方法文章

利用RNA-seq研究分子进化与基因表达的生物信息学分析流程

DOI：

10.3791/61633

⸱

2021年5月28日

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

本文内容

摘要

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本实验方案的目的是利用RNA测序数据研究候选基因的进化与表达。

摘要

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整理和报告大规模数据集（如全基因组或转录组数据）通常是一项艰巨的任务。一种分解结果的方法是聚焦于一个或多个对研究生物体和研究主题具有重要意义的基因家族。在本实验方案中，我们概述了用于构建系统发育树并量化目标基因表达水平的生物信息学步骤。系统发育树有助于揭示基因在种内和种间的进化模式，并可推断直系同源关系。结合RNA-seq数据，可进一步比较这些基因在不同个体或组织中的表达情况，从而增强分析结果。分子进化与表达研究能够揭示基因在不同物种间的进化模式及其功能保守性。对一个基因家族的表征可为后续研究提供基础，并可在新发表的基因组或转录组研究论文中突出一个重要基因家族的存在与意义。

引言

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测序技术的进步促进了非模式生物基因组和转录组的测序。除了从多种生物中测序DNA和RNA的可行性不断提高外，大量公开可用的数据也为研究目标基因提供了便利。本实验方案的目的是提供一系列生物信息学步骤，用于探究可能在目标生物中发挥重要作用的基因的分子进化与表达特征。

研究一个基因或基因家族的进化过程，可以为生物系统的演化提供重要见解。基因家族的成员通常通过识别保守基序或同源基因序列来确定。以往对基因家族进化的研究主要利用远缘关系的模式生物基因组进行1。这种方法的一个局限性在于，尚不清楚这些基因家族在近缘物种中的演化过程，以及不同环境选择压力所起的作用。在本实验方案中，我们纳入了在近缘物种中搜索同源基因的步骤。通过构建门水平的系统发育树，我们可以观察到基因家族进化中的趋势，例如保守基因的存在或谱系特异性的基因重复事件。在此层次上，我们还可以分析基因是直系同源（orthologs）还是旁系同源（paralogs）。尽管许多同源基因可能具有相似的功能，但这并非绝对2。在这些研究中引入系统发育树对于判断同源基因是否为直系同源至关重要。在真核生物中，许多直系同源基因在细胞内保持相似功能，这一点已得到证实，例如哺乳动物蛋白能够恢复酵母中直系同源蛋白的功能3。然而，也存在非直系同源基因执行特定功能的情况4。....

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方案

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本方案遵循加州大学欧文分校的动物护理指南。

1. RNA-seq 文库构建

  1. 使用以下方法分离RNA。
    1. 收集样品。若需在后续提取RNA，应将样品迅速冷冻或置于RNA保存液中15（材料表）。
    2. 处死并解剖生物体，分离目标组织。
    3. 使用RNA提取试剂盒提取总RNA，并使用RNA纯化试剂盒进行纯化（材料表）
      注意：针对不同物种和组织类型，可能存在更适用的实验方案和试剂盒16,17。我们已从蝴蝶的不同体组织18以及胶状水母Hydra19中成功提取RNA（见讨论部分）。
    4. 测定各样品RNA的浓度和质量（材料表）。构建cDNA文库时应选用RNA完整性数值（RIN）高于8、理想情况下接近9的样品20。
  2. 按以下步骤构建cDNA文库并进行测序。
    1. 根据文库构建说明书操作手册构建cDN....

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结果

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上述方法总结于图1，并应用于Hydra vulgaris组织的数据集。H. vulgaris是一种淡水无脊椎动物，属于刺胞动物门（Cnidaria），该门还包括珊瑚、水母和海葵。H. vulgaris可通过出芽方式进行无性繁殖，并在被切成两段时再生其头部和足部。在本研究中，我们旨在探讨Hydra中视蛋白基因的进化与表达7。尽管Hydra没有眼睛，但其表现出光依赖性行为32。视蛋白基因编码的蛋白质在视觉中起重要作用，可检测不同波长的光并启动光转导级联反应。在基础物种中研究该基因家族的分子进化与表达，有助于理解动物眼睛及光感知能力的演化过程。

我们使用 Hydra 2.0 生成了引导式组装33 参考基因组和公开可用的RNA-seq数据（GEO编号GSE127279）

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讨论

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本实验方案的目的是概述利用RNA-seq数据对基因家族进行表征的各个步骤。这些方法已被证明适用于多种物种和数据集4,34,35。本文建立的分析流程已尽可能简化，即使是生物信息学初学者也能轻松遵循。本方案的重要意义在于，它详尽列出了完成一项可发表水平分析所需的全部步骤和必要软件工具。方案中的一个关键步骤是必须获得正确组装的全长转录本，这依赖于高质量的基因组或转录组数据。为获得合适的转录本，需要高质量的RNA和/或DNA，以及下文将讨论的良好注释信息。

在进行RNA-seq文库构建时，我们列出了适用于水螅（Hydra）19和蝴蝶18等小型生物组织的试剂盒（材料表）。需要注意的是，对于低起始量RNA样本，我们采用了改良的实验流程

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢Adriana Briscoe、Gil Smith、Rabi Murad和Aline G. Rangel在将部分步骤纳入我们工作流程方面提供的建议和指导。我们还感谢Katherine Williams、Elisabeth Rebboah和Natasha Picciani对稿件提出的修改意见。本研究部分得到了George E. Hewitt医学研究基金会向A.M.M.提供的博士后研究基金资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物分析仪-DNA试剂盒Agilent5067-4626湿实验材料
生物分析仪-RNA试剂盒Agilent5067-1513湿实验材料
BLAST+ v. 2.8.1在计算集群上
https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Blast2GO（在您的个人电脑上）在本地计算机上
https://www.blast2go.com/b2g-register-basic
boost v. 1.57.0在计算集群上
Bowtie v. 1.0.0在计算集群上
https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
计算集群（强烈推荐）注意：基因组数据分析最好在高性能计算集群上进行，因为文件非常大。
Cufflinks v. 2.2.1在计算集群上
edgeR v. 3.26.8（在R中）在Rstudio中
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0在计算集群上
Java v. 11.0.2在计算集群上
MEGA7（在您的个人电脑上）在本地计算机上
https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1在本地计算机上
https://www.megasoftware.net
NucleoSpin RNA II试剂盒Macherey-Nagel740955.5湿实验材料
perl 5.30.3在计算集群上
python在计算集群上
Qubit 2.0 荧光仪ThermoFisherQ32866湿实验材料
R v.4.0.0在计算集群上
https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNA保存液（RNAlater）ThermoFisherAM7021湿实验材料
RNeasy试剂盒Qiagen74104湿实验材料
RSEM v. 1.3.0计算机软件
https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335在本地计算机上
https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3计算机软件
SRA Toolkit v. 2.8.1在计算集群上
https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0c在计算集群上
https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4d在计算集群上
https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0在计算集群上
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35在计算集群上
http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5在计算集群上
https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzolThermoFisher15596018湿实验材料
TruSeq RNA文库制备试剂盒v2IlluminaRS-122-2001湿实验材料
TURBO DNA-free试剂盒ThermoFisherAM1907湿实验材料
*在计算集群上下载和安装可能需要root权限。请联系您的网络管理员。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
  2. Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene ortholo....

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重印与许可

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标签

RNA seq BLAST MEGA edgeR

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