方法文章

通过水杨酸甲酯透明化与三维成像探究脂肪组织结构

DOI：

10.3791/61640

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2020年8月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍一种简单、经济且快速的透明化方法，结合多种标记物，通过荧光成像技术解析小鼠和人类白色脂肪组织的三维结构，可同时可视化血管、细胞核、免疫细胞、神经元以及脂滴包被蛋白。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肥胖是一个全球性的重大公共卫生问题，会增加患心血管疾病、2型糖尿病和肝脏疾病的风险。肥胖的特征是由于脂肪细胞增生和/或肥大导致脂肪组织（AT）质量增加，从而引起其三维结构的显著重塑。事实上，脂肪组织在肥胖期间的扩张能力对于肥胖相关疾病的发病至关重要。这种脂肪组织的扩张是一种重要的稳态机制，能够适应能量摄入过剩，并避免脂质溢出到其他代谢器官（如肌肉和肝脏）造成有害影响。因此，理解导致脂肪组织扩张功能障碍的结构重塑过程是一个具有重要临床应用价值的基础科学问题。本文中，我们描述了一种简单且快速的透明化方法，该方法在本实验室常规用于通过荧光成像技术研究小鼠和人类白色脂肪组织的形态学特征。这种优化的脂肪组织透明化方法可在任何配备化学通风橱、温控摇床和荧光显微镜的标准实验室中轻松实施。此外，所用化学试剂均易于获取。重要的是，该方法可通过标记多种分子靶点，特异性地可视化脂肪细胞、神经网络和血管网络，以及先天性和适应性免疫细胞的分布，从而解析脂肪组织的三维结构。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肥胖的特征是脂肪组织质量增加，已成为全球主要的公共卫生问题，因为肥胖人群患心血管疾病、2型糖尿病、肝脏疾病和某些癌症的风险增加。

脂肪组织的一项基本生理功能是调节全身的葡萄糖和脂质稳态1,2在饲喂期间，脂肪细胞（即脂肪组织的主要细胞）储存 将餐后提供的过量葡萄糖和脂质转化为甘油三酯。在禁食期间，脂肪细胞将甘油三酯分解为非酯化脂肪酸和甘油，以维持机体的能量需求。在肥胖发展过程中，脂肪组织通过增加脂肪细胞的体积（肥大）和/或数量（增生）而扩张。1，以增加其储存容量。当脂肪组织的扩张达到个体间差异较大的极限时，多余的脂质便会积聚到其他代谢器官中，包括肌肉和肝脏。3,4，导致其功能失常，并引发与肥胖相关的 cardiometabolic 并发症1,5因此，阐明调控脂肪组织扩张的机制是一项关键的临床挑战。

肥胖期间脂肪组织内记录到的形态学改变与其病理性功能障碍相关。已有多种染色方法用于描述脂肪组织的组织结构，包括肌动蛋白6、血管标志物7、脂滴标志物8以及特异性免疫细胞标志物9,10。然而，由于脂肪细胞直径巨大（50 至 200 µm）11，必须在三维空间中分析整个组织的较大区域，才能准确评估肥胖期间观察到的脂肪组织显著结构变化。但由于光线无法穿透不透明的组织，使用荧光显微镜对大块组织样本进行三维成像无法实现。文献中已报道了使组织透明化的清除技术（综述见12），可实现组织透明化并进行深层的全组织荧光显微成像。这些方法为评估健康与病变组织中的三维细胞组织结构提供了前所未有的机会。每种已描述的方法均有其优缺点，因此需根据所研究的组织谨慎选择（综述见13）。事实上，某些方法需要长时间孵育和/或使用昂贵、有毒或难以获得的材料或化合物14,15,16,17,18,19。我们利用一个世纪前Werner Spalteholz用于组织清除的最早化合物之一20，建立了一种操作简便且成本低廉的方案，该方案非常适合在配备常规设备（包括化学通风橱、温控摇床和共聚焦显微镜）的任何实验室中对小鼠和人类所有脂肪组织库进行透明化处理。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该实验方案已针对所有小鼠和人类的白色脂肪组织库进行过测试并验证有效。人类和小鼠脂肪组织的采集均符合欧洲法律法规，并经法国和瑞典伦理委员会批准。

1. 小鼠和人白色脂肪组织的固定

  1. 将收获的小鼠或人白色脂肪组织浸入含有4%多聚甲醛（PFA）的至少10 mL PBS中，置于15 mL塑料管内。
  2. 在室温下，将塑料管置于滚轴摇床上震荡1小时。
  3. 将塑料管置于4 °C滚轴摇床上过夜，以完成固定。
    注意：本方案适用于较大的脂肪组织样本，例如从正常饮食小鼠获取的完整附睾脂肪垫（≈250 mg - ≈0.6 cm3）。对于更大的样本，例如高脂饮食小鼠的附睾脂肪垫（≈1.5 g - ≈4 cm3）或人脂肪组织样本，尽管透明化方案在整体样本上（通过放大PFA和抗体混合物体积）仍可完全有效，但通常我们会将组织切成约1 g（≈2.5 cm3）的组织块，以保留剩余样本用于额外染色或其他应用。对于PFA固定（步骤1.1），建议使用约为组织体积10倍的液体量。对于抗体混合物（步骤3.1和3.4），应增加体积以完全浸没组织；若组织过大无法放入1.5 mL塑料微量离心管（见材料表），请使用15 mL塑料管（见材料表）。

2. 小鼠和人类白色脂肪组织的通透化与饱和处理

  1. 用 10 mL PBS 在室温下冲洗固定后的白色脂肪组织 5 分钟，以去除所有残留的 PFA。
  2. 将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.3% 甘氨酸，见材料表）的 15 mL 塑料管中，在室温下置于轨道摇床上以 100 转/分钟（rpm）振荡 1 小时，以淬灭残留的游离醛基。
  3. 将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.2% Triton X-100，见材料表）的 15 mL 塑料管中，在 37 °C 下置于温控轨道摇床上以 100 rpm 振荡 2 小时。
  4. 将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.2% Triton X-100 和 20% DMSO，见材料表）的 15 mL 塑料管中，在 37 °C 下置于温控轨道摇床上以 100 rpm 振荡过夜。
  5. 将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.1% Tween-20（见材料表）、0.1% Triton X-100、0.1% 脱氧胆酸钠（见材料表）和 20% DMSO）的 15 mL 塑料管中，在 37 °C 下置于温控轨道摇床上以 100 rpm 振荡至少 24 小时。
  6. 将组织在含有 10 mL PBS（含 0.2% Triton X-100）的 15 mL 塑料管中用 PBS 冲洗，在室温下置于轨道摇床上以 100 rpm 振荡 1 小时。
  7. 将组织浸入含有 10 mL PBS（含 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，见材料表）的 15 mL 塑料管中，在 37 °C 下置于温控轨道摇床上以 100 rpm 振荡 12 小时，以封闭可能非特异性结合抗体的位点。
    注意：在步骤 2.7 中，可用与二抗相同物种的血清替代 BSA。

3. 小鼠和人类白色脂肪组织的染色步骤

  1. 将组织转移至含有 300 µL PBS 的 1.5 mL 塑料微量离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA 及一抗（浓度为冷冻切片染色所用浓度的 10 倍，但每种抗体的最佳浓度需单独评估）。用铝箔包裹管子以避光，并在 37 °C、100 rpm 条件下于温控振荡摇床中振荡至少两 天（参见步骤 1.1 和步骤 3.7.1 的注释）。
  2. 将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡 5 小时。重复此步骤两次。
  3. 将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡一夜至两天。
  4. 将组织转移至含有 300 µL PBS 的 1.5 mL 塑料微量离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA 及二抗（浓度为冷冻切片染色所用浓度的 10 倍）。用铝箔包裹管子以避光，并在 37 °C、100 rpm 条件下于温控振荡摇床中振荡至少两 天（参见步骤 1.1 和步骤 3.7.1 的注释）。
  5. 将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡 5 小时。重复此步骤两次。
  6. 将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，PBS 中添加 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡一夜至两天。
  7. 将组织转移至含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料离心管中，在避光条件下于 37 °C、100 rpm 的温控振荡摇床中振荡 2 小时。
    注：若需标记特定结构（如细胞核或肌动蛋白），当仅使用荧光标记的一抗时，应在步骤 3.1 中加入 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI 或等效物）和/或荧光标记的鬼笔环肽；若使用二抗，则应在步骤 3.4 中加入。
    注：在染色流程中，可使用已与荧光染料偶联的一抗（如流式细胞术中所用抗体），我们推荐此方法以节省时间并提高特异性。尽管如本研究中所示，可使用小鼠来源的一抗，再结合抗小鼠二抗，但我们常观察到因循环免疫球蛋白导致的血管非特异性染色。因此，为避免此问题，强烈推荐使用预先标记的一抗；本文提供了证据表明，流式细胞术中使用的抗体与本实验流程兼容。然而，对于低水平表达的抗原，必须通过二抗进行信号放大；当唯一可用的一抗为小鼠来源时，建议在处死动物时用 PBS 对小鼠进行心脏灌流，持续至少 5 分钟，以清除大部分循环免疫球蛋白，从而减少非特异性染色。

小鼠和人类白色脂肪组织的透明化处理步骤

  1. 将组织浸入含有10 mL 50%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡2小时。
  2. 将组织浸入含有10 mL 70%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡2小时。
  3. 将组织浸入含有10 mL 95%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡2小时。
  4. 将组织浸入含有10 mL 100%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡2小时。
  5. 将组织浸入含有10 mL 100%乙醇的15 mL塑料管中，在室温下避光条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡过夜。
  6. 将组织浸入一个带塑料盖的20 mL玻璃瓶（见材料表）中，瓶内加入5 mL水杨酸甲酯（见材料表），在化学通风橱中避光、室温条件下，于转速为100 rpm的旋转摇床中振荡至少2小时。
    注意：如有需要，可省略步骤4.3和4.5以显著加快透明化过程，但最终透明效果会略有降低。

5. 透明化白色脂肪组织的三维共聚焦成像

  1. 将组织转移至配有玻璃底的金属成像室中（参见 材料表在化学通风橱中进行操作，并用新鲜的水杨酸甲酯填充腔室。
    注意： 为固定组织位置，防止其在腔室中漂浮或侧向移动，可放置多个18 mm圆形玻璃盖玻片（参见 材料表) 将组织放入腔室时，置于组织上方。
  2. 将成像腔室置于倒置共聚焦显微镜上。
  3. 使用低倍物镜（例如 4x 物镜）对组织进行成像，以生成几厘米大小的图像3 整个脂肪组织或人体组织样本的三维图谱。
  4. 在更高放大倍数下选择多个区域进行组织取样。通常使用20倍长工作距离物镜，以获得分辨率与成像深度之间的良好平衡。我们采集深度在600至2000 µm之间的z轴层扫大视野拼接图像。
    注意： 使用长工作距离物镜对组织进行更深层的成像。

6. 从三维脂肪组织图像中提取定量结果

注意：对第5步生成的3D图像堆栈中不同结构进行分割并从中提取定量信息的操作，可以使用现有的多种图像分析软件完成，无论是商业软件还是免费软件均可。在接下来的步骤中，我们描述一种本实验室常规采用的策略，用于利用商业软件从3D脂肪组织图像中提取定量信息（参见材料表）。

  1. 将3D图像堆栈转换为软件格式，以释放内存空间。
  2. 分割细胞。
    1. 打开软件中的Cell模块。
    2. 将Cell Detection设置更改为细胞膜染色模式。
    3. 选择用于界定细胞边界的荧光通道（如标记皮层肌动蛋白的鬼笔环肽phalloidin，或巨噬细胞的F4/80、T细胞的TCR-β，或特定免疫细胞亚群的分化簇CD蛋白等细胞膜标记物）。
    4. 设置阈值，并提供预期细胞大小的范围（例如，细胞检测的大小范围为1至200 µm）。
    5. 运行分割程序。将生成一个对应于z轴堆栈的体积图像，其中分割出的细胞以不同颜色编码，相邻细胞显示为不同颜色。
    6. 在统计选项卡中应用统计滤波器（如大小、圆度、圆形度等），以排除分割伪影，或根据细胞大小进一步优化目标细胞的分割结果（例如，脂肪细胞为20–200 µm；巨噬细胞为5–25 µm；淋巴细胞为1–3 µm）。
    7. 从统计选项卡中提取测量值和定量数据（体积、数量、大小、直径等）。
  3. 将细胞组分（细胞核、囊泡等）或血管作为结构进行分割。
    注意：尽管丝状结构分割对于研究血管的连通性非常有用，但我们采用表面模块分割来获取血管的大小、体积和直径等数据。实际上，使用丝状结构模块时会丢失对血管尺寸的量化信息。
    1. 打开软件中的Surface模块。
    2. 选择用于特异性标记亚细胞结构以进行三维重建的荧光通道。
    3. 设置阈值，并提供该结构预期直径范围（例如，细胞核为0.5–5 µm；血管为0–100 µm等）。
    4. 运行分割程序。将生成包含已分割细胞结构的体积图像。可从统计选项卡中提取测量值和定量数据（体积、数量、大小、直径等）。
  4. 将血管作为管状连续体进行分割。
    注意：尽管丝状结构分割对于研究血管的连通性非常有用，但我们采用表面模块分割来获取血管的大小、体积和直径等数据。实际上，使用丝状结构模块时会丢失对血管尺寸的量化信息。
    1. 打开软件中的Filaments模块。
    2. 选择对应于血管染色的荧光通道。
    3. 设置荧光强度的阈值，并选择合适的预期连接节点数量。
    4. 运行分割程序。将在三维空间中生成代表血管网络的丝状结构。可从统计选项卡中提取测量数据，从而获得包括血管长度、分支数量等在内的定量信息。

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结果

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通过采用此处描述并在图1中总结的实验步骤，我们成功对人和小鼠的白色脂肪组织进行了染色和光学透明化处理，结果分别如图2A和图2B所示。透明化后的组织被转移至金属成像腔室中进行共聚焦成像（图3A）。组织透明化显著提高了我们所能获取的组织图像的成像深度（图3B和图3C）。利用4倍物镜可在低倍镜下对整个脂肪组织进行三维成像（见补充视频1），从而生成三维图谱，用于选择后续使用20倍物镜进行高倍成像的不同区域（图3D）。高倍镜图像以三维模式采集，成像深度达2 mm（图3E）。

该实验步骤可...

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讨论

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肥胖等病理进程发展过程中脂肪组织内发生的改变，对于理解疾病背后的机制至关重要。早期揭示脂肪组织中这些机制的研究主要基于整体性方法，例如全脂肪组织蛋白质组学。21流式细胞术22,23和转录组学24,25此外，已有研究致力于通过组织学分析探索脂肪组织中发生 的结构变化。26,27,28,29然而，由于切片尺寸有限，对5-10 µm厚的脂肪组织切片进行分析会限制对重要结构特征的观察。首先，每张切片中仅能检测到少数几个脂肪细胞核，因为每个切片仅代表脂肪细胞的一小部分（1/10）th）。其次，...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由法国国家健康与医学研究院（INSERM）、法国蔚蓝海岸大学（Université Côte d’Azur）以及法国国家科研署（ANR）的资助支持，包括“未来投资”计划中的SIGNALIFE卓越实验室项目（ANR-11-LABX-0028-01）、UCA JEDI项目（ANR-15-IDEX-01）下“复杂系统”学院2和“生命复杂性与多样性”学院4、法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale，FRM团队项目DEQ20180839587），以及J.G.获得的青年研究者项目（ANR18-CE14-0035-01-GILLERON）。我们还感谢由滨海阿尔卑斯省议会（Conseil Départemental des Alpes-Maritimes）和普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区（Région PACA）资助的C3M成像核心设施，该设施同时也得到法国IBISA显微成像与图像平台蔚蓝海岸（MICA）的支持。我们感谢Marion Dussot在组织样本制备方面的技术支持。我们感谢Abby Cuttriss（UCA国际科学可见度项目）对本文稿件的校对。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Eppendorff tubes - Dutscher33528
15 mL 塑料管Falcon tubes - Dutscher352096
18 mm 圆形玻璃盖玻片Mariendfeld0117580
20 mL 玻璃瓶Wheaton986546
抗小鼠 Alexa647 标记抗体Jackson ImmunoResearch715-605-150稀释比例：1/100
抗兔 Alexa647 标记抗体Jackson ImmunoResearch711-605-152稀释比例：1/100
BSASigma-aldrichA6003
CD301-PE 抗体BiolegendBLE145703稀释比例：1/100
CD31 抗体AbCamab215912稀释比例：1/50
商用三维分析软件 - IMARISOxford instrument含 Cell 模块
共聚焦显微镜 - Nikon A1RNikon
DapiThermoFisherD1306储存浓度：5 mg/mL；稀释比例 1/1000
脱氧胆酸钠Sigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Glut4 抗体Santa Cruzsc-53566稀释比例：1/50
甘氨酸Sigma-aldrichG7126
凝集素-DyLight649Vector LabDL-1178-1储存浓度：2 µg/µL；静脉注射剂量：50 µL/小鼠
带玻璃底的金属成像腔室 - AttoFluor ChamberThermofisherA7816
水杨酸甲酯Sigma-aldrichM6752
Perilipin 抗体Progen651156稀释比例：1/50
Phalloidin-alexa488ThermoFisherA12379稀释比例：1/100
TCR-β-PB 抗体BiolegendBLE109225稀释比例：1/100
TH 抗体AbCamab112稀释比例：1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416

参考文献

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