方法文章

利用器官芯片三维模型、机器学习与共聚焦层析技术定量分析脑转移肿瘤微环境

DOI：

10.3791/61654

⸱

2020年8月16日

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Ann Arbor, 2Rogel Cancer Center, University of Michigan Ann Arbor, 3Department of Neurosurgery, University of Michigan Ann Arbor, 4Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Ann Arbor

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种制备和培养血脑屏障转移性肿瘤微环境的实验方案，并利用共聚焦成像和人工智能（机器学习）对其状态进行定量分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑转移是致死性最高的癌症病灶；所有癌症中有10-30%会发生脑转移，中位生存期仅为约5-20个月，具体取决于癌症类型。为了减轻脑转移性肿瘤负担，必须弥补基础与转化研究知识方面的空白。主要挑战包括缺乏可重复的临床前模型及相关工具。将三维脑转移模型与专用分析工具相结合，可获得用于满足这些需求的相关分子和表型数据。此外，与小鼠模型相比，利用器官芯片模型模拟患者肿瘤细胞穿越血脑屏障进入脑微环境的过程，能够更快地获得结果，并且更易于通过定量方法进行解读，因而适用于高通量检测。本文中，我们描述并演示了一种新型三维微流控血脑微环境（µmBBN）平台的使用方法，该平台可长期（数天）培养微环境中的多个组分，通过共聚焦显微镜进行荧光成像，并采用创新的共聚焦层析技术对图像进行重建；所有这些均旨在以可重复且定量的方式理解微转移的发展过程以及肿瘤微环境（TME）的变化。我们展示了如何利用该平台进行癌细胞及TME中细胞和体液组分的制备、接种、成像与分析。此外，我们还展示了如何利用人工智能（AI）识别能够穿过模型µmBBN的癌细胞所具有的内在表型差异，并为其分配一个客观的脑转移潜能指数。该方法生成的数据集可用于回答有关转移机制、治疗策略有效性以及TME在其中作用的基础与转化科学问题。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑转移是致死性最高的癌症病灶；所有癌症中有10-30%会发生脑转移，中位生存期仅为约5-20个月，具体取决于癌症类型1,2。在研究癌症转移时，一个关键的科学问题是：亚克隆细胞如何从血液的体液环境中迁移至脑等器官3,4。这一问题催生了多种迁移、侵袭和血管外渗实验方法。这些方法均包含一个关键步骤，即计数或测量在刺激因素作用下从一个位置移动到另一个位置的细胞的特性。目前大多数可获取的迁移实验主要用于研究癌细胞的二维（2D）迁移，虽已揭示大量科学知识，但无法模拟体内系统真实的三维环境，而其他方法则可提供此类三维信息5。因此，有必要在三维（3D）体系中研究肿瘤微环境（TME），但目前可用于3D结构的分析方法仍有限且常缺乏一致性。

最常用的三维工具之一是Boyden小室，其结构为在孔底部悬挂一张膜，将两个不同区域分隔开。Boyden最初提出该检测方法用于研究白细胞趋化作用4。可通过改变下层区域的化学成分或其他方式6,7，诱导上层区域的细胞向下层迁....

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方案

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1. 准备血脑屏障微环境模具

注意：本平台使用的培养装置是一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的支架，用于构建细胞血脑屏障微环境。该装置由两部分组成，中间由多孔膜隔开。为制备血脑屏障微环境，需要使用光刻技术制备两个SU-8模具26,27。本方案将首先描述100 µm厚模具的制备，随后提供200 µm厚模具的相关说明。

  1. 制备模具时，先使用挤压瓶中的丙酮清洁一块4英寸的硅片，然后用氮气枪吹干。
    1. 将硅片置于加热板上，在200 °C下烘烤10分钟，以去除所有残留溶剂。
    2. 随后将硅片居中放置于匀胶机的卡盘上，并滴加1 mL SU8-2075以制备顶层模具。先以500 rpm（加速度300 rpm/s）旋转5秒以分散光刻胶，再以2200 rpm（加速度300 rpm/s）旋转30秒，获得厚度为100 µm的SU-8涂层。可能需要优化参数以达到指定厚度。
  2. 将硅片在加热板上于65 °C预烘2分钟，然后立即在98 °C下继续烘烤20分钟。
  3. 将硅片放入光刻曝光仪中，并按照标准操作程序将掩膜版居中对准硅片。使用230 mJ/cm2的紫外光B段（360 nm ± 10 nm）对涂覆SU-8的硅片进行曝光。可进行曝光剂量矩阵实验以确....

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结果

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利用该技术，我们分析了用不同荧光蛋白或染料标记的细胞类型。我们以含有 hCMEC/D3-DsRed 和非荧光星形胶质细胞的 µmBBN 芯片为例，展示了该方法的应用。将脑微血管内皮细胞接种到多孔膜（5 µm 轨迹蚀刻孔）上，并置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中培养34。三天后，通过显微镜确认内皮层达到汇合状态，随后将癌细胞接种至内皮层上方。将两种乳腺癌细胞系——一种趋向脑转移的克隆 MDA-MB-231-BR-GFP 和亲本细胞 MDA-MB-231-GFP——引入含有星形胶质细胞脑微环境的 µmBBN 芯片中35,36,37,38,39,40,

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讨论

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我们开发并提出了一种新方法，该方法借鉴了临床影像分析中常用的工具，用于测量癌细胞穿过内皮屏障进入脑组织的外渗和迁移过程。我们认为该方法既可用于体内也可用于体外测量；我们已在一种模拟脑血管系统的三维微流控系统上验证了其应用。该技术可定量分析癌细胞的多项指标，包括外渗距离、按体积计算的外渗百分比、球形度以及细胞体积。外渗距离和按体积计算的外渗百分比可帮助用户重建癌细胞在芯片内的位置，以评估其跨屏障外渗及在组织内的迁移情况。细胞形态参数如球形度和体积，则反映了细胞在各个时间点的动态运动或功能状态。迁移性 MDA-MB-231-BR-GFP 细胞在初次引入 µmBBN 装置时表现出较高的球形度，随着其运动减弱并开始定植于微环境，细胞形态逐渐变得不那么规则。MDA-MB-231-GFP 与 MDA-MB-231-BR-GFP 细胞的总体积存在差异，这是由于两种细胞系的形态不同所致。穿过内皮屏障的癌细胞比未穿越屏障的细胞更接近圆形，因此较小且更圆的细胞可能更高效地穿过内皮层实现外渗。

该方案中有两个关键步骤可确保实验成功。第一步是在组装由多孔膜分隔的 µmBBN 装置上部和下部时进行的。上下两.......

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披露

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无任何需要声明的披露事项。

致谢

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我们感谢美国国家癌症研究所Steeg实验室慷慨提供MDA-MB-231-BR-GFP细胞。共聚焦显微镜实验在密歇根大学生物界面研究所（BI）完成。流式细胞术在密歇根大学流式细胞术核心实验室完成。病毒载体由密歇根大学载体核心实验室构建。我们还感谢Kelley Kidwell在本数据统计分析方面提供的指导。

资助：

C.R.O. 部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）T-32 培训基金（T32CA009676）和 1R21CA245597-01 项目的支持。T.M.W. 部分得到了 1R21CA245597-01 项目以及美国国立卫生研究院转化科学促进中心（Award Number UL1TR002240）的支持。材料与表征工作的经费由美国国立卫生研究院国家癌症研究所（Award Number 1R21CA245597-01、P30CA046592、5T32CA009676-23、CA196018）、AI116482、METAvivor 基金会和乳腺癌研究基金会提供。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含酚红的0.25%胰蛋白酶-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
带推杆的1.5 mm活检打孔器Integra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10倍浓缩MEM培养基Thermo Fisher Scientific11430030
150 mm培养皿Fisher ScientificFB0875714
不含钙和镁的1倍DPBSThermo Fisher Scientific14190144
200 μL移液器吸头Fisher Scientific02-707-411
4英寸硅片University Wafer452
48 mm宽包装胶带Fisher Scientific19-072-097
50 × 75 mm玻璃载片Fisher Scientific12-550C
A1共聚焦显微镜Nikon
丙酮Fisher ScientificA9-20
抗生素/抗真菌剂（青霉素/链霉素/两性霉素）Gibco15240062
美工刀片Fisher ScientificNC1721575
解剖剪刀Fisher Scientific08-951-5
含4.5 g/L葡萄糖的DMEM培养基Thermo Fisher Scientific11960-044
双面胶带Fisher ScientificNC0879005
EGM-2培养基LonzaCC-3162
胎牛血清，热灭活CorningMT35011CV
Fiji软件ImageJ
玻璃小瓶Fisher Scientific03-341-25D
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
hCMEC/D3细胞系EMD MilliporeSCC066
Jupyter NotebookAnaconda
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030081
含酚红的生长因子减低型MatrigelCorningCB-40230A
MDA-MB-231细胞系ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP细胞系美国国立卫生研究院Dr. Patricia Steeg
N-2生长添加剂Thermo Fisher Scientific17502048
正常人星形胶质细胞（NHA）LonzaCC-2565
Orange软件卢布尔雅那大学
巴斯德移液管Fisher Scientific13-711-9AM
光刻掩模Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed质粒密歇根大学载体核心
pLL-EV-GFP质粒密歇根大学载体核心
pLOX-TERT-iresTK质粒Addgene12245
pMD2.G质粒Addgene12259
聚碳酸酯膜，5 μm孔径MilliporeTMTP04700
psPAX2质粒Addgene12260
PureCol，3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005Ⅰ型牛胶原蛋白
碳酸氢钠Thermo Fisher Scientific25080094
丙酮酸钠Thermo Fisher Scientific11360070
Solo杯Fisher ScientificNC1416545
SU-8 2075光刻胶MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8显影液MicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184硅胶Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
甲苯Sigma-Aldrich179965-1L
三氯全氟辛基硅烷Sigma-Aldrich448931-10G

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
  2. Wang, R., et al.

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