在自由活动小鼠杏仁核中使用头戴式微型显微镜成功实现活体钙成像

摘要

在体微型内窥镜钙成像是一种不可或缺的工具，可实现对自由活动动物神经元活动的实时监测。然而，将该技术应用于杏仁核一直存在困难。本方案旨在为在小鼠中成功利用微型显微镜靶向杏仁核细胞提供一项实用的操作指南。

摘要

在自由活动的动物体内实时监测神经元活动是将神经元活动与行为联系起来的关键方法之一。为此，已开发出一种体内成像技术，该技术利用基因编码的钙指示剂（GECIs）、微型荧光显微镜和梯度折射率（GRIN）透镜来检测神经元中的钙瞬变，并已成功应用于多种脑结构^1,2,3,4,5,6。该成像技术特别强大，因为它能够对基因定义的细胞群体进行长期慢性同步成像，持续时间可达数周。尽管该技术具有实用性，但将其应用于位于大脑深部的脑区（如杏仁核）仍存在困难，而杏仁核是情绪处理和联想性恐惧记忆的关键脑结构⁷。有多个因素导致该成像技术难以应用于杏仁核。例如，在较深脑区进行成像时，通常更容易出现运动伪影，因为植入大脑深部的头戴式显微镜相对不稳定。另一个问题是侧脑室靠近植入的GRIN透镜，其在呼吸过程中的移动可能引起高度不规则的运动伪影，这些伪影难以校正，从而难以获得稳定的成像视野。此外，由于杏仁核中的细胞在静息或麻醉状态下通常活动较弱，因此在基板定位过程中很难发现并聚焦表达GECI的目标细胞，以供后续成像使用。本实验方案为如何高效地利用头戴式微型显微镜靶向杏仁核中表达GECI的细胞提供了有益的指导，以实现在此类深部脑区成功进行体内钙成像。需指出的是，本方案基于特定系统（例如 Inscopix），但并不局限于该系统。

引言

钙是一种普遍存在的第二信使，在几乎所有细胞功能中都发挥着关键作用⁸在神经元中，动作电位的发放和突触输入会引起细胞内游离[Ca²⁺]^9,10因此，追踪钙瞬变可为监测神经元活动提供一种有效手段。GECIs 是功能强大的工具，可用于监测[Ca²⁺在定义的细胞群体和细胞内区室中^11,12在众多基于蛋白质的钙离子指示剂中，GCaMP 是一种 Ca²⁺ 基于单个GFP分子的探针¹³是目前经过最优化且应用最广泛的GECI。经过多轮工程化改造，已开发出多种GCaMP变体^12,14,15,16我们在此方案中使用了一种近期开发的GCaMP蛋白GCaMP7b。¹⁶GCaMP 传感器极大地促进了多种模式生物神经回路功能的研究，例如钙成像²⁺ ....

方案

所有实验程序均经韩国科学技术院动物伦理委员会批准。所有实验均遵循机构动物护理和使用委员会的指南进行。

注意：本方案包含六个主要步骤：病毒注射手术、GRIN透镜植入手术、GRIN透镜植入位置的验证、基板固定、在行为测试期间对GCaMP信号进行光学记录，以及数据处理（图1A）。除手术步骤外，其余均使用商业软件套件（Inscopix）完成。

1. 立体定位手术——AAV病毒注射

注意：本手术所使用的小鼠品系为 C57BL6/J。手术过程中，小鼠身体需覆盖无菌手术巾，且操作人员需佩戴无菌手套执行本方案中的所有步骤。通常情况下，不建议在同一天内进行多台手术；然而，若确需在同一天对多只小鼠实施相同手术，则每只小鼠应使用独立的一套经高压灭菌的手术器械，并在各只小鼠之间使用 70% 乙醇对手术器械进行消毒。为在手术过程中维持小鼠体温，将小鼠固定于立体定位仪后，需用定制的手术保温毯覆盖小鼠身体。

1. 使用70%乙醇对所有必需的手术器械进行消毒，并准备好Hamilton注射器和玻璃移液管。用蒸馏水填充玻璃移液管。
   注意：本方案中使用的所有手术器械均已进行高压灭菌。由于GRIN透镜和颅骨螺钉不能高压灭菌，因此使用70%乙醇作为消毒剂以防止炎症发生。尽管尚未尝试，但也....

结果

GRIN透镜植入的验证
在通过粘合将基板长期固定于脑组织之前，需对GRIN透镜的植入效果进行验证。在透镜植入成功动物中，可在显微镜物镜与植入的GRIN透镜之间距离所决定的焦平面范围内，清晰观察到表达GCaMP的细胞和血管（图2A和B）。相比之下，在植入位置偏离目标区域的动物中，焦平面范围内无法观察到清晰的GCaMP表达细胞图像（表现为失焦或超出视野）。在失焦情况下，血管图像清晰，但细胞在焦平面范围内仅呈现模糊影像（图2C和D）；在超出视野的情况下，大多数情况下无法观察到血管，且焦平面范围内未检测到荧光信号（图2E）。此外，与其他情况不同，植入的GRIN透镜边缘呈现明亮光环（图2F）。仅对经验证为GRIN透镜准确植入目标区域的动物进行基板固定操作。

讨论

熟练的手术技术对于在杏仁核等深层脑区成功开展基于头戴式微型显微镜的活体光学钙成像至关重要，正如本文所述。因此，尽管本方案为基板固定和GRIN透镜植入的优化手术流程提供了指导，某些关键步骤可能仍需进一步优化。如方案部分所述，手术中杏仁核的定位坐标、基板固定时的气流速度、图像采集参数（帧率、LED功率等）.钙成像中的变量（ICA 时间权重、事件最短衰减时间等）.) 在数据处理中需要优化。

基板安装步骤可以进行调整。头部固定板是必要的，因为它有助于在移动式家庭笼中固定清醒小鼠的头部，以便进行基板安装。然而，如果实验室未配备移动式家庭笼，则可选用异氟烷气体麻醉系统作为替代方案。对于这种替代方法，异氟烷气体的浓度可能尤为关键。我们观察到，在1.5%异氟烷麻醉条件下，小鼠杏仁核中的GCaMP信号极少被检测到。相反，在0.8%异氟烷条件下可检测到GCaMP信号，且小鼠处于接近清醒状态，头部无明显运动。因此，该麻醉条件允许在无需额外设备（如头部固定板和移动式家庭笼）的情况下完成基板安装。

颅骨螺钉、牙科水泥.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
26G针头	BD	302002	外科手术
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	外科手术
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	定制		外科手术
丙烯酸-牙科水泥（Ortho-jet Acrylic Pink）	Lang	1334-粉红	外科手术 &和底板连接
气流控制器	Neurotar	NTR000253-04	基板连接
阿莫西林	SIGMA	A8523-5G	外科手术
底板	INSCOPIX	1050-002192	基板连接
基板盖	INSCOPIX	1050-002193	基板连接
行为学实验装置（实验箱）	Coulbourn仪器	测试笼	行为测试
行为学实验装置（软件）	Coulbourn仪器	定格画面	行为测试
碳笼	Neurotar	180 mm × 70 mm	基板连接
卡洛芬	SIGMA	PHR1452-1G	外科手术
数据处理软件	INSCOPIX	INSCOPIX 数据处理软件	基板连接 & 行为测试
地塞米松	SIGMA	D1756-500MG	外科手术
钻孔	Seyang	马拉松-4	外科手术
钻头	ELA	US1/2，Shank104	外科手术
玻璃针	WPI	PG10165-4	外科手术
GRIN透镜（INSCOPIX Proview Lens Probe）	INSCOPIX	1050-002208	外科手术
汉密尔顿注射器	Hamilton	84875	外科手术
头板	Neurotar	模型 5	外科手术
六角扳手	INSCOPIX	1050-004195	基板连接
笔记本电脑	三星	NT950XBV	外科手术 &和基板连接
透镜固定器，立体定位杆（INSCOPIX proview 植入套件）	INSCOPIX	1050-004223	外科手术
显微镜抓手	INSCOPIX	1050-002199	基板连接
显微镜，数据采集软件，硬件	INSCOPIX	nVista 3.0	基板连接 & 行为测试
移动式家养笼	Neurotar	MHC V5	基板连接
电动臂	Neurostar	定制化	外科手术
电动臂软件	Neurostar	定制化	外科手术
NI板	国家仪器		行为测试
可移除环氧键	WPI	Kwik-Cast	外科手术
树脂水门汀（Super-bond）	Sun医疗	Super bond C&& B	外科手术
颅骨螺钉	斯托尔廷	51457	外科手术
立体定位电极夹持器	ASI	EH-600	外科手术
立体定位仪	斯托尔廷	51600	外科手术
立体定位仪	斯托尔廷	51600	基板连接