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方法文章

在自由活动小鼠杏仁核中使用头戴式微型显微镜成功实现活体钙成像

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DOI：

10.3791/61659

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2020年8月26日

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2KAIST Institute for BioCentury (KIB), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

本文内容

摘要

在体微型内窥镜钙成像是一种不可或缺的工具，可实现对自由活动动物神经元活动的实时监测。然而，将该技术应用于杏仁核一直存在困难。本方案旨在为在小鼠中成功利用微型显微镜靶向杏仁核细胞提供一项实用的操作指南。

摘要

在自由活动的动物体内实时监测神经元活动是将神经元活动与行为联系起来的关键方法之一。为此，已开发出一种体内成像技术，该技术利用基因编码的钙指示剂（GECIs）、微型荧光显微镜和梯度折射率（GRIN）透镜来检测神经元中的钙瞬变，并已成功应用于多种脑结构1,2,3,4,5,6。该成像技术特别强大，因为它能够对基因定义的细胞群体进行长期慢性同步成像，持续时间可达数周。尽管该技术具有实用性，但将其应用于位于大脑深部的脑区（如杏仁核）仍存在困难，而杏仁核是情绪处理和联想性恐惧记忆的关键脑结构7。有多个因素导致该成像技术难以应用于杏仁核。例如，在较深脑区进行成像时，通常更容易出现运动伪影，因为植入大脑深部的头戴式显微镜相对不稳定。另一个问题是侧脑室靠近植入的GRIN透镜，其在呼吸过程中的移动可能引起高度不规则的运动伪影，这些伪影难以校正，从而难以获得稳定的成像视野。此外，由于杏仁核中的细胞在静息或麻醉状态下通常活动较弱，因此在基板定位过程中很难发现并聚焦表达GECI的目标细胞，以供后续成像使用。本实验方案为如何高效地利用头戴式微型显微镜靶向杏仁核中表达GECI的细胞提供了有益的指导，以实现在此类深部脑区成功进行体内钙成像。需指出的是，本方案基于特定系统（例如 Inscopix），但并不局限于该系统。

引言

钙是一种普遍存在的第二信使，在几乎所有细胞功能中都发挥着关键作用8在神经元中，动作电位的发放和突触输入会引起细胞内游离[Ca2+]9,10因此，追踪钙瞬变可为监测神经元活动提供一种有效手段。GECIs 是功能强大的工具，可用于监测[Ca2+在定义的细胞群体和细胞内区室中11,12在众多基于蛋白质的钙离子指示剂中，GCaMP 是一种 Ca2+ 基于单个GFP分子的探针13是目前经过最优化且应用最广泛的GECI。经过多轮工程化改造，已开发出多种GCaMP变体12,14,15,16我们在此方案中使用了一种近期开发的GCaMP蛋白GCaMP7b。16GCaMP 传感器极大地促进了多种模式生物神经回路功能的研究，例如钙成像2+ 发育过程中的瞬时现象17在特定皮层中的活体成像18运动任务学习中神经回路动态的测量19 与海马体和杏仁核中关联性恐惧记忆相关的细胞群体活动的成像20,21.

GECI的光学成像具有多项优势22。遗传编码使GECI能够在由基因特征或特定解剖连接模式定义的特定细胞亚群中长期稳定表达。光学成像技术可在活体动物中对数百至数千个神经元进行长期同步监测。目前已开发出若干种光学成像系统，用于在自由活动的小鼠脑内对GECI进行活体成像与分析，这些系统结合了头戴式微型荧光显微镜21,23,24,25。尽管基于GECI、GRIN透镜和头戴式微型显微镜的活体光学成像技术是研究神经环路活动与行为之间关联的有力工具，但由于存在若干技术难题，将其应用于杏仁核仍具挑战性，这些问题包括：难以将GRIN透镜精准定位至表达GECI的杏仁核细胞，同时避免产生严重影响图像采集质量的运动伪影，以及难以可靠地识别表达GECI的细胞。本实验方案旨在为基板固定和GRIN透镜植入等关键手术步骤提供实用的操作指南，这些步骤对于成功实现杏仁核的活体光学钙成像至关重要。尽管本方案以杏仁核为靶区，但其中描述的大多数操作步骤同样适用于其他深层脑区。尽管本方案基于特定系统（例如Inscopix），但使用其他替代系统也可轻松实现相同目的。

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方案

所有实验程序均经韩国科学技术院动物伦理委员会批准。所有实验均遵循机构动物护理和使用委员会的指南进行。

注意：本方案包含六个主要步骤：病毒注射手术、GRIN透镜植入手术、GRIN透镜植入位置的验证、基板固定、在行为测试期间对GCaMP信号进行光学记录，以及数据处理（图1A）。除手术步骤外，其余均使用商业软件套件（Inscopix）完成。

1. 立体定位手术——AAV病毒注射

注意：本手术所使用的小鼠品系为 C57BL6/J。手术过程中，小鼠身体需覆盖无菌手术巾，且操作人员需佩戴无菌手套执行本方案中的所有步骤。通常情况下，不建议在同一天内进行多台手术；然而，若确需在同一天对多只小鼠实施相同手术，则每只小鼠应使用独立的一套经高压灭菌的手术器械，并在各只小鼠之间使用 70% 乙醇对手术器械进行消毒。为在手术过程中维持小鼠体温，将小鼠固定于立体定位仪后，需用定制的手术保温毯覆盖小鼠身体。

  1. 使用70%乙醇对所有必需的手术器械进行消毒，并准备好Hamilton注射器和玻璃移液管。用蒸馏水填充玻璃移液管。
    注意：本方案中使用的所有手术器械均已进行高压灭菌。由于GRIN透镜和颅骨螺钉不能高压灭菌，因此使用70%乙醇作为消毒剂以防止炎症发生。尽管尚未尝试，但也可使用其他形式的灭菌方法，例如气体或化学灭菌。
  2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（83 mg∙kg-1 体重）麻醉小鼠。待小鼠失去意识后，剃除颅骨部位的毛发。
  3. 用70%乙醇清洁颅骨上方的皮肤，并将小鼠固定在立体定位仪上。使用棉签蘸取35%过氧化氢溶液小心去除皮肤并擦拭颅骨表面。涂抹润滑性眼膏以防止手术期间角膜干燥。
    注意：虽然通常仅使用70%乙醇进行无菌皮肤准备并无问题，但仍建议交替使用三种消毒剂（如碘伏或氯己定溶液）与70%乙醇各三次。本方案中使用较高浓度的过氧化氢是为了确保尽可能彻底地清除小鼠颅骨上的结缔组织，这对于减少后续成像过程中的运动伪影至关重要，因为颅骨上的结缔组织会影响基板与颅骨的牢固粘附。需注意的是，35%过氧化氢的浓度远高于常规使用的浓度（3%）。
  4. 将定位针固定在立体定位探针夹持器上。调整前囟（bregma）与后囟（lambda）的高度，使其与定位针对齐。
  5. 确定小鼠颅骨上开颅的位置。
    注意：本方案中用于病毒注射的侧杏仁核（LA）坐标为（AP, ML, DV）=（-1.6 mm, -3.5 mm, -4.3 mm），以bregma为参考点（AP：前后方向，ML：内外侧方向，DV：背腹方向，各缩写表示相对于bregma的轴向距离）26。应根据每种实验条件优化坐标参数。
  6. 钻开颅骨表面（图1B）。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗颅骨碎屑。使用镊子或27 G针头去除残留的骨层。
    1. 钻颅骨时，尽量避免接触最内层的硬脑膜，以防损伤脑组织表面。脑表面受损会导致透镜周围发生炎症，从而在记录过程中引起严重的运动伪影和高自发荧光。开颅区域直径为1.6 mm。钻头转速为18,000 rpm，钻头尺寸为0.6 mm。
  7. 为将GRIN透镜从钻孔处的脑组织表面下降至目标杏仁核位置，需计算一个称为“值A”的距离，即从基于bregma设定的透镜植入DV坐标（本例中为4.2 mm，图1C）减去bregma与暴露的脑表面之间的DV差值。
  8. 在玻璃移液管中加入3 µL矿物油和0.7 µL AAV病毒溶液。
    注意：矿物油有助于分离病毒溶液与水。0.7 µL是针对LA区域病毒注射的优化体积，可充分覆盖整个LA区域。
  9. 从立体定位探针夹持器上取下定位针，并将玻璃移液管固定于其上。
  10. 将玻璃移液管定位至步骤1.5所述的注射位点。待出血完全停止后，将玻璃移液管插入脑组织。
  11. 使用注射泵通过玻璃移液管递送病毒。
    注意：病毒滴度应高于1 × 1013 vg/mL，以获得足够数量表达GCaMP的细胞。注射速度为0.1 µL/min，扩散时间为10分钟。若出现出血，用PBS清洗脑表面。此步骤中应保持脑表面湿润。
  12. 完成注射后，缓慢取出玻璃移液管。

2. 立体定位手术——梯度折射率透镜植入

注意：GRIN透镜植入手术是本方案中最关键的步骤。由于GRIN透镜移动速度的稳定性对成功植入至关重要，因此使用电动手术臂可能非常有帮助。电动手术臂是一种由计算机软件控制的立体定位操纵器。尽管本方案中采用了电动手术臂，但只要能保证透镜在植入过程中以稳定且缓慢的速度移动，也可使用其他方法。有关该设备的详细信息见于 材料表.

  1. 钻孔颅骨以植入两枚颅骨螺钉。用PBS冲洗所有颅骨碎片。
    注意：为了减少后续光学成像中的运动伪影，至少需要植入两枚螺钉。两枚颅骨螺钉与GRIN透镜植入位置构成一个等边三角形图1B颅骨开窗的大小应与螺钉直径紧密匹配。若有出血，用PBS冲洗出血表面。钻孔速度为18,000 rpm，钻头尺寸为0.6 mm。
  2. 用70%乙醇对螺钉进行消毒，以防止炎症。将螺钉尽可能深地植入。
    注意：螺钉应牢固固定，无需使用水泥等额外粘合剂。
  3. 在立体定位仪框架上安装电动手术臂。将所需硬件连接至已安装控制软件的笔记本电脑材料表).
  4. 在降低梯度折射率透镜之前，准备使用26 G针头制作针道。
    注意：针道是一种引导性通道，有助于将相对较粗的GRIN透镜植入杏仁核等深部脑区，同时避免在注射路径上对脑结构造成严重扭曲。这种引导通道被称为针道，因为它是由较细的26 G针头通过下降和提升操作形成的。
  5. 将套管固定器安装到立体定位仪框架上，以稳定固定针头。
  6. 用套管夹夹住26 G针头，并计算针头插入位置的坐标。
    注意：在本方案中，针头插入位置的坐标为 50 µm 病毒注射位点外侧（前后，内外，背腹）=（-1.6 mm，-3.55 mm，-3.7 mm）。
  7. 打开控制软件并完成针头位置调节的准备工作。
    1. 运行控制软件并选择 开始新项目 单击按钮以开始控制会话。
      注意：在控制界面中，有多个空白框和菜单按钮。空白框用于输入坐标。在空白框中输入坐标后，点击按钮即可移动电动立体定位臂 前往 按钮。该 前往 按钮变为一个 停止 当立体定位臂移动时按下按钮。在多个菜单按钮中，仅有 工具 本方案中需要使用按钮。
    2. 点击 工具 按钮。通过点击校准控制软件 校准框架 菜单按钮。校准是将操纵器的实际位置设定为数值的过程 立体定位驱动器 软件。
  8. 使用立体定位仪将针尖定位在颅骨表面暴露的脑组织表面。
    注意：使用以下方法设置针头的速度 微型驱动器速度 菜单中的 工具 菜单。默认速度为 3.0 mm/s，但此步骤建议使用 0.5 mm/s 的速度。针头的移动由方向键控制。
  9. 加入2-3滴PBS以保持脑表面湿润。在计算机屏幕的空白框中填写LA相应的DV坐标。若脑表面干燥，将阻碍针头进入脑组织。
  10. 降低26 G针头，方法是点击 前往 按钮。当针头到达由DV坐标设定的目标位置时，它会自动停止。针头的速度为 100 µm/min如果出现出血，通过点击停止针头 停止 按下按钮，并用PBS冲洗脑表面。此步骤中需保持脑表面湿润。止血后，再次开始缓慢下降。
  11. 当针头完全停止移动后，在电脑屏幕的空白框中输入 45.00 mm。
    注意：45.00 mm 是使针头返回起始位置的 DV 坐标值。
  12. 通过单击提升针头 前往 按钮。针头移动速度为100-200 µm/min.
  13. 当针头停止移动后，移除脑表面的PBS。从立体定位仪上拆下针头和套管固定装置。实验人员可通过点击 停止 必要时按下按钮。
  14. 将立体定位杆安装上透镜架。将GRIN透镜安装到透镜架上。
    注意：本实验方案使用针对LA优化的GRIN透镜（直径0.6 mm，长度7.3 mm）。如果未准备透镜固定器，可使用鳄鱼夹夹持GRIN透镜作为替代方法。
  15. 用70%乙醇对镜头进行消毒，并将立体定位杆连接至立体定位仪框架上。
  16. 在颅骨表面的指定位置定位GRIN透镜的尖端（方法同步骤2.8所述）。
    注意：GRIN透镜的坐标为（前后，内外，背腹）= （-1.6 mm，-3.55 mm，-4.2 mm）图1C）。镜头不应接触颅骨，以免损坏其尖端。
  17. 通过从第2.16步所述晶状体植入位置的DV坐标中减去“值A”的绝对值，计算新的DV坐标。
  18. 在脑表面滴加2-3滴PBS。进入 1000 µm 用于降低和 300 µm 用于在计算机屏幕的空白框中提升镜头。
  19. 重复降低（1000 µm 向下）和提升（300 µm 将GRIN透镜缓慢上下移动，直至到达目标位置。这种上下移动的操作有助于释放因透镜下降过程中对脑组织产生的压力，否则该压力可能导致植入路径上的脑结构发生变形。
    注意：GRIN透镜移动的速度 100 µm/min即使有出血，也不要停止移动GRIN透镜，并用PBS冲洗脑表面。此步骤中需保持脑表面湿润。若脑表面干燥，脑组织会黏附在GRIN透镜表面，导致脑结构变形。
  20. 如果GRIN透镜到达目标位置，移除PBS，并在GRIN透镜、螺钉及其侧壁周围小心地涂抹树脂牙科水泥，图 1D).
    注意：将树脂水泥涂覆整个颅骨可能减少运动伪影。相反，如果树脂水泥意外覆盖附着在颅骨上的肌肉，则会增加运动伪影。
  21. 树脂牙科水泥硬化后，将梯度折射率透镜从透镜架上拆下，并在整个颅骨上涂抹丙烯酸水泥（图1D).
  22. 为安装头板，先将镜头架从立体定位杆上拆下，然后用胶带将头板固定在定位杆的尖端。确认头板是否水平。
    注意：倾斜的头固定板会导致视角倾斜。在移动式家庭笼系统中（位于底板连接部分），需要使用头固定板来固定小鼠头部。如果实验人员不使用该系统，可跳过此步骤（步骤 2.22）及后续步骤 2.23。
  23. 缓慢降低杆体，直至头板位于镜筒顶部，然后放下头板 1000 µm 移动用于植入式GRIN透镜的头板，使其位于头板内环的右侧边缘。
    注意：头部固定板的位置应低于植入的GRIN透镜表面；否则，由于丙烯酸胶的存在，微型内窥镜将无法足够接近植入的GRIN透镜以调节焦平面。
  24. 将丙烯酸水泥涂抹于头板与水泥层之间以进行粘接（图1D).
  25. 在植入的GRIN透镜表面覆盖一层石蜡膜，以保护透镜表面免受灰尘污染。然后在石蜡膜上涂抹可移除的环氧胶，以确保石蜡膜牢固地附着在透镜表面。
  26. 在小鼠腹腔内注射镇痛剂卡洛芬（Carprofen，0.5 mg/mL PBS溶液）和抗炎药物地塞米松（Dexamethasone，0.02 mg/mL PBS溶液）。
    注意：药物剂量取决于体重：卡洛芬（5 mg∙kg-1 体重）和地塞米松（0.2 mg∙kg-1 体重）。术后给予卡洛芬和地塞米松，每天一次，持续7天。 
  27. 将0.3 mg/mL的阿莫西林（一种抗生素）混入小鼠笼内饮用水中，持续给药1周。
  28. 将小鼠放回原笼，恢复5-8周，以完成病毒转导。
    注意：小鼠在电热毯上一个预热的笼子中恢复，直至从麻醉状态苏醒。

3. 验证 GRIN 透镜植入

注意：GRIN透镜植入的验证可提供信息，判断植入的GRIN透镜是否准确靶向表达GCaMP的细胞。根据此信息，实验人员可通过排除GRIN透镜植入位置偏离目标的动物，避免在耗时的行为测试和数据处理上浪费时间。在验证过程中，应将表达GCaMP的细胞聚焦于记录视野中。此步骤使用可移动的饲养笼。可移动饲养笼是一种特殊设计的圆形装置，可在验证GRIN透镜植入和基板固定时，允许头部固定的动物自由活动其腿部。该装置配备一个气浮平台，头部固定的动物腿部置于其上，从而在头部固定的同时实现腿部的自由运动。杏仁核外侧核的细胞在静息或麻醉状态下通常处于静止状态，因此在这些条件下几乎无法检测到GCaMP荧光信号，这使得在验证GRIN透镜植入和基板固定时很难甚至无法定位表达GCaMP的细胞。然而，腿部运动常可引发杏仁核外侧核细胞产生GCaMP荧光信号，从而有助于显微镜定位。因此，本实验方案中使用可移动饲养笼。

  1. 将立体定位仪组装到移动式家笼系统上。
  2. 用1.5%异氟烷气体麻醉小鼠。待小鼠完全失去意识后，将其放置于移动式家庭笼系统头部固定杆上。
  3. 将碳笼置于小鼠下方。关闭碳笼并打开气流，使笼子能够无摩擦自由移动。等待数分钟，直至小鼠恢复活跃状态。
    注意：每种实验条件下的气流速度均需优化（此处为 100 L/min）。
  4. 去除植入的GRIN透镜表面的石蜡膜和环氧树脂胶，并用镜头纸蘸取70%乙醇擦拭透镜表面。
  5. 准备数据采集（DAQ）软件（例如 Inscopix），设置成像条件。
    注意：DAQ 软件用于控制显微镜（LED 光源功率、物镜焦距等）.）和数据存储。
    1. 打开数据采集箱，并将显微镜连接至该设备。然后，使用数据线直接连接或通过无线网络将其连接到笔记本电脑。
      注意：数据采集（DAQ）软件安装在称为DAQ盒的额外硬件中（例如 Inscopix）。通过将DAQ盒连接到笔记本电脑，即可在笔记本电脑上访问DAQ软件。
    2. 通过互联网浏览器访问DAQ软件（推荐使用Firefox）。
    3. 设置所有必要信息（日期、小鼠编号等）.）在 定义的实验环节然后点击 保存并继续保存后，访问 运行实验.
    4. 在 运行实验设置成像条件，如曝光时间、增益、电子聚焦和LED曝光功率。
      注意：增益和曝光-LED 功率可根据实验室条件进行调整。电聚焦的推荐值为 500，曝光时间为 50 ms。改变 LED 功率和增益无限制，但较高强度的光照可能导致更明显的漂白。录像的曝光时间决定了视频录制的帧率。较高的帧率会降低信号强度。应根据成像所用的 GECIs 优化帧率。
  6. 将显微镜固定在立体定位仪上时，需将带有显微镜夹持器的立体定位杆连接至立体定位仪。
    注意：夹持器是一种小型附件，可安装在立体定位仪上，用于固定显微镜主体，以便将其放置到目标脑区位置。
  7. 用显微镜夹持器固定显微镜。打开连接显微镜的LED光源，并将显微镜调整至垂直位置。一边观察图像一边降低显微镜，直至植入的GRIN透镜表面清晰可见。
  8. 将植入的GRIN透镜中心与视野中心对齐。
    注意：此步骤可进行GRIN透镜植入的验证（见结果部分） 图2B, 图2D, 图 2F).
  9. 拍摄植入的GRIN透镜表面图像（点击 Prt Sc 键盘上的按钮）。植入的GRIN透镜表面的图像在后续数据处理过程中用于取消选择非神经元成分（步骤6.8）。
  10. 找到显微镜的合适位置。在观察图像的同时，缓慢升高显微镜的物镜，以寻找表达GCaMP7b的细胞。
    注意：可能需要调整图像采集的增益或曝光-LED 功率。此步骤可进行 GRIN 透镜植入的验证（见结果部分）。 图2A, 图2C, 图2E).

4. 基板连接

注意：基板安装步骤在GRIN透镜植入验证完成后进行。基板是将显微镜固定在小鼠头部的平台。如前一节所述，本实验方案中使用可移动的饲养笼。

  1. 验证GRIN透镜植入成功后，从显微镜夹持器上拆下微型显微镜。
  2. 将基板安装到显微镜上。使用六角扳手拧紧螺丝，以确保基板与显微镜稳定连接。
  3. 用显微镜夹持器夹住显微镜。打开连接至显微镜的LED光源，并将显微镜垂直对齐。缓慢下放显微镜，直至观察到植入的GRIN透镜表面。将植入的GRIN透镜中心与视野中心对齐。
  4. 找到显微镜的合适位置。缓慢提升显微镜的物镜，直至找到能够获得GCaMP7b表达细胞最佳图像的焦平面（图2A）。
    注意：在此步骤中，可能需要调整图像采集的增益或LED曝光功率。
  5. 使用丙烯酸水泥将基板牢固地固定在头板上（图2G）。在基板与头板之间用丙烯酸水泥构建侧壁。
    注意：丙烯酸水泥在固化过程中会收缩。因此，在水泥完全固化前不得移除显微镜（此过程至少需要30分钟）。操作时应格外小心，避免丙烯酸水泥将显微镜及其物镜意外粘连。
  6. 待丙烯酸水泥完全固化后，松开螺丝，并缓慢提升显微镜主体。
  7. 若侧壁存在缝隙，需重新进行额外的封固，以防止灰尘污染植入的GRIN透镜。
  8. 盖上基板以保护植入的GRIN透镜免受灰尘污染，并拧紧基板的固定螺丝。
  9. 将头板从头杆上松开，将小鼠放回饲养笼，等待后续光学成像实验。

5. 行为测试期间 GCaMP 信号的光学记录

注意：在行为过程中进行GCaMP信号记录的步骤可能因所使用的光学成像系统、实验设计和实验室环境的不同而有较大差异。因此，本节仅对其进行简要描述。

  1. 在行为学测试前进行数天的抓握训练。
  2. 准备行为学实验装置（例如，恐惧条件反射箱、行为学软件和Coulbourn仪器）及笔记本电脑。
  3. 将显微镜插入数据采集盒，并打开数据采集盒。
  4. 通过无线网络连接将数据采集箱（DAQ box）连接到笔记本电脑。
  5. 在笔记本电脑上启动数据采集软件（建议使用 Firefox 浏览器）。点击 文件管理器 按钮并检查数据采集箱的剩余存储容量，以保存记录的数据。
    注意：30 分钟记录的数据量约为 80 GB。
  6. 输入必要信息（日期、小鼠编号等）.）在 定义的会话 并进入 运行实验.
  7. 轻轻抓住小鼠，取下其头部的基板盖。将显微镜放置在基板平台上。
  8. 拧紧基板螺丝，将装有头戴式微型内窥镜的动物放入行为实验箱中。
    注意：如果操作不够稳妥，小鼠在此步骤中会试图逃脱。
  9. 使用BNC电缆将NI板连接到DAQ箱的TRIG端口。NI板接收来自行为学软件（例如FreezeFrame）的TTL信号，并协调GCaMP信号与动物行为的同步记录过程。
  10. 调整焦平面。
    注意：焦平面由显微镜物镜与植入脑内的GRIN透镜之间的距离决定。调整焦平面时，需在观察图像的同时调节物镜的位置。当两透镜之间的距离能够清晰显示细胞和血管形态时，即设定为成像的焦平面。在本方案中，使用DAQ软件控制调节过程中物镜的移动。
  11. 设置优化的曝光时间、增益和LED功率 运行实验.
    注意：通常曝光时间设置为 50 ms。增益和 LED 功率根据图像直方图进行调整。直方图表示像素荧光强度的分布情况。通过目视检查，对于 GCaMP7b，直方图右侧边缘的值应介于 40% 至 60% 之间。具体数值会因所使用的 GECI 而异。
  12. 更改记录选项为 触发记录点击 记录 并开始行为实验。
    注意：触发录制选项可提供录制会话与行为会话的同步时间线。当接收到TTL信号时，TRIG端口上方的红灯会亮起。
  13. 行为测试结束后，取下显微镜并安装基板盖。
  14. 将小鼠放回其居住笼中。然后，选择 文件管理器 并从DAQ盒导出数据。
  15. 行为测试结束后，处死小鼠以进行死后组织学验证。

6. 数据处理

注意：数据处理流程因所使用的数据处理软件和成像实验中采用的基因编码钙离子指示剂（GECIs）不同而有很大差异。因此，本节仅作简要描述。本方案使用商业化的数据处理软件（参见材料表）。此外，讨论部分提到的其他开源软件也可无障碍使用。本方案中使用的变量列于表1中。

  1. 将记录的视频数据文件（1280 像素 × 800 像素）从 DAQ 盒导入台式计算机进行数据处理。启动数据处理软件。
    注意：数据处理软件不同于前几步中使用的 DAQ 软件。在数据处理软件中，包含 6 个步骤：降采样、裁剪、空间滤波、运动校正、ΔF/F 计算和事件检测，这些步骤对于从记录的视频中提取单细胞钙瞬变数据是必需的。
  2. 对视频进行降采样和裁剪。
    注意：降采样和裁剪对于提高数据处理速度是必要的。裁剪掉除 GCaMP 信号观测区域以外的区域。
  3. 应用空间滤波。应用空间滤波后，生成平均强度投影图像。
    注意：空间滤波可区分记录视频图像中的每个像素，并提供高对比度图像。有两种类型的截止滤波器：低通和高通滤波器。较高的低通滤波器值可增强图像对比度，但整体灰度噪声也会随之增加；较低的高通滤波器值会使图像变得模糊。
  4. 应用运动校正。使用平均强度投影图像作为运动校正的参考图像。
  5. 再次应用运动校正，使用第一帧图像作为参考图像。
    注意：两步运动校正可显著减少运动伪影。
  6. 应用 ΔF/F 计算，以可视化显示亮度发生变化的像素。
    注意：像素亮度的变化是由 GCaMP 荧光强度的变化引起的，表明存在钙瞬变。
  7. 应用 PCA/ICA 算法，以可视化每个细胞的钙瞬变曲线。
    注意：PCA/ICA 是一种将一组数据分解为若干独立成分数据的算法。各参数应根据实验室具体条件进行优化。在本方案中，除 ICA 时间权重（本方案中使用 0.4）外，其余参数均为默认值27。
  8. 根据下述说明中的标准，手动取消选择已识别成分中的非神经元成分。
    注意：此过程使用两个主要标准。第一，源自神经元的 GCaMP 信号呈清晰的球形。因此，仅选择具有清晰球形形态的信号作为神经元。第二，已知杏仁核锥体细胞胞体直径约为 20 µm28,29,30，因此仅选择大小与此相近的信号作为神经元。为确定 GCaMP 信号的大小，需基于镜头表面的捕获图像（步骤 3.9）计算单个像素的实际尺寸，并计算单个球形结构的最大宽度。例如，在本方案中，植入的 GRIN 镜头直径为 600 µm。因此，若镜头直径为 800 像素，则单个像素的实际尺寸为 1.5 µm（20 µm 约为 7 像素）。
  9. 应用事件检测功能，以检测钙瞬变的显著增加（钙事件）。
    注意：此步骤需要一个称为“事件最小衰减时间”（τ）的参数。在本方案中，GCaMP7b 的优化参数值为 1.18 s。平均半衰期（t1/2 = 0.82 s）是基于细胞自发活动期间的 ΔF/F 曲线计算得出的。由于 GCaMP 遵循指数衰减，τ = 半衰期公式 t1/2 除以 ln(2)，方程，衰减率计算。。

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结果

GRIN透镜植入的验证
在通过粘合将基板长期固定于脑组织之前，需对GRIN透镜的植入效果进行验证。在透镜植入成功动物中，可在显微镜物镜与植入的GRIN透镜之间距离所决定的焦平面范围内，清晰观察到表达GCaMP的细胞和血管（图2A和B）。相比之下，在植入位置偏离目标区域的动物中，焦平面范围内无法观察到清晰的GCaMP表达细胞图像（表现为失焦或超出视野）。在失焦情况下，血管图像清晰，但细胞在焦平面范围内仅呈现模糊影像（图2C和D）；在超出视野的情况下，大多数情况下无法观察到血管，且焦平面范围内未检测到荧光信号（图2E）。此外，与其他情况不同，植入的GRIN透镜边缘呈现明亮光环（图2F）。仅对经验证为GRIN透镜准确植入目标区域的动物进行基板固定操作。

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讨论

熟练的手术技术对于在杏仁核等深层脑区成功开展基于头戴式微型显微镜的活体光学钙成像至关重要，正如本文所述。因此，尽管本方案为基板固定和GRIN透镜植入的优化手术流程提供了指导，某些关键步骤可能仍需进一步优化。如方案部分所述，手术中杏仁核的定位坐标、基板固定时的气流速度、图像采集参数（帧率、LED功率等）.钙成像中的变量（ICA 时间权重、事件最短衰减时间等）.) 在数据处理中需要优化。

基板安装步骤可以进行调整。头部固定板是必要的，因为它有助于在移动式家庭笼中固定清醒小鼠的头部，以便进行基板安装。然而，如果实验室未配备移动式家庭笼，则可选用异氟烷气体麻醉系统作为替代方案。对于这种替代方法，异氟烷气体的浓度可能尤为关键。我们观察到，在1.5%异氟烷麻醉条件下，小鼠杏仁核中的GCaMP信号极少被检测到。相反，在0.8%异氟烷条件下可检测到GCaMP信号，且小鼠处于接近清醒状态，头部无明显运动。因此，该麻醉条件允许在无需额外设备（如头部固定板和移动式家庭笼）的情况下完成基板安装。

颅骨螺钉、牙科水泥...

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作者无任何利益冲突需要披露

致谢

本工作由三星科学技术基金会资助（项目编号 SSTF-BA1801-10）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
26G针头BD302002外科手术
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPREAddgene104493-AAV1外科手术
AAV2/1-CaMKiiα-GFP定制外科手术
丙烯酸-牙科水泥（Ortho-jet Acrylic Pink）Lang1334-粉红外科手术 &和底板连接
气流控制器NeurotarNTR000253-04基板连接
阿莫西林SIGMAA8523-5G外科手术
底板INSCOPIX1050-002192基板连接
基板盖INSCOPIX1050-002193基板连接
行为学实验装置（实验箱）Coulbourn仪器测试笼行为测试
行为学实验装置（软件）Coulbourn仪器定格画面行为测试
碳笼Neurotar180 mm × 70 mm基板连接
卡洛芬SIGMAPHR1452-1G外科手术
数据处理软件INSCOPIXINSCOPIX 数据处理软件基板连接 & 行为测试
地塞米松SIGMAD1756-500MG外科手术
钻孔Seyang马拉松-4外科手术
钻头ELAUS1/2，Shank104外科手术
玻璃针WPIPG10165-4外科手术
GRIN透镜（INSCOPIX Proview Lens Probe）INSCOPIX1050-002208外科手术
汉密尔顿注射器Hamilton84875外科手术
头板Neurotar模型 5外科手术
六角扳手INSCOPIX1050-004195基板连接
笔记本电脑三星NT950XBV外科手术 &和基板连接
透镜固定器，立体定位杆（INSCOPIX proview 植入套件）INSCOPIX1050-004223外科手术
显微镜抓手INSCOPIX1050-002199基板连接
显微镜，数据采集软件，硬件INSCOPIXnVista 3.0基板连接 & 行为测试
移动式家养笼NeurotarMHC V5基板连接
电动臂Neurostar定制化外科手术
电动臂软件Neurostar定制化外科手术
NI板国家仪器行为测试
可移除环氧键WPIKwik-Cast外科手术
树脂水门汀（Super-bond）Sun医疗Super bond C&& B外科手术
颅骨螺钉斯托尔廷51457外科手术
立体定位电极夹持器ASIEH-600外科手术
立体定位仪斯托尔廷51600外科手术
立体定位仪斯托尔廷51600基板连接

参考文献

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GRIN AAV GCaMP
在自由活动小鼠杏仁核中使用头戴式微型显微镜成功实现活体钙成像
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