小鼠海马兴奋性及类别特异性抑制性神经元在不同脑片培养体系中的单细胞电穿孔

摘要

本文介绍了一种单细胞电穿孔技术方案，可用于在不同体外培养年龄的海马脑片中，向兴奋性和抑制性神经元递送基因。该方法可实现单个细胞中基因的精确且高效的表达，可用于研究细胞自主性及细胞间功能。

摘要

电穿孔技术已成为将特定基因导入细胞以研究其功能的关键方法。本文介绍了一种单细胞电穿孔技术，可在小鼠海马脑片器官型培养中，高效（约80%）实现兴奋性神经元及类别特异性抑制性神经元的体外基因转染。通过使用大直径玻璃电极、含河豚毒素的人工脑脊液以及温和的电脉冲，我们将目的基因导入培养的小鼠海马CA1区锥体神经元和抑制性中间神经元。此外，该电穿孔操作可在体外培养长达21天的海马脑片中进行，且转染效率未见下降，从而允许研究不同发育阶段的脑片培养物。随着人们对在多种细胞类型中探究基因分子功能的兴趣日益增长，本方法展示了一种可靠且简便的小鼠脑组织体外基因转染策略，且可利用现有的电生理设备与技术完成。

引言

在分子生物学中，研究者最关注的问题之一是如何将目的基因导入单个细胞或细胞群体中，以阐明其功能。基因导入方法可分为生物法（例如病毒载体）、化学法（例如磷酸钙法或脂质体法）和物理法（例如电穿孔、显微注射或基因枪法）^1,2。生物法转导效率高，且可具有细胞类型特异性，但受限于特异性遗传工具的开发。化学法在体外应用中非常有效，但转染通常为随机发生，且主要适用于原代细胞。在物理方法中，基因枪法从技术角度而言最为简单易行，但其转染结果仍为随机，且效率相对较低。对于需要将基因导入特定细胞而又无需开发遗传工具的应用场景，单细胞电穿孔技术成为理想选择^3,4。

过去，电穿孔仅指场效应电穿孔；但在过去二十年中，已开发出多种体外和体内单细胞电穿孔方案，以提高特异性和效率^5,6,7，表明电穿孔可用于将基因导入单个细胞，因而可实现极高精度。然而，这些操作在技术上要求较高，耗时且相对效率较低。事实上，近期一些研究已探讨了自动化电穿孔装置的可行性^8,9，此类装置有助于消除有意引入此类机器人系统的科研人员所面临的多项障碍。但对于寻求更简单方法的研究者而言，电穿孔存在的问题，如细胞死亡、转染失败和移液管堵塞，仍然是需要关注的挑战。

我们近期开发了一种电穿孔方法，该方法采用尖端较粗的玻璃移液管、更温和的电脉冲参数以及独特的压力循环步骤，与以往方法相比，显著提高了兴奋性神经元的转染效率，并首次实现了对抑制性中间神经元的基因转染，包括在小鼠脑片器官型培养中海马CA1区表达生长抑素的抑制性中间神经元¹⁰。然而，该电穿孔方法在不同类型抑制性中间神经元及不同神经元发育阶段中的可靠性尚未得到验证。在此，我们证明了该电穿孔技术能够有效地将基因转染至兴奋性神经元以及多种类型的中间神经元中。重要的是，无论体外培养天数（DIV）如何，其转染效率均保持在较高水平。我们强烈推荐这一成熟且操作简便的技术，供所有致力于在小鼠体外脑组织环境中对不同类型细胞进行单细胞电穿孔研究的研究人员使用。

方案

所有动物实验方案均经马萨诸塞大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准。切片培养制备、质粒制备和电穿孔操作的详细步骤也见于我们先前发表的方法中，可供参考以获取更多信息¹⁰。

1. 切片培养制备

1. 按照先前所述方法制备小鼠海马脑片器官型培养物¹¹，使用出生后6至7天的任一性别的小鼠。
   1. 制备用于器官型脑片培养的解剖液，成分如下（单位为 mM）：238 蔗糖、2.5 KCl、1 CaCl₂、4 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄ 和 11 葡萄糖，溶于去离子水中，然后用 5% CO₂/95% O₂ 混合气体饱和，调节 pH 至 7.4。
   2. 制备器官型脑片培养液，成分如下：78.8%（v/v）Eagle 最低必需培养基、20%（v/v）马血清、17.9 mM NaHCO₃、26.6 mM 葡萄糖、2 M CaCl₂、2 M MgSO₄、30 mM HEPES、胰岛素（1 µg/mL）和 0.06 mM 抗坏血酸，调节 pH 至 7.3。使用渗透压计将渗透压调节至 310–330 osmol。
   3. 使用两把刮铲从全脑中分离出海马组织，用组织切片机切成 400 µm 厚的切片。用两把镊子分开切片，并转移至置于6孔板内的30 mm细胞培养插件中，插件下方加入培养液（950 µL）。
2. 将器官型脑片培养物置于组织培养孵育箱（35°C，5% CO₂）中保存，并每两天更换一次培养液。

2. 质粒制备

1. 准备目的基因的质粒。
   1. 将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因亚克隆至pCAG载体中。
   2. 使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化pCAG-EGFP质粒，并溶于内液中，内液成分为含140 mM K-甲磺酸盐、0.2 mM EGTA、2 mM MgCl₂ 和10 mM HEPES的焦碳酸二乙酯处理水，用KOH调节pH至7.3（质粒浓度：0.1 µg/µL）。

3. 玻璃移液管的制备

1. 使用微量移液器拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃移液管（4.5 – 8 MΩ）（图1A）。
   注意：用于全细胞膜片钳记录的玻璃移液管非常适合进行电穿孔。
2. 将玻璃移液管在200°C下烘烤过夜以灭菌。
3. 在解剖显微镜下检查移液管尖端的尺寸，以估算其电学电阻。
   1. 可选：将移液管连接至电穿孔电极，并使用显微操作器将移液管尖端置入经过滤除菌的人工脑脊液（aCSF）中，通过读取电穿孔仪的显示值来验证移液管电阻。人工脑脊液成分（单位：mM）如下：119 NaCl、2.5 KCl、0.5 CaCl₂、5 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄ 和 11 葡萄糖，溶于去离子水中，并用5% CO₂/95% O₂混合气体饱和，调节pH至7.4。使用电穿孔仪读数确认实际电阻值。
      注意：移液管尖端越尖锐，其电学电阻越大。移液管电阻应低于10 MΩ。高电阻的玻璃移液管（图1B）在重复电穿孔过程中常出现尖端堵塞现象。

4. 电穿孔装置设置

1. 将电穿孔仪安装至标准的全细胞电生理装置上，该装置配备有安装在移动台上的直立显微镜、微操纵器以及蠕动泵。
2. 将电穿孔仪的前置放大器安装到微操纵器上，并将一对扬声器连接至电穿孔仪。将电穿孔仪连接至脚踏开关，以便准备就绪时发送脉冲。
   注意：开启时扬声器会发出提示音，该声音可反映电极处的电学电阻，从而可在不转移操作注意力的情况下判断电阻的相对变化。

5. 电穿孔准备

1. 将脑片培养插件从6孔板转移至含有900 µL培养基的3 cm培养皿中，并置于台式CO₂培养箱内，待进行电穿孔操作时取出。
   1. 在电穿孔后用于培养脑片前，先将新鲜的培养插件与1 mL脑片培养基在3.5 cm培养皿中预孵育至少30分钟。
2. 清洁并准备电穿孔装置。
   1. 实验当天开始前，用10%次氯酸钠溶液灌流管路5分钟，以对管路和腔室进行灭菌。
   2. 随后用去离子灭菌水灌流管路至少30分钟，彻底冲洗残留物。
   3. 最后用滤膜除菌的含0.001 mM河豚毒素（TTX）的人工脑脊液（aCSF）灌流管路。
      注：TTX可最大限度减少因中间神经元过度兴奋导致的细胞毒性及细胞死亡¹⁰。
3. 设置电穿孔仪的脉冲参数：电压幅度为–5 V，方波脉冲，脉冲串持续时间为500 ms，频率为50 Hz，脉冲宽度为500 µs。
4. 用5 µL含质粒的内液填充玻璃移液管。
   1. 通过轻弹和多次轻轻敲击移液管尖端，去除其中可能存在的气泡。
   2. 在解剖显微镜下观察尖端是否受损，或重复步骤3.3.1检测移液管电阻以确认其状态。
      注：若尖端受损，必须丢弃该玻璃移液管，并使用步骤3中预先制备的新移液管重复本步骤。
5. 将移液管尖牢固连接至电极，并打开扬声器。当移液管尖接触 aCSF培养基时，记录电穿孔仪的读数（即移液管的电阻值）。
6. 使用锋利刀片切割培养插件膜，分离出一片脑片培养物。使用尖头弯镊小心地将脑片转移至电穿孔腔室，并用脑片固定锚固定其位置。
   1. 单次操作中，脑片在培养箱外停留时间不得超过30分钟，以防出现神经元健康或功能改变等副作用¹²。

6. 对目标细胞进行电穿孔

1. 使用口部或连接在管路上的1 mL注射器（施加0.2–0.5 mL压力）向移液管施加正压。
2. 利用显微操作仪的三维旋钮控制装置，将移液管尖端移动至脑片培养物表面附近。
3. 选择目标细胞并接近之，在显微镜下观察到细胞表面形成凹陷前，持续保持正压。
4. 执行压力循环。
   1. 通过口部迅速施加轻微负压，使移液管尖端与细胞质膜之间形成松散封接，表现为膜部分进入移液管尖端，可在视野中观察到；同时通过监听扬声器传出的音调升高，观察到移液管电阻增加（约为初始电阻的2.5倍）。随后迅速重新施加正压，使细胞表面重新形成凹陷。
   2. 立即连续完成至少两次额外的压力循环，中间不停顿，然后持续施加负压1秒。
      注意：循环之间停顿、压力过大或负压持续时间过长均可能导致细胞严重损伤，甚至在电穿孔过程中导致细胞死亡。
5. 当扬声器音调达到稳定最高点（表明电阻达到峰值）时，立即用脚踏开关触发电穿孔仪进行一次快速脉冲。在达到峰值电阻后，不得超过1秒才发出脉冲。
   注意：采用本方案时，我们未观察到脱靶电穿孔现象¹⁰。仅在压力循环期间与玻璃移液管接触的细胞被转染。将移液管置于其他神经元附近不会导致基因转染。
6. 在不施加压力的情况下，轻柔地将移液管从细胞撤回约100 µm。
7. 重新施加正压，确认电阻值与步骤5.5中记录的读数相近，然后接近下一个细胞。
   1. 若电穿孔后出现视觉可见的堵塞或移液管电阻显著升高（>高于初始值15%），可通过施加正压清除潜在堵塞。
      注意：若无可见堵塞但电阻仍显著升高，应丢弃该移液管并更换新的。通常情况下，若操作谨慎，一根移液管最多可用于20次电穿孔操作¹⁰。
8. 电穿孔完成后，将脑片培养物转移至新的培养插件中，在35°C培养箱中孵育最多3天。

7. 器官型海马脑片培养物的固定、染色与成像

1. 转染后2–3天，用含4%多聚甲醛和4%蔗糖的0.01 M磷酸盐缓冲液（1× PBS）在室温下固定电穿孔处理的器官型脑片培养物，固定时间为1.5小时。
2. 去除固定液，将脑片在含30%蔗糖的0.1 M磷酸盐缓冲液（1× PB）中孵育2小时。
3. 将脑片置于载玻片上，通过将载玻片放置于碎干冰上进行速冻。在室温下解冻脑片，并将其转移至盛有1× PBS的6孔板中。
4. 在GDB缓冲液（0.1%明胶、0.3% Triton X-100、450 mM NaCl和32% 1× PB，pH 7.4）中，使用小鼠抗GFP抗体和兔抗RFP抗体于室温孵育脑片2小时进行染色。
5. 用1× PBS在室温下洗涤脑片三次，每次10分钟。
6. 在GDB缓冲液中，使用Alexa 488标记的抗小鼠二抗和Alexa 594标记的抗兔二抗于室温孵育脑片1小时；随后在含DAPI（4 µg/mL）的1× PBS中室温孵育10分钟。
7. 用1× PBS在室温下洗涤脑片三次，每次3分钟。
8. 将脑片用封片剂封固于玻璃载玻片上，并进行荧光成像。

结果

我们的单细胞电穿孔技术能够将基因精确递送至经视觉识别的兴奋性和抑制性神经元。我们在三个不同时间点对三种不同类型的神经元细胞进行了电穿孔。通过将表达小清蛋白（Pv）或囊泡型谷氨酸转运蛋白3型（VGT3）的Pv^cre（JAX #008069）或VGT3^cre（JAX #018147）小鼠品系分别与TdTomato（一种红色荧光蛋白变体）报告基因小鼠品系（Jax #007905）杂交，从而可视化标记Pv或VGT3表达的神经元，这些杂交品系分别命名为Pv/TdTomato和VGT3/TdTomato。实验所用的脑片培养物来自C57BL/6J、Pv/TdTomato和VGT3/TdTomato小鼠。

首先，在体外培养7天、14天或21天（DIV）时，对CA1区锥体神经元（Py）进行电穿孔。在这些不同培养龄的脑片培养中，将EGFP转染至海马CA1区的5-20个锥体神经元（图2B-D）。使用微分干涉相差（DIC）技术鉴定CA1区锥体神经元。为了展示脑片培养中锥...

讨论

本文介绍一种电穿孔方法，可高效且精确地转染兴奋性和抑制性神经元。我们优化的电穿孔方案包含三项创新性突破，以实现高效的基因转染。第一项改进是与先前发表的方案^3,5,6相比增大了移液管尺寸。这一改变使我们能够在不发生移液管堵塞的情况下对大量神经元进行电穿孔。此外，较低电阻的移液管可能允许使用比以往方法更温和的电脉冲参数，同时仍能达到预期效果³。其次，在电穿孔前进行多次压力循环显著降低了细胞死亡率¹⁰。我们经常观察到，在电穿孔前施加一次负压脉冲后，细胞质膜会黏附在移液管尖端内壁，从而损伤细胞。压力循环可显著减少质膜黏附于移液管的现象，从而提高操作过程中细胞的存活率和恢复能力¹⁰。最后，在人工脑脊液（aCSF）中加入河豚毒素（TTX）显著提高了在抑制性神经元中电穿孔的成功率¹⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒制备
质粒纯化试剂盒	Qiagen	12362
器官型脑片培养制备
6孔板	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 镊子	FST	#5/45	用于器官型脑片培养制备的弯头解剖镊
滤器瓶装置	Millipore	SCHVU02RE	培养基的过滤与储存
培养箱	Binder	BD C150-UL
McIlwain 组织切片机	TED PELLA, INC.	10180	用于器官型脑片培养制备的组织切片设备
Millicell 细胞培养插件，30 mm	Millipore	PIHP03050	器官型脑片培养插件
渗透压计	Precision Systems	OSMETTE II
聚四氟乙烯涂层刮勺	Cole-Parmer	SK-06369-11
剪刀	FST	14958-09
体视显微镜	Olympus	SZ61
无菌真空过滤系统	Millipore	SCGPT01RE	aCSF的过滤与储存
电极制备
毛细玻璃管	Warner Instruments	640796
微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-1000	拉制仪
烘箱	Binder	BD (E2)
拉制仪灯丝	Sutter Instrument	FB330B	拉制仪
单细胞电穿孔与荧光成像 #1
3.5 mm Falcon 培养皿	BD Falcon	353001
气浮平台	TMC	63-7512E
CCD相机	Q Imaging	Retiga-2000DC	相机
电穿孔系统	Molecular Devices	Axoporator 800A	电穿孔仪
荧光照明系统	Prior	Lumen 200
显微操作器	Sutter Instrument	MPC-385	操作器
Metamorph 软件	Molecular Devices		图像采集
蠕动泵	Rainin	Dynamax, RP-2	灌流泵
移动载物台	Luigs & Neuman	240 XY
扬声器	未知		连接至电穿孔仪的扬声器
体视显微镜	Olympus	SZ30
台式培养箱	Thermo Scientific	MIDI 40
正置显微镜	Olympus	BX61WI
荧光成像 #2
一体化荧光显微镜	Keyence	BZ-X710