利用器官芯片三维模型、机器学习与共聚焦层析技术定量分析脑转移肿瘤微环境

摘要

本文介绍了一种制备和培养血脑屏障转移性肿瘤微环境的实验方案，并利用共聚焦成像和人工智能（机器学习）对其状态进行定量分析。

摘要

脑转移是致死性最高的癌症病灶；所有癌症中有10-30%会发生脑转移，中位生存期仅为约5-20个月，具体取决于癌症类型。为了减轻脑转移性肿瘤负担，必须弥补基础与转化研究知识方面的空白。主要挑战包括缺乏可重复的临床前模型及相关工具。将三维脑转移模型与专用分析工具相结合，可获得用于满足这些需求的相关分子和表型数据。此外，与小鼠模型相比，利用器官芯片模型模拟患者肿瘤细胞穿越血脑屏障进入脑微环境的过程，能够更快地获得结果，并且更易于通过定量方法进行解读，因而适用于高通量检测。本文中，我们描述并演示了一种新型三维微流控血脑微环境（µmBBN）平台的使用方法，该平台可长期（数天）培养微环境中的多个组分，通过共聚焦显微镜进行荧光成像，并采用创新的共聚焦层析技术对图像进行重建；所有这些均旨在以可重复且定量的方式理解微转移的发展过程以及肿瘤微环境（TME）的变化。我们展示了如何利用该平台进行癌细胞及TME中细胞和体液组分的制备、接种、成像与分析。此外，我们还展示了如何利用人工智能（AI）识别能够穿过模型µmBBN的癌细胞所具有的内在表型差异，并为其分配一个客观的脑转移潜能指数。该方法生成的数据集可用于回答有关转移机制、治疗策略有效性以及TME在其中作用的基础与转化科学问题。

引言

脑转移是致死性最高的癌症病灶；所有癌症中有10-30%会发生脑转移，中位生存期仅为约5-20个月，具体取决于癌症类型^1,2。在研究癌症转移时，一个关键的科学问题是：亚克隆细胞如何从血液的体液环境中迁移至脑等器官^3,4。这一问题催生了多种迁移、侵袭和血管外渗实验方法。这些方法均包含一个关键步骤，即计数或测量在刺激因素作用下从一个位置移动到另一个位置的细胞的特性。目前大多数可获取的迁移实验主要用于研究癌细胞的二维（2D）迁移，虽已揭示大量科学知识，但无法模拟体内系统真实的三维环境，而其他方法则可提供此类三维信息⁵。因此，有必要在三维（3D）体系中研究肿瘤微环境（TME），但目前可用于3D结构的分析方法仍有限且常缺乏一致性。

最常用的三维工具之一是Boyden小室，其结构为在孔底部悬挂一张膜，将两个不同区域分隔开。Boyden最初提出该检测方法用于研究白细胞趋化作用⁴。可通过改变下层区域的化学成分或其他方式^6,7，诱导上层区域的细胞向下层迁移。目前最常用的定量迁移细胞数量的方法是：使用缓冲液将膜底部的细胞释放，裂解细胞后，根据溶液中DNA含量来计数⁷。这种间接方法由于操作技术的差异容易引入人为误差，且该过程会破坏有关肿瘤表型及微环境的信息。Boyden小室检测的其他改进方法包括对仍附着在膜上的迁移细胞进行固定，但这些方法仅能提供细胞数量，而细胞已失去活性，无法用于后续研究^6,8,9。

由于Transwell小室存在局限性，同时微流控技术领域不断创新，研究人员已开发出细胞迁移检测芯片，可观察细胞在单一方向刺激下的运动行为，而非三维方向^10,11,12。这类迁移检测方法能够更好地控制流动条件或实现单细胞分离^13,14等影响因素，从而更准确地解读实验结果；然而，其二维结构不可避免地会丢失部分动态信息。近期研究聚焦于在三维环境中模拟细胞外渗过程（即细胞从循环系统进入组织的过程，例如穿越血脑屏障）^14,15。相较于使用Transwell小室或二维微流控迁移装置所获得的测量数据，细胞在组织中的外渗距离及其在细胞屏障/膜处的探测行为能够被更精细地解析¹⁶。因此，能够支持对三维外渗过程进行适当成像与分析的实验装置对于获取这些复杂数据至关重要，但目前相关技术在文献中仍显不足。

除了迁移实验外，人们已开发出适用于磁共振成像（MRI）和断层扫描的稳健成像技术，能够识别并精确重建三维空间中的组织^17,18。这些技术通过获取z轴堆叠图像，根据组织特性对图像部分进行分割，再将分割后的图像转换为三维网格模型^19,20,21。这使得临床医生能够以三维形式观察单个器官、骨骼和血管，从而辅助手术规划，或助力癌症与心脏病的诊断^22,23。本文将展示这些方法可被改进并应用于显微样本及三维外渗装置。

为此，我们开发了一种创新的共聚焦断层成像技术，通过改进现有的断层成像工具，灵活研究肿瘤细胞跨膜外渗过程。该方法能够全面研究癌细胞与细胞屏障（如内皮细胞层）相互作用时的各种行为表现。癌细胞表现出探索性行为：部分细胞可能侵入并停留在膜附近，而另一些则可迅速穿越屏障。该技术能够在所有维度上提供细胞表型的详细信息²⁴。与更复杂的体内小鼠模型相比，利用该方法研究肿瘤微环境具有成本较低、易于解读和可重复性强的优点。通过调整间质区域，本研究所提出的方法可为多种肿瘤类型及微环境的研究提供坚实基础。

我们介绍并演示了一种三维微流控血脑微环境（µmBBN）平台的使用方法（图1），该平台可长期培养血脑屏障及微环境的关键组分（脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞，培养时间最长可达约9天），并通过共聚焦显微镜进行荧光成像，再利用我们的共聚焦层析技术对图像进行重建（图2）；所有这些步骤均旨在以可重复且定量的方式理解微转移灶的形成过程以及肿瘤微环境的变化。血脑屏障与脑微环境的界面由脑微血管内皮细胞构成，并由基底膜、星形胶质细胞足突和周细胞共同加强其结构²⁵。鉴于星形胶质细胞和内皮细胞在血脑屏障形成与调控中的重要作用，我们重点研究了这两个组分。我们展示了如何利用该平台制备、接种、成像并分析癌细胞及肿瘤微环境中细胞和体液组分。最后，我们展示了如何应用机器学习方法识别能够穿过模拟µmBBN模型的癌细胞所具有的内在表型差异，并为其赋予一个客观的脑转移潜能指数²⁴。该方法生成的数据集可用于回答有关转移机制、治疗策略以及肿瘤微环境在其中所起作用的基础研究和转化医学问题。

方案

1. 准备血脑屏障微环境模具

注意：本平台使用的培养装置是一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的支架，用于构建细胞血脑屏障微环境。该装置由两部分组成，中间由多孔膜隔开。为制备血脑屏障微环境，需要使用光刻技术制备两个SU-8模具^26,27。本方案将首先描述100 µm厚模具的制备，随后提供200 µm厚模具的相关说明。

1. 制备模具时，先使用挤压瓶中的丙酮清洁一块4英寸的硅片，然后用氮气枪吹干。
   1. 将硅片置于加热板上，在200 °C下烘烤10分钟，以去除所有残留溶剂。
   2. 随后将硅片居中放置于匀胶机的卡盘上，并滴加1 mL SU8-2075以制备顶层模具。先以500 rpm（加速度300 rpm/s）旋转5秒以分散光刻胶，再以2200 rpm（加速度300 rpm/s）旋转30秒，获得厚度为100 µm的SU-8涂层。可能需要优化参数以达到指定厚度。
2. 将硅片在加热板上于65 °C预烘2分钟，然后立即在98 °C下继续烘烤20分钟。
3. 将硅片放入光刻曝光仪中，并按照标准操作程序将掩膜版居中对准硅片。使用230 mJ/cm²的紫外光B段（360 nm ± 10 nm）对涂覆SU-8的硅片进行曝光。可进行曝光剂量矩阵实验以确定最佳曝光量。掩膜设计见补充文件1。
4. 曝光后，在65 °C下烘烤2分钟，然后立即在98 °C下烘烤10分钟以增强附着力。随后将硅片冷却至50 °C。
5. 使用SU-8显影液去除未曝光的光刻胶。将硅片在显影液中浸泡5分钟，然后在通风橱内用装有SU-8显影液的喷雾瓶冲洗，以搅动并清除残留的未固化SU-8。可使用4倍显微镜观察是否所有未固化SU-8均已清除。若光刻胶特征边缘出现白线，则表明SU-8未完全去除。
6. 最后将硅片置于烘箱中，在110 °C下进行最终硬烘60分钟。
7. 对于厚度为200 µm的模具，采用相同步骤使用SU-8 2075，但需调整以下参数：
   1. 匀胶机设置：先以500 rpm（加速度300 rpm/s）旋转5秒以分散光刻胶，再以1300 rpm（加速度300 rpm/s）旋转30秒，获得200 µm厚的涂层。
   2. 软烘条件：65 °C下烘烤2分钟，随后在98 °C下烘烤40分钟。
   3. 曝光剂量：340 mJ/cm²。
   4. 曝光后烘烤：65 °C下烘烤2分钟，然后在98 °C下烘烤15分钟。
8. 最后，通过将每片硅片放入通风橱内的真空腔室中进行硅烷化处理，腔室内放置一个塑料容器，其中加入3滴（约150 µL）硅烷化溶液（三氯全氟辛基硅烷）。抽真空并过夜放置，使蒸气充分包覆硅片表面。此步骤可降低SU-8与PDMS之间的粘附力，从而延长模具使用寿命。
   警告：三氯全氟辛基硅烷必须始终在通风橱中操作，并远离水源。
9. 使用两条双面胶带将单个硅片模具固定于150 mm培养皿中，确保硅片平整。另一种替代方法是制作一个铝制模具，将硅片嵌入其中。由于铝制模具为封闭结构，其所制备的PDMS复制件厚度更均匀；而培养皿法对放置表面的倾斜度较为敏感。提高PDMS复制件的平整度可减少后续共聚焦显微成像所需的时间。

2. 制备并组装PDMS血脑屏障（BBB）装置

1. 在塑料杯中按质量比1:10（交联剂:基础剂）混合75 g PDMS。
2. 将PDMS倒入模具上（对于200 µm厚的模具，PDMS厚度为1 mm；对于100 µm厚的模具，厚度为4 mm），并在真空干燥器中脱气一小时，或直至所有气泡完全去除。随后置于65 °C烘箱中过夜固化。PDMS的1 mm厚度可根据共聚焦显微镜10倍物镜的工作距离进行适当调整。
3. PDMS固化后，使用刀片沿晶圆边缘轻轻切割PDMS。将PDMS剥离，并沿矩形导向线用刀片裁切，再用1.5 mm活检打孔器在装置上打开进样口和出样口。用48 mm宽的封箱胶带覆盖PDMS装置部件，以防灰尘和碎屑污染。
4. 接下来使用解剖剪刀裁取一片5 mm × 50 mm、孔径为5 µm的聚碳酸酯膜，并将其存放于培养皿中以备后续使用。
5. 准备以下物品：200 µL移液器吸头、装有2 mL按质量比2:3混合的1:10 PDMS与甲苯溶液的玻璃小瓶、带橡胶球的巴斯德移液管、已制备好的PDMS上层和下层部件、聚碳酸酯膜、三片50 mm × 75 mm的玻璃载片，并将所有物品转移至旋涂仪。该装置的组装及细胞接种步骤如图1所示。
6. 使用巴斯德移液管将1 mL PDMS:甲苯胶液转移至旋涂仪卡盘上的50 mm × 75 mm玻璃载片上。先以100 rpm转速旋转5秒（加速度300 rpm/s），再以2000 rpm转速旋转30秒（加速度300 rpm/s）。
7. 将载片取下并平放于实验台，将一个PDMS上层腔室和一个下层腔室覆盖其上，确保带有成型结构的PDMS面朝向载片，使胶液转移至PDMS表面，并勾勒出所有结构的轮廓。
8. 将PDMS上层腔室翻转，使涂有胶液的一面朝上，放置于另一片载片上，并小心地将膜置于装置的进样口与出样口之间。将200 µL吸头浸入PDMS:甲苯胶液中，使其毛细吸入少量胶液。然后将吸头轻触每个进样口与出样口之间，在膜与PDMS接触边缘附近各滴加一小滴胶液。
9. 取下装置的另一半，将其胶面朝下放置，并与前半部分对齐进样口和出样口后合拢。
10. 将组装好的装置放入37 °C烘箱中过夜，以固化胶液。随后转移至含有干燥剂的真空干燥罐中，脱水两天。此步骤至关重要，可确保甲苯充分挥发，并通过调节实验室空气中被吸收的水蒸气，提高装置接种的一致性。

3. 将脑微环境接种到装置中

1. 细胞培养与试剂：在开始本方案之前，准备好以下试剂和细胞。所有细胞系均在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。
   1. 将人三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) 和 MDA-MB-231-BR-GFP 细胞（由 Patricia Steeg 博士提供）在含 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基中培养，添加 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清（FBS）和 1× 抗生素-抗真菌剂。通过用空载体 pLL-EV-GFP 慢病毒感染 MDA-MB-231 细胞，构建 MDA-MB-231-GFP 荧光细胞。实验前使用荧光激活细胞分选（FACS）对 GFP⁺ 细胞群体进行分选。
   2. 将人脑微血管内皮细胞 hCMEC/D3 在 EGM-2 培养基中培养。通过用空载体 pLL-3.7-dsRed 慢病毒感染 hCMEC/D3 细胞，构建 hCMEC/D3-DsRed 荧光细胞。实验前使用 FACS 去除所有未转导、无荧光的细胞。
   3. 将正常人星形胶质细胞（NHA）在添加了 4.5 g/L 葡萄糖、10% FBS、2 mM Glutamax、1 mM 丙酮酸钠、1× N-2 生长补充剂和 1× 抗生素-抗真菌剂的 DMEM 培养基中培养。使用慢病毒载体 pLOX-TERT-iresTK（Addgene 12245）对星形胶质细胞进行永生化。使用质粒 psPAX2 和包膜质粒 pMD2.G（Addgene 12260 和 12259）构建该载体。
2. 从真空干燥器中取出一个 µmBBN 装置，将其进样口朝下放置在金属或纸面（例如胶带）上，并放入等离子体腔室中。同时将一块 50 mm × 75 mm 的玻璃载片放入等离子体腔室中。抽真空后，在 80 W 条件下进行等离子体处理 30 秒。
3. 迅速将玻璃载片和装置从等离子体腔室中取出，将装置进样口朝上放置在玻璃载片上，并使用定位导板对齐（补充文件 2）。这将在 PDMS 与玻璃载片之间形成永久性键合，无法再次调整位置。
4. 接下来，将 16 个 200 µL 移液枪头的尖端剪去，距离尖端约 2 mm。将移液枪头插入所有进样口和出样口。如果尚未准备接种细胞，此时可将装置放回真空干燥器中。
5. 将装置再次放入等离子体腔室中，在 200 W 条件下进行 8 分钟的等离子体处理。等离子体处理结束后，待装置冷却 5 分钟，将其放入无菌的次级容器中（如透明移液枪头盒）。下一步操作应在约 15 分钟内完成，否则等离子体处理效果可能减弱，导致堵塞。
6. 实验前数天，分别培养含有 1 × 10⁶ 个内皮细胞（hCMEC/D3-DsRed）和 1 × 10⁶ 个星形胶质细胞（NHA）的培养皿。当装置正在进行 8 分钟等离子体处理时，准备胶原蛋白溶液：将 0.5 mL 浓度为 3 mg/mL 的 PureCol I 型牛胶原蛋白、64 µL 0.8 M NaHCO₃ 和 20 µL 10× 高糖（250 mM）MEM 混合。将 5.0 × 10⁵ 个 NHA 细胞悬浮于该胶原蛋白溶液中。不使用时，将溶液保持在冰上。
7. 通过底部腔室的移液枪头（图 1 红色箭头），向装置中转移 120 µL 胶原蛋白/星形胶质细胞/小胶质细胞混合液。让溶液通过毛细作用流经腔室，到达对侧移液枪头。待装置的四个通道均填充完毕后，将芯片置于 37 °C、5% CO₂ 的 CO₂ 培养箱中孵育 1 小时，或直至胶原蛋白凝固。
8. 胶原蛋白凝固后，用完全培养基的混合液填充所有通向底部腔室的移液枪头。对于含有内皮细胞和星形胶质细胞的芯片，使用 50:50 的内皮细胞培养基与星形胶质细胞培养基混合液。
9. 使用上部腔室的移液枪头，以完全内皮细胞培养基配制的 2% 去生长因子 Matrigel 涂覆上部腔室（图 1 蓝色箭头），然后放入培养箱中孵育 1 小时。
10. 用指定的培养基混合液冲洗上部腔室，并交替选择移液枪头接种内皮细胞（图 1 绿色箭头）。将 1 × 10⁶ 个内皮细胞悬浮于 1 mL 内皮细胞培养基中，每 15 分钟向交替的上部腔室枪头中接种 30 µL，以实现均匀覆盖。每个上部腔室的移液枪头需接种内皮细胞两次，每个腔室共接种四次。
11. 最后一次接种内皮细胞后，用培养基混合液填充所有移液枪头，并将装置置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中，每 12 小时更换两个腔室的培养基。

4. 监测内皮层形成的进展

1. 3天后可观察到内皮层完全覆盖微流控通道。使用以下两种方法之一监测内皮屏障的覆盖情况：荧光法或TEER法。可使用ImageJ软件对hCMEC/D3-DsRed荧光信号及其在通道区域的覆盖百分比进行定量分析。
   1. 在ImageJ中打开代表hCMEC/D3-DsRed屏障的TIFF文件。在ImageJ软件中，点击 文件 > 打开 以选择文件。
   2. 使用最大强度投影合并图像的所有Z层，操作路径如下： 图像 > 堆栈 > Z投影 > 所有Z切片，最大强度。
   3. 对所有采用该方法评估的微流控芯片使用相同的颜色阈值。本研究中使用的阈值为450。在ImageJ中通过以下路径设置阈值： 图像 > 调整 > 阈值。
   4. 设置需记录的测量参数，操作路径如下： 分析 > 设置测量项 > 限制在阈值范围内，面积分数。
   5. 在微流控通道中选择一个代表性区域进行测量，使用矩形框工具划定区域。该工具位于ImageJ主菜单中。使用相同大小的矩形框，在每个微流控通道的起始、中间和末端位置分别测量3个技术重复样本。
   6. 分析每个通道并记录面积分数，该数值代表内皮细胞的覆盖百分比。使用以下命令将这些测量结果导出为电子表格文件，以便绘图和可视化数据： 分析 > 测量。
2. 作为替代方法，可采用基于阻抗谱的TEER技术测量单位面积上的内皮紧密连接。利用TEER对内皮屏障进行定量，可作为评估内皮层屏障完整性的间接指标。
   1. 将两个电极分别置于上下腔室的入口和出口。
   2. 根据Srinivasan等人提出的模型^28,29，将内皮单层的阻抗量化为芯片中电阻、电感和电容的综合表现。

5. 将癌细胞接种到装置中

1. 内皮层成熟后，将癌细胞接种至装置中。用完全癌细胞培养基制备体积为1 mL、含1 × 10⁶个癌细胞的细胞悬液。
2. 更换芯片中的培养基，以补充细胞培养所需的营养物质。
3. 向每个上腔通道中加入30 µL悬浮的癌细胞，随后将装置放回培养箱中孵育15分钟。在同一装置中，始终将癌细胞接种于全部四个上腔通道的同一侧。
4. 每12小时更换一次装置中的新鲜培养基，并重新填充加样尖端，直至对装置进行成像以观察转移行为。

6. 通过共聚焦成像观察肿瘤微环境

1. 在预定的实验时间点（1、2 或 9 天），使用共聚焦成像技术获取微通道的三维图像。我们使用 Nikon A1 显微镜并按照此处描述的参数进行此步骤。该步骤为自动化操作，每个通道的成像时间为 20–40 分钟，具体时长取决于所包含的荧光通道数量以及覆盖所有细胞位置所需的 Z 轴深度。
2. 打开显微镜，启动软件，并将培养箱盖放置到显微镜上。
3. 如果设备支持，将显微镜载物台加热器设置为 37 °C，CO₂ 浓度设置为 5%。
4. 待显微镜培养箱环境稳定后，使用 50 mm × 75 mm 的载物台夹具将装置固定于显微镜载物台上。
5. 使用 10 倍物镜对装置的一侧（若后续使用提供的分析软件，则为左侧）进行聚焦，并将 Z 轴高度设为零。在 Z 轴层扫设置中，设定聚焦平面上方 100 µm 和下方 200 µm 的扫描范围。然后在拼接成像设置中，将 X 和 Y 方向的视野数分别设为 1 和 9，重叠率为 15%。将针孔设为推荐的最小值，Z 层高度设为 9 µm。调节明场曝光参数，使多孔膜清晰可见。开启 dsRed（561 nm）和 GFP（488 nm）通道的激发激光，并调节各荧光激光功率和截止值，使各通道信号可见且不出现像素过曝。
6. 逐个检查所有视野是否均处于清晰对焦状态。确认无误后，输入输出文件名（例如 001.nd2），开始实验以自动采集三维共聚焦图像。

7. 通过共聚焦断层扫描测量肿瘤微环境

1. 使用共聚焦断层成像技术，估算一组用于描述装置内单个细胞及肿瘤微环境的指标和测量值。共聚焦断层分析（图2）将共聚焦z轴堆叠图像转换为细胞的三维表征。在Jupyter notebook/lab环境中，通过自定义Python脚本，将一个平面匹配至形成类似血脑屏障膜的细胞层³⁰。最后，对癌细胞群体进行表型测量（表1）。
   1. 在实验结束时或时间序列过程中执行此分析。根据参考的软件指南安装Python及相应库，然后通过Windows命令提示符运行命令“conda activate”，接着运行“jupyter lab”以启动软件。Jupyter环境将在默认浏览器中加载。
   2. 在Jupyter文件浏览器中，双击Jupyter notebook文件“contom.ipynb”以打开。点击标题为导入库、自定义类/函数并设置notebook的单元格，然后点击播放按钮运行该单元格。以下所有notebook单元格均采用相同方式执行。请注意，此处的notebook“单元格”指的是Jupyter notebook中的一个Python代码块。
2. 准备数据。该算法使用可视化工具包（VTK）来操作和显示z轴堆叠图像及三维数据¹⁷。
   1. 将提供的.XLSX文件（“Experiment Tracker.xlsx”）放置在与Jupyter notebook相同的Windows文件夹中。该文件用于追踪实验并与其接口。将第6节中的ND2文件放入Jupyter notebook所在位置下的子文件夹“\Experiment_XXX\Confocal\”中。可通过将“XXX”替换为新文件夹的数字ID，在其中添加更多实验文件夹。
   2. 将第一个实验文件夹命名为“Experiment_001”，ND2文件命名为“001.nd2”。首先，将ND2成像文件转换为按颜色通道分离的拼接多图像TIFF文件。通过运行标题为“将共聚焦z轴堆叠读入内存”的notebook单元格，并取消注释Save_tiff_from_ND2()函数来完成此操作³⁰。ND2文件是尼康公司的专有成像格式，因此必须将其转换为开源软件兼容的格式。
      注意：TIFF（标签图像文件格式）被采用是因为其广泛通用、支持16位、易于导入VTK，并且可在单个文件中存储多个图像，适用于z轴堆叠图像。执行notebook单元格将从ND2文件读取图像，提取颜色和XYZ位置信息，然后根据预定义结构将图像存储在numpy数组中。随后使用python库tifffile将该数组保存为TIFF文件。
3. 将成像数据转换为三维模型
   1. 使用3D渲染将TIFF文件导入VTK（vtkTIFFReader）以可视化细胞（图2）。根据图像中细胞的颜色设定阈值。具体而言，VTK对象表示空间中（体积内）的一组像素块（X, Y, Z），但仅特定像素（绿色或红色）代表细胞，其余为背景或噪声（黑色）。
   2. 因此，对体积设置不透明度滤波器以去除背景，确保剩余的荧光信号仅来自细胞。通过调整Jupyter notebook单元格中“更改各显微镜通道的不透明度值”的Channel_alpha变量（例如GFP_alpha）来实现。使用标题为“查看3D渲染以验证阈值设置是否正确”的notebook单元格可视化效果。
   3. 将不透明度值保存至电子表格，供下一步使用。使用称为“行进立方体”（marching cubes）的技术³¹将体积数据转换为独立的三维对象，每个对象代表图像中的一个细胞。该算法从三维离散体素标量场中提取等值面的多边形网格。
   4. 在行进立方体算法中使用不透明度值，将每个细胞与背景分离。通过运行notebook中“将体素图像转换为三角网格并保存为VTK文件”的单元格，完成对各显微镜通道中识别出的所有荧光细胞的处理。
4. 将平面拟合至膜结构
   1. 通过首先定位内皮屏障的细胞质心来拟合平面（notebook单元格：分析RFP通道（内皮屏障））。遍历体积中的网格列表，使用VTK的PolyDataConnectivityFilter提取不相连的区域。计算每个网格的质心，并将测量值添加至质心列表，同时过滤掉过大或过小的网格（<50，>1000000个体素）。
   2. 使用误差最小化方法将平面拟合至内皮细胞的质心列表（notebook单元格：将平面拟合至RFP质心（内皮屏障））（图2，图3）³²。通过绘制平面与质心图来检查拟合效果，必要时手动调整（使用theta、beta和z参数），运行标题为“可视化RFP质心及平面拟合”的notebook单元格。
   3. 在平面正确拟合后，将该平面的法向量保存至Experiment Tracker File .XLSX文件中以供后续使用。
5. 分析单个癌细胞的描述性特征，包括以下描述符（表1）。
   注意：若执行分析的计算机运行缓慢，可选择通过高性能计算进行高通量分析。该算法在标准笔记本电脑上适用于少量细胞的分析，但VTK不适合处理大量独立对象（>1000个）。因此，可选择使用改进后的算法在高性能计算集群上运行。这使得对含大量细胞的实验实现快速分析（图2）。7.5节的全部操作通过运行标题为“分析其余显微镜通道以获取表型描述符”和“读取Experiment_tracker信息并分析存在的通道”的notebook单元格完成。
   1. 测量癌细胞的外渗：在用平面表征内皮层后，测量已迁移穿过膜的每个癌细胞的体积。对每个细胞进行剪切（布尔操作），保留膜下方的网格部分，去除膜上方的部分³³。然后闭合开放的网格（vtkFillHoles）。
      1. 重新计算剪切后网格的法向量和新质心。测量每个剪切后癌细胞的体积和位置用于分析。体积等同于该单个细胞网格所占据的体素数量。计算每个癌细胞位置与内皮平面之间的距离。
   2. 测量细胞表型：通过综合考虑细胞的形态、体积和位置，计算每个癌细胞的形态学特征。
6. 验证测量结果并保存至电子表格或绘图。运行标题为“检查质心测量是否准确”的notebook单元格，将弹出一个渲染窗口，显示按细胞类型叠加在成像体积上的已识别质心。所有实验完成后，在标题为“将数据导出为单个Data.XLSX文件”的notebook单元格中输入要包含的实验ID，替换变量experiments中的示例ID，将完整数据集导出为单个电子表格文件。若需验证已完成的数据集，使用标题为“外渗距离条形图”的notebook单元格进行绘图。图表将在notebook环境中显示并保存至文件。

8. 使用人工智能分析相关特征

注意：使用人工智能算法识别转移性表型特征。

1. 根据所示方案，使用 Orange 进行二分类 图5 和 补充文件 3从第二个 Windows 命令提示符窗口中，输入“conda activate”，然后输入“python -m Orange.canvas”以启动 Orange，随后点击 新 从提示中可见，Orange 是一款基于拖放操作的软件，因此需通过将左侧菜单中的各项功能拖拽至画布上并进行排列，以实现匹配 补充文件 3完成后，双击 文件 图标并选择 Data.XLSX 文件。
2. 使用“选择行”图标筛选数据，以去除不良测量值，这些不良测量值定义为未能通过布尔运算或产生超出已知范围的参数变量值的情况。双击该图标，并设置相应的筛选条件，例如“球形度介于0和1之间”。为8.2.1、8.2.2和8.2.3创建相应条件。
   1. 将渗出距离测量值的过滤范围设置为 -100 至 200 µm。
   2. 将细胞形态的球形度测量值过滤为0到1范围内的数值。
   3. 将癌细胞体积测量值过滤至0-2000个体素范围内。
   4. 使用所有参数变量（表1) 对脑转移性 MDA-MB-231-BR-GFP 和非脑转移性 MDA-MB-231-GFP 进行分类。双击 选择列 从画布中移除图标。使用 > 移动按钮 可获取的变量 或 特点, 目标变量，或 元属性唯一应作为变量的是 目标变量 是一个转移性标签，用于定义数据集中的细胞是否被视为具有转移性（1表示是，0表示否）。实验变量可放置在 元属性 部分
3. 将数据分为训练集（80%）和测试集（20%）。双击 数据采样器 图标并选择采样类型 数据的固定比例： 设置为80%，并选中可重复和分层复选框。针对每个模型/分类器，使用10折交叉验证对训练集进行分层和交叉验证。双击 测试 & 评分 并选择 交叉验证 与 折叠次数： 设为10 分层的 检查完毕。设置 目标类别 到 1.
4. 在此方法中，使用神经网络和随机森林学习算法，因为它们对数据具有较强的鲁棒性。在 随机森林 图标，选择 树木数量 50，并且不要选择任何其他选项。在 神经网络 图标 选择 隐藏层中的神经元数量r: 100, 激活函数：ReLU, 求解器：Adam, Alpha：0.0001，以及 最大迭代次数：200然而，这些参数设置会因研究而异，应用前应充分理解。
5. 设置画布后，双击每个图标 文件 到 样本数据 并点击 应用 或 发送数据. 双击 测试 & 评分 训练数据将开始用于通过算法开发模型。在完成机器学习模型的训练后，重新打开 测试 & 评分 并选择 测试数据上的测试 关闭弹出窗口，通过将芯片中的细胞按照其为脑转移性的概率（0 到 1 之间）进行分类，来评估模型的性能。
6. 将机器学习模型的性能保存到文件中（表 2）。包括ROC曲线下面积（AUC）、准确率和F1分数。另保存一个包含个体转移指数和分类概率的文件。双击 保存 图标并单击 另存为 将分类概率写入文件。类似地，可通过双击查看ROC曲线 ROC分析 图标，通过双击可计算模型性能 混淆矩阵 图标。

结果

利用该技术，我们分析了用不同荧光蛋白或染料标记的细胞类型。我们以含有 hCMEC/D3-DsRed 和非荧光星形胶质细胞的 µmBBN 芯片为例，展示了该方法的应用。将脑微血管内皮细胞接种到多孔膜（5 µm 轨迹蚀刻孔）上，并置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中培养³⁴。三天后，通过显微镜确认内皮层达到汇合状态，随后将癌细胞接种至内皮层上方。将两种乳腺癌细胞系——一种趋向脑转移的克隆 MDA-MB-231-BR-GFP 和亲本细胞 MDA-MB-231-GFP——引入含有星形胶质细胞脑微环境的 µmBBN 芯片中^{35,36,37,38,39,40,}

讨论

我们开发并提出了一种新方法，该方法借鉴了临床影像分析中常用的工具，用于测量癌细胞穿过内皮屏障进入脑组织的外渗和迁移过程。我们认为该方法既可用于体内也可用于体外测量；我们已在一种模拟脑血管系统的三维微流控系统上验证了其应用。该技术可定量分析癌细胞的多项指标，包括外渗距离、按体积计算的外渗百分比、球形度以及细胞体积。外渗距离和按体积计算的外渗百分比可帮助用户重建癌细胞在芯片内的位置，以评估其跨屏障外渗及在组织内的迁移情况。细胞形态参数如球形度和体积，则反映了细胞在各个时间点的动态运动或功能状态。迁移性 MDA-MB-231-BR-GFP 细胞在初次引入 µmBBN 装置时表现出较高的球形度，随着其运动减弱并开始定植于微环境，细胞形态逐渐变得不那么规则。MDA-MB-231-GFP 与 MDA-MB-231-BR-GFP 细胞的总体积存在差异，这是由于两种细胞系的形态不同所致。穿过内皮屏障的癌细胞比未穿越屏障的细胞更接近圆形，因此较小且更圆的细胞可能更高效地穿过内皮层实现外渗。

该方案中有两个关键步骤可确保实验成功。第一步是在组装由多孔膜分隔的 µmBBN 装置上部和下部时进行的。上下两...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含酚红的0.25%胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
带推杆的1.5 mm活检打孔器	Integra LifeSciences Corporation	33-31A-P/25
10倍浓缩MEM培养基	Thermo Fisher Scientific	11430030
150 mm培养皿	Fisher Scientific	FB0875714
不含钙和镁的1倍DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
200 μL移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-411
4英寸硅片	University Wafer	452
48 mm宽包装胶带	Fisher Scientific	19-072-097
50 × 75 mm玻璃载片	Fisher Scientific	12-550C
A1共聚焦显微镜	Nikon
丙酮	Fisher Scientific	A9-20
抗生素/抗真菌剂（青霉素/链霉素/两性霉素）	Gibco	15240062
美工刀片	Fisher Scientific	NC1721575
解剖剪刀	Fisher Scientific	08-951-5
含4.5 g/L葡萄糖的DMEM培养基	Thermo Fisher Scientific	11960-044
双面胶带	Fisher Scientific	NC0879005
EGM-2培养基	Lonza	CC-3162
胎牛血清，热灭活	Corning	MT35011CV
Fiji软件	ImageJ
玻璃小瓶	Fisher Scientific	03-341-25D
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
hCMEC/D3细胞系	EMD Millipore	SCC066
Jupyter Notebook	Anaconda
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030081
含酚红的生长因子减低型Matrigel	Corning	CB-40230A
MDA-MB-231细胞系	ATCC	HTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP细胞系	美国国立卫生研究院Dr. Patricia Steeg
N-2生长添加剂	Thermo Fisher Scientific	17502048
正常人星形胶质细胞（NHA）	Lonza	CC-2565
Orange软件	卢布尔雅那大学
巴斯德移液管	Fisher Scientific	13-711-9AM
光刻掩模	Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed质粒	密歇根大学载体核心
pLL-EV-GFP质粒	密歇根大学载体核心
pLOX-TERT-iresTK质粒	Addgene	12245
pMD2.G质粒	Addgene	12259
聚碳酸酯膜，5 μm孔径	Millipore	TMTP04700
psPAX2质粒	Addgene	12260
PureCol，3 mg/mL	Advanced Biomatrix	5005	Ⅰ型牛胶原蛋白
碳酸氢钠	Thermo Fisher Scientific	25080094
丙酮酸钠	Thermo Fisher Scientific	11360070
Solo杯	Fisher Scientific	NC1416545
SU-8 2075光刻胶	MicroChem Corporation	Y111074 0500L1GL
SU8显影液	MicroChem Corporation	Y020100 4000L1PE
Sylgard 184硅胶	Ellsworth Adhesive Company	NC0162601
甲苯	Sigma-Aldrich	179965-1L
三氯全氟辛基硅烷	Sigma-Aldrich	448931-10G