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方法文章

使用正电压（40–300 kV）X射线设备进行细胞辐照的剂量测定

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DOI：

10.3791/61645

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2021年2月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of RAdiobiology and Regenerative MEDicine (SERAMED), Laboratory of Radiobiology of Accidental Exposures (LRAcc), Institute for Radiological Protection and Nuclear Safety (IRSN), 2Department of RAdiobiology and Regenerative MEDicine (SERAMED), Laboratory of MEDical Radiobialogy (LRMed), Institute for Radiological Protection and Nuclear Safety (IRSN), 3Department of DOSimetry (SDOS), Ionizing Radiation Dosimetry Laboratory (LDRI), Institute for Radiological Protection and Nuclear Safety (IRSN)

本文内容

摘要

本文介绍了一种使用低能X射线设备进行细胞照射的新型剂量学方案。测量过程在尽可能模拟真实细胞照射条件的情况下进行。

摘要

在放射生物学研究中，剂量测定方案和标准的重要性不言而喻。已有多种针对低能X射线装置的剂量测定方案被提出，但根据不同的辐照配置、样品、材料或射束品质，有时难以确定哪种方案最为适用。因此，我们提出一种用于低能X射线装置下细胞辐照的剂量测定方案。该方法的目标是在细胞单层水平上进行剂量估算，使其尽可能接近真实的细胞辐照条件。该方案的具体步骤如下：确定辐照参数（高压、电流强度、细胞容器等）、确定射束品质指数（高压-半值层组合）、使用在空气比释动能条件下校准的电离室测量剂量率、利用EBT3放射变色薄膜量化细胞培养基对射线的衰减和散射效应，以及确定细胞水平的剂量率。每当建立新的细胞辐照配置时，都必须执行此方法学流程，因为即使仅改变一个参数，也可能显著影响细胞单层处的实际剂量沉积，尤其是在使用低能X射线的情况下。

引言

放射生物学的目标是建立辐射剂量与生物学效应之间的关联；在放射生物学实验设计中，剂量测定是一个至关重要的方面。30 多年来，剂量测定标准以及实践规范化的重要性已被多次强调1,2,3,4,5。为建立剂量率参考，目前已存在多种测量方案6,7,8,9,10；然而，正如 Peixoto 和 Andreo11 所示，根据用于确定剂量率的剂量学量的不同，结果可能相差高达 7%。此外，即使已有相关方案，有时仍难以判断哪种方案最适合特定应用（如果存在适用方案的话），因为细胞所受的剂量率取决于细胞容器、细胞培养基体积或射线质量等参数。此类辐照中的散射和反向散射也是必须考虑的重要因素。事实上，对于低能和中能 X 射线，在 AAPM TG-61 参考方案10 中，水中的吸收剂量是在水模体表面进行测量的。然而，考虑到细胞辐照条件的特殊性，被空气包围的小体积细胞培养基所处的条件更接近于比释动能（kerma）条件，而非 TG-61 方案中采用大体积等效水模体所定义的吸收剂量条件。因此，我们选择以水中比释动能作为参考的剂量学量，而非水中吸收剂量。基于此，我们提出一种新方法，以更准确地确定实际递送至细胞的剂量。

此外，放射生物学研究的另一个关键方面是必须完整报告所采用的辐照方法和实验方案，以便能够重现、解释和比较实验结果。2016年，Pedersen 等人12指出，临床前放射生物学研究中剂量学报告存在不足。Draeger 等人13近期一项更大规模的研究进一步表明，尽管部分剂量学参数（如剂量、能量或辐射源类型）通常会被报告，但大量对准确复现辐照条件至关重要的物理和剂量学参数仍普遍缺失。这项涵盖过去20年超过1,000篇出版物的大规模综述显示，放射生物学研究中物理和剂量学条件的报告存在显著缺陷。因此，为确保实验的可靠性和可重复性，必须对放射生物学研究中所用的实验方案和方法进行完整描述。

考虑到这些不同因素，法国辐射防护与核安全研究院（IRSN）在开展放射生物学实验时，在正交电压辐照装置中实施了一套严格的细胞辐照方案。该剂量学方案旨在尽可能模拟真实的细胞辐照条件，从而准确确定实际递送到细胞的剂量。为此，列出了所有辐照参数，并通过测量半值层（HVL）来评估射束质量指数；由于无法遵循美国医学物理学会（AAPM）协议10中的标准建议，因此对HVL测量方法进行了一些调整。随后，在用于细胞辐照的细胞容器内部，使用电离室测量绝对剂量率，并利用EBT3放射变色薄膜量化细胞培养基对射线的衰减和散射效应。由于该方案中任意单一参数的改变都可能显著影响剂量估算结果，因此针对每种细胞辐照配置均需执行专门的剂量测定。此外，每种管电压-滤片组合都必须重新计算HVL值。本研究中采用的辐照条件为：220 kV管电压、3 mA电流，固有滤过和附加滤过分别为0.8 mm和0.15 mm的铍和铜。所选的细胞辐照配置为T25培养瓶，细胞在5 mL细胞培养基中接受辐照。

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方案

1. 辐照平台及辐照参数的确定

  1. 使用能够提供低至中等能量X射线的辐照平台。确定实验参数以确保放射生物学实验的稳健性和可重复性：管电压、电流强度、滤过（固有滤过和附加滤过）、半值层（HVL）、有效能量、用于剂量测量的探测器、源-样品距离（SSD）、辐照野（形状、大小、几何构型）、剂量学量、剂量学方法、剂量率、细胞容器以及细胞培养基的用量。本方案中使用的所有参数详见Table 1。

2. 射束质量指数：半值层的测定

注：半值层（HVL）定义为将射线强度衰减至原始值一半时所需衰减材料（通常为铜或铝）的厚度。

  1. 按照图1中的说明，在辐照屏蔽室内安装设备（支架、准直器、光阑、电离室）。此步骤中不使用任何衰减材料。
  2. 确保图1中所示的所有距离均正确。使用卷尺进行测量。
  3. 将电离室置于水平位置。本实验中使用的是31002型（等效于31010型）圆柱形电离室，已校准为空气比释动能响应。
  4. 对电离室进行5分钟的预辐照，并测量本底值（此步骤可在无准直器条件下进行）。
  5. 在电荷收集模式下进行10次测量，每次1分钟，获得相应的Mraw值（单位为库仑）。
  6. 使用放置在辐照屏蔽室内的经校准的温压测量设备（若无法放入屏蔽室，则置于实验装置附近）测量温度和气压。根据以下公式对静电计读数Mraw进行温度和气压修正：
    热力学公式：用于分析温度-压力关系的 \(K_{T,p}\) 方程示意图。
    其中：T（°C）和P（hPa）分别为实际测量的温度和气压；Tref和Pref为标准实验室对电离室进行校准时所用的参考温度和参考气压。温度和气压必须使用经校准的仪器测量。电荷模式下获得的修正后平均值为M（单位为库仑）。
    注意：此步骤对于半值层（HVL）测量并非严格必需，但建议执行。
  7. 在光阑上方放置一定厚度的衰减材料。HVL测试组由不同厚度的铜箔组成（厚度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5和10 mm），尺寸足以完全覆盖射束（本例中为80 × 80 mm）。
  8. 进行1分钟的测量（Mraw值需按前述方法用KT,P进行修正）。
    1. 若测得的剂量率相对于初始值下降至一半，则已找到半值层（HVL）对应的厚度。此时进行5次1分钟测量，以估算平均剂量率。
    2. 若剂量率未降至初始值的一半，则增加或减少衰减材料的厚度并重新测量。根据需要调整衰减材料的厚度。
  9. 当找到使射束强度衰减至一半的衰减材料厚度后，进行5次1分钟测量以确认HVL值。
    注意：大多数情况下，无法从现有铜箔中恰好找到满足条件的厚度。此时应采用二分法逼近，并通过插值确定HVL。

3. 照射野的评估（无剂量估算）

  1. 将一张EBT3胶片放置在用于辐照的支撑物上。
  2. 对该胶片进行辐照，以获得清晰的辐照野（至少2 Gy）。
  3. 使用专用扫描仪扫描EBT3胶片。
  4. 使用Image J软件中的分析（Analyze）功能，然后选择绘制轮廓（Plot Profile）选项，绘制剂量分布曲线（图2）。
  5. 确定用于辐照的辐照野尺寸（均匀区域，排除半影区，见图2）。
  6. 在用于辐照的支撑物上做标记，以确保细胞容器处于正确位置。
    注意：此步骤用于确定辐照野的尺寸，不进行剂量估算。胶片读取与分析的完整流程见第5节。同时应预留边缘余量，以避免因细胞容器定位不准而产生误差。

4. 使用电离室测量剂量率

  1. 取细胞容器，在其侧面或底部（根据所使用的特定容器和电离室）轻微破坏一小部分，以便将电离室置于容器内部（图3，上部）或下方（图3，下部）。图3中展示了不同电离室（圆柱形或平行板型）与细胞容器的示例。本例中使用了T25培养瓶（图3，红色框）。
    注意：使用电烙铁或加热的手术刀是打穿塑料器皿的有效方法
  2. 将容器放置于辐照用支架上，并置于屏蔽罩内（本例为碳板）。
  3. 将电离室放入容器中（图3，红色框），调整至正确位置，并连接至静电计。
  4. 确认第1节中列出的所有辐照参数均正确无误（高压、电流强度、附加滤片、源-样品距离等）。
  5. 对电离室进行5分钟预辐照，并完成静电计的调零。
  6. 采集10次每次1分钟的测量数据，以确定空气比释动能的平均剂量率（Gy·min-1）。按以下公式计算空气比释动能Kair的剂量率：
    静态平衡方程，公式为 K_air = M × N_Kair × K_Q。
    其中M为经温度、气压、极性效应、离子复合及静电计校准修正后的剂量仪读数；NKair和Kq为与辐射质量相关的校准与修正因子，其数值因每种电离室而异。

5. 细胞培养基质的衰减与散射测量

注意：整个操作过程中均需戴手套处理 EBT3 胶片。

  1. 实验准备
    1. 在辐照前至少24小时，剪取小块EBT3胶片。
    2. 根据放射生物学实验所用细胞培养容器的类型确定薄膜的尺寸（例如，T25 培养瓶使用 4 × 4 cm 的薄膜）。
      裁剪两组放射变色薄膜：一组用于制作校准曲线，包含按剂量或时间点划分的三片EBT3放射变色薄膜（本研究共九个点）；另一组用于量化细胞培养基的衰减，每个点同样包含三片薄膜。
    3. 为所有胶片编号以便识别（此处位于右上角），并在扫描仪上的相同位置进行扫描。
    4. 将薄膜避光保存。
    5. 准备用于EBT3胶片测量的细胞容器，并在必要时裁剪一部分以便将胶片放入（文中以T25为例说明） 图4).
  2. 剂量率估算
    1. 按照上一节所述配置测量剂量率。
    2. 保持此配置用于EBT3放射变色薄膜的辐照，并使用相同类型的细胞容器。
  3. 标准曲线的构建
    1. 取预先切割的EBT3胶片用于制作校准曲线。
    2. 不要对三个样本进行照射（0 Gy）。
    3. 将第一张薄膜以与细胞辐照相同的构型放入细胞容器内。
    4. 照射以获得第一组剂量点。
    5. 重复此操作，以获得三片接受相同剂量照射的EBT3胶片。
    6. 对每个剂量点执行此操作（本研究中包含九个剂量点（0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5 和 3 Gy），如图所示 图5).
  4. 细胞培养基衰减及散射的评估
    1. 选择相同的照射时间进行所有照射（例如 60 s）。
    2. 在无水容器中照射三片EBT3胶片。
    3. 将三片EBT3胶片放入装有水的容器中，按如下步骤进行辐照。
      1. 将薄膜放入容器内。
      2. 用精确体积的水填充容器，以模拟细胞培养基（此处为5 mL）。若薄膜无法完全浸没，可使用小块胶带固定。
      3. 将细胞容器放入 enclosure 内，并确保薄膜完全浸入。
      4. 辐照完成后，取出EBT3胶片，用吸水纸擦干，并避光保存。

6. EBT3 放射变色薄膜的读取

  1. 辐照后至少 24 小时再读取 EBT3 胶片。
  2. 使用专用扫描仪扫描胶片。
  3. 设置扫描仪参数为：48 位红绿蓝 TIFF 格式，150 dpi 透射模式，不进行图像校正。
  4. 按以下步骤对扫描仪进行预热：
    1. 将一张未辐照的胶片放置在扫描仪上。
    2. 启动扫描预览。
    3. 启动计时器，等待 30 秒。
    4. 开始扫描。
    5. 扫描结束后，启动计时器，等待 90 秒。
    6. 同时，记录此次扫描，用 ImageJ 打开图像，在固定大小和固定位置绘制一个方形感兴趣区域（ROI），测量该区域内平均红色像素值。
    7. 90 秒结束后，从步骤 2 开始重复该过程（扫描仪内的胶片不移动）。
    8. 至少重复 30 次，以完成扫描仪的预热和稳定（未辐照胶片上选定区域的平均红色像素值不再变化）。若扫描仪（即平均红色像素值）尚未稳定，需继续重复该过程。
  5. EBT3 胶片的扫描
    1. 将第一张胶片放置在扫描仪床面的中心位置。划定一个区域，确保每次胶片都放置在相同位置并保持相同朝向。
    2. 启动扫描预览。
    3. 启动计时器，等待 30 秒。
    4. 开始扫描。
    5. 扫描结束后，启动计时器，等待 90 秒。在此期间更换 EBT3 胶片。
      注：EBT3 放射变色胶片的分析采用自编的 C++ 程序完成。EBT3 胶片分析可使用多种方法，例如红通道法或三通道法14,15。本研究中采用红通道法，不进行背景扣除，图像先转换为光学密度，再通过程序转换为剂量。由于该方法已有明确定义，本文未提供 C++ 程序代码。此外，也可使用专用软件16进行 EBT3 胶片分析。

7. 确定细胞单层水平的剂量率

  1. 利用光子注量能谱范围内水与空气的平均质量能量吸收系数比值（μen/ρ），将电离室测得的经细胞培养基衰减和散射校正后的平均剂量率（K）转换为水中比释动能。
    环境研究用静态平衡方程，Kwater=K×(μen/ρ)air 示意图。
    采用专用软件17计算无模体条件下空气中光子能谱，并依据NIST表格18计算平均质量能量吸收系数。

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结果

在本研究中，我们使用了一种专用于小型动物照射的平台19；然而，该平台也可用于照射其他类型的样本，例如细胞。照射源为瓦里安X射线管（NDI-225-22），其固有滤过为0.8 mm的铍，焦点尺寸较大，达3 mm，高压范围约为30至225 kV，最大电流强度为30 mA。

本研究中使用的参数见表1。我们以T25培养瓶中5 mL细胞培养基进行细胞辐照为例，展示该实验方案的应用。

半值层
表2 报告了为估算使射线强度衰减一半所需的衰减器厚度而进行的测量。为此，共进行了10次参考测量，以估算静电计上的平均 Mraw 读数（单位：库仑），并用温度和压力修正因子（KT,P）进行校正。

随后测试了不同厚度的衰减器，以确定使射束强度降低一半的厚度。找到该厚度后，进行了五次测量，以评估经K

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讨论

本研究介绍了使用低能X射线装置进行细胞辐照的实验方案及其实施方法。目前，许多放射生物学实验均采用此类辐照装置，因为它们操作简便、成本较低，且相较于钴源等放射源，辐射防护方面的限制极少。尽管此类装置具有诸多优势，但由于其采用低能X射线源，仅改变一个辐照参数就可能显著影响剂量学结果。已有多个研究强调了放射生物学研究中剂量学标准与规范方案的重要性2,5,20,21。尽管文献中已明确定义了若干实验方案1,5，我们仍决定开发一种新的方案，以尽可能模拟真实的细胞辐照条件，并充分考虑所有可能影响物理剂量的参数，尤其是针对低能X射线的情况21,22。为此，我们选择实施...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
31010 电离室PTW电离辐射探测器，含操作规范、2019/2020 年产品目录，第 14 页https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/DETECTORS_Cat_en_16522900_12/blaetterkatalog/index.html?startpage=1#page_14
EBT3 放射性变色薄膜Meditest报价申请https://www.meditest.fr/produit/ebt3-8x10/
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半值层材料（滤片、光阑）PTW在线目录，第 70 页，报价申请铜箔厚度：0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 和 10 mm，https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/Online_Catalog/Radiation_Medicine_Cat_en_
58721100_11/blaetterkatalog/index.html#page_70
放射性变色薄膜扫描仪Epson报价申请Epson V700，Seiko Epson Corporation，日本诹访
温度与气压测量，Lufft OPUS20lufft报价申请https://www.lufft.com/products/in-room-measurements-291/opus-20-thip-1983/

参考文献

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