗体结合用于可视化胞外多糖，DAPI染色用于标记宿主细胞以获得结构信息。这些方法实现了高分辨率成像 P. aeruginosa 通过共聚焦激光扫描显微镜在囊性纤维化患者痰液中进行检测。
引言
本研究设计了实验，旨在可视化囊性纤维化（CF）患儿痰液中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的体内结构。P. aeruginosa 感染在30–40%的儿科CF患者中会转为慢性；一旦慢性感染建立，几乎无法根除1。来自早期感染患者的P. aeruginosa分离株通常对抗微生物药物更为敏感，因此常采用抗假单胞菌抗生素治疗，以预防慢性感染的建立2。然而，并非所有P. aeruginosa分离株在抗生素治疗后都能被有效清除。导致抗生素治疗失败的具体机制尚未完全阐明。既往研究表明，生物膜细胞密度、聚集程度以及多糖产生的变化均可能影响抗生素的疗效3。P. aeruginosa 可产生三种胞外多糖：Pel、Psl和藻酸盐（alginate）4。大多数P. aeruginosa菌株在遗传上具备表达这三种胞外多糖的能力，但通常以其中一种多糖为主导表达形式5。胞外多糖藻酸盐与CF患者肺部的慢性感染相关，可导致黏液型表型的出现6,7。多糖Pel和Psl具有多种功能，包括....
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方案
采集和储存人类受试者的痰液样本需获得研究伦理委员会（REB）的批准。本文所述研究已获病童医院研究伦理委员会（REB#1000058579）批准。
1. 痰液采集
- 将咳出的痰液置于无菌收集杯中，并在固定前立即于4 °C下保存，最长不超过24小时。
注意：痰液在4 °C下放置过久而不进行固定可能导致细胞降解，尤其是白细胞的降解。建议尽快进行固定。 - 将痰液样本转移至无菌的15 mL离心管中。
- 向痰液样本中加入等体积的4%多聚甲醛（PFA）。例如，若痰液样本为0.5 mL，则加入0.5 mL的4% PFA。通过轻柔颠倒混匀。
- 将痰液在4 °C下孵育过夜。
- 向每2 mL固定后的痰液中加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗涤。
注意：此洗涤步骤无需离心。 - 用移液器小心吸除上清液。
注意：为避免吸入痰液，应将移液器吸头远离痰液沉淀，缓慢吸取表面液体。该洗涤步骤不进行离心，以保持痰栓结构的完整性。 - 重复步骤1.6–1.7两次。
- 用含0.01%（w/v）叠氮化钠的PBS重悬沉淀物，体积为原痰液体积的2倍。
- 将痰液在4 °C下保存。
2. 痰液的MiPACT（组织透明化技术）处理
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结果
实验的整体设计总结于图1和图2中。图1概述了痰液处理与组织透明化流程。痰液处理和透明化过程最长可能需要17天。不过，该流程可在多聚甲醛（PFA）固定后（第2天）或组织透明化完成后（第5–17天，具体取决于透明化时间）暂停，样品可在此期间储存。图2总结了荧光原位杂交（FISH）和抗体结合流程。FISH与抗体染色流程需4天完成，一旦开始应连续完成，并及时采集共聚焦图像。通过上述流程，可获得P. aeruginosa细胞的高分辨率三维图像，并可视化其在痰液中的原位结构。
痰液的清除以及本方案中所用荧光染料的后续应用，可实现对目标结构的详细可视化观察 P. aeruginosa 在样本内。所示痰液样本 图3 和 图4<.......
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讨论
本实验方案的目的是观察囊性纤维化（CF）患者痰液中P. aeruginosa细胞的原位组织结构。若无法立即固定，痰液样本应于4 °C保存。已有研究表明，若在4 °C条件下保存，痰液中P. aeruginosa的细胞数量在1小时、24小时或48小时处理时均无显著变化；但若在25 °C下放置24或48小时，由于细菌生长，细菌细胞计数将显著增加14。在本研究中，痰液样本在咳出后最多于4 °C保存24小时。需要注意的是，已有研究显示，若痰液在4 °C保存并延迟超过9小时处理，其中的炎性细胞计数会下降15。因此，在确定样本处理的截止时间时，必须考虑希望在痰液中观察的特定细胞类型和标记物。
本方法中的样本处理首先使用4%多聚甲醛（PFA）固定痰液样本。多聚甲醛可交联细菌细胞及其胞外基质，从而保持其结构，便于显微观察与分析11,16。然而，如果目标是.......
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致谢
作者感谢囊性纤维化基金会为本研究提供的资助，以及MedImmune慷慨捐赠的抗Psl0096抗体。本研究的成像工作在多伦多大学的CAMiLoD成像中心完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 29:1 丙烯酰胺-双丙烯酰胺，30% 溶液 | BioRad | 161-0146 | |
| 8 孔腔室盖玻片 Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen 2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell 灌注腔室 | Electron Microscopy Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA RNase 抑制剂 | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | 订购详情：产品：修饰DNA寡核苷酸；名称：PseaerA；序列：[Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC；合成量：50 nmol；纯化方式：HPLC；运输状态：全产量（干粉） | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | Psl0096-Texas Red 抗体由 Medimmune 慷慨提供，订购咨询需联系该公司。 | |
| VA-044 硬化剂 | Wako | 27776-21-21 |
参考文献
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
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重印与许可
