整合神经元对多种突触输入的响应，最佳方法是采用一种能够保留所有突触前核团、以维持自然时序和环路可塑性的实验体系；然而，脑片通常会切断大量连接。我们开发了一种改良的脑片制备方法，可在保持体外实验可行性的同时，模拟体内环路的活动状态。
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本文内容
摘要
摘要
体外脑片电生理技术能够以精确的电学和时间分辨率测量单个细胞的活动。为了便于使用膜片钳或成像技术对神经元进行观察和操作，脑片必须足够薄；然而，体外对脑环路的研究也因此仅限于急性脑片中实际存在的结构。为了在保留体外脑片实验优势的同时，保存更大范围的突触前核团，我们开发了一种新型脑片制备方法。这种“楔形脑片”专为膜片钳电生理记录而设计，用于表征脑干中介橄榄耳蜗（MOC）神经元所接收的多种单耳声驱动输入。这些MOC神经元的主要传入兴奋性和抑制性输入，来源于对侧耳及其相应耳蜗核（CN）中被刺激激活的神经元。该楔形脑片在某一侧半球的外侧边缘处沿前后方向最厚，并向对侧半球的外侧边缘逐渐变薄。在较厚的一侧，脑片包含了将听觉刺激信息传入大脑的听神经根、耳蜗核内部环路，以及汇聚到对侧MOC神经元上的双突触兴奋性传入通路和三突触抑制性传入通路。记录则在脑片较薄的一侧进行，此处的MOC神经元可通过微分干涉差（DIC）光学系统清晰观察，适用于常规膜片钳实验。通过在听神经进入听觉脑干的部位施加直接刺激，可引发耳蜗核内部环路的活动以及MOC神经元上游突触的突触可塑性变化。利用该技术，可在脑片条件下尽可能真实地模拟体内环路的激活状态。这种楔形脑片制备方法也可应用于其他脑环路研究，尤其适用于那些需要在保留上游连接性和长程输入的同时，结合体外脑片生理学技术优势的研究场景。
引言
在体内条件下，对神经环路功能的观察理想情况下应在保留天然感觉输入和反馈以及脑区之间完整连接的情况下进行。然而，在完整大脑中开展能够实现单细胞分辨率的神经环路功能研究，仍受限于技术上的挑战。尽管体内细胞外电生理记录或多光子成像方法可用于研究完整神经系统中的神经活动，但解析不同输入如何整合，或测量阈下突触输入仍然困难。体内全细胞记录可克服这些局限，但即使在易于接近的脑区，该技术的实施也颇具挑战性。对于位于大脑深部或空间分布弥散的特定神经元群体，单细胞分辨率实验的技术挑战进一步加剧，这些神经元通常需要借助遗传工具在体内定位细胞（例如，通道视紫红质的遗传表达结合光探针记录），或在记录位点标记后通过组织化学方法进行事后鉴定（例如，使用神经递质特异性标记物）。位于脑干腹侧表面附近且空间分布弥散的内侧橄榄耳蜗（MOC）神经元正面临上述种种限制1，使其在体内实验中极难被触及和研究。
脑片（厚度约100-500 µm）长期以来被用于研究脑内神经环路，包括听觉脑干环路，原因在于相互连接的神经元在物理上被保留在同一脑片内2,3,4,5,6<....
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方案
所有实验程序均经国家神经疾病和中风研究所/国家耳聋和其他沟通障碍研究所动物护理和使用委员会批准。
1. 实验准备
注意：关于脑片制备的细节，包括切片液、切片温度、脑片孵育温度及装置等，均针对本实验中进行的脑干制备条件而设定。脑片孵育的具体条件可根据各实验室的经验进行调整。
- 准备用于膜片钳的内液。
- 配制电压钳制溶液，其成分（单位为 mM）如下：76 Cs-甲烷磺酸盐、56 CsCl、1 MgCl2、1 CaCl2、10 HEPES、10 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、5 Na2-磷酸肌酸、5 QX-314 和 0.01 Alexa Fluor-488 肼。用 CsOH 将 pH 值调节至 7.2。
- 配制电流钳制溶液，其成分（单位为 mM）如下：125 K-葡萄糖酸盐、5 KCl、1 MgCl2、0.1 CaCl2、10 HEPES、1 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、1 Na2-磷酸肌酸和 0.01 Alexa Fluor-488 肼。用 KOH 将 pH 值调节至 7.2。
- 通过将 4 g 琼脂加入 100 mL 热水（接近沸腾）中，配制....
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结果
楔形切片的组织学检查
为了研究听觉脑干神经元的功能，我们设计的楔形切片包含听神经根以及与记录目标MOC神经元对侧的耳蜗核（示例切片见图1B）。初步组织学检查对于确认切片是否包含激活神经回路所必需的核团以及轴突投射是否完整至关重要。耳蜗核内的两种细胞类型向MOC神经元传递声音信息。T型星形细胞被认为为MOC神经元提供兴奋性输入39,40,41,58。球形树突细胞（GBC）通过特化的Held氏大突触，兴奋对侧半球的斜方体旁核（MNTB）神经元34,36,37,
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讨论
本文所述的切片方法称为楔形切片，该方法在保持突触前神经元环路完整的同时，便于利用脑片进行神经元功能分析。为最大限度地提高制备样本在环路分析中的可用性，初始阶段的多个步骤需格外谨慎。应通过组织学检查确认楔形切片的尺寸，这是验证突触前核团及其轴突投射是否均包含在所制备的楔形切片内的关键步骤。如果轴突投射被切断或仅有少量轴突到达目标核团，则可能需要调整切片几何形状。更普遍而言，振动切片机对楔形切片的最终切割步骤至关重要。优化的楔形切片制备需要一致使用振动切片机的配置，包括使用载物台基座上的同心圆标记，并结合已知脑部解剖标志对参数进行调整。在优化切片几何形状后，我们在18个楔形切片中的8个记录到耳蜗外侧丘系神经元（MOC神经元）中由电刺激听神经根所诱发的突触后电流（PSCs）。在我们之前的研究中，通过直接刺激MNTB轴突，可在约60%的MOC神经元中诱发抑制性PSCs57，这表明鉴于输入通路较长且需激活多突触环路，本研究的成功率仅略有下降。在制备切片时，建议略微增加切片厚度，因为较厚切片导致的可视性下降，优于因切片不完整或缺乏环路连接而无法使用的组织片段。只要切片能够置于记录显微镜物镜下，可被膜片.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD）院内研究项目资助，项目编号Z01 DC000091（CJCW）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>实验准备 | |||
| 琼脂，粉末 | Fisher Scientific | BP1423500 | 用于振动切片过程中稳定脑组织的4%琼脂块 |
| AlexaFluor 肼 488 | Invitrogen | A10436 | 用于内部溶液的荧光染料，以确认MOC神经元膜片钳制成功 |
| 分析天平 | Geneses Scientific（Intramalls） | AV114 | 称量化学品 |
| 双面剃须刀片 | Ted Pella | 121-6 | 振动切片机切割刀片 |
| 犬尿喹啉酸（5g） | Sigma Aldrich | K3375-5G | 用于在解剖和切片过程中降低神经元活性的ACSF添加剂，以改善组织健康状态，便于进行膜片钳实验 |
| pH计 | Fisher Scientific（Intramalls） | 13-620-451 | 溶液pH测试仪 |
| 塑料培养皿 100 mm 直径 × 20 mm | Fisher Scientific（Intramalls） | 12-556-002 | 4% 琼脂制备 |
| 搅拌加热板 | Fisher Scientific（Intramalls） | 11-500-150 | 4% 琼脂制备的加热 |
| <强>解剖与切片 | |||
| 生物胞素 | Sigma Aldrich | B4261-250MG | 用于轴突示踪的化学物质（与Streptavidin 488偶联） |
| 体视显微镜 | Amscope | SM-1BN | 用于脑组织取出过程中的精细解剖 |
| Dumont #5 镊子 | 精细科学工具 | 11252-20 | 精细镊子解剖工具 |
| 经济型镊子 #3 | WPI | 501976 | 镊子解剖工具 |
| 玻璃培养皿 150 mm 直径 × 15 mm 高 | Fisher Scientific（Intramalls） | 08-747E | 解剖皿 |
| 界面滤膜（203 × 254 mm PCTE 膜，10 μm） | 托马斯科学公司 | 1220823 | 切片孵育/生物胞素应用 |
| Leica VT1200S 振动切片机 | Leica | 1491200S001 | 用于楔形脑片切片的振动切片机 |
| 梅奥剪刀 | Roboz | RS-6872 | 解剖工具 |
| 单刃碳素钢刀片 | Fisher Scientific（Intramalls） | 12-640 | 解剖用剃刀刀片 |
| 样本圆盘，定位 | 徕卡 | 14048142068 | 用于可重复倾斜的专用振动切片机载物台 |
| 药匙 | FisherSci | 14-375-10 | 解剖工具 |
| 超级胶水 | Newegg | 15187 | 用于将组织粘附至振动切片机载物台 |
| 万纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 91500-09 | 解剖工具 |
| <强>电生理学 | |||
| A1R 直立式共聚焦显微镜 | 尼康仪器公司 | 电生理学与成像显微镜，可使用任何兼容电生理学的显微镜 | |
| 电极硼硅酸盐玻璃管，带细丝，外径1.5 mm，内径1.1 mm，长10 cm | Sutter Instrument | BF150-110-10 | 膜片钳电极玻璃管 |
| 电极填充液 MicroFil | WPI | CMF20G | 膜片电极移液管填充器 |
| 在线溶液加热器 | Warner Instruments (GSAdvantage) | SH-27B | 切片灌流系统加热器 |
| 多微操作器系统 | Sutter Instruments | MPC-200 配 MP285 | 用于膜片钳和刺激电极定位的微操作器 |
| P-1000水平玻璃微电极拉制仪 | Sutter 仪器 | FG-P1000 | 膜片钳移液器拉制仪 |
| 膜片钳放大器和软件 | HEKA | EPC-10 / Patchmaster Next | 可以是任意放大器/软件 |
| 记录室 | 华纳仪器 | RC26G | 切片 "浴液" 记录期间 |
| 记录室竖琴架 | Warner Instruments | 640253 | 在电生理记录过程中稳定脑片 |
| 切片孵育室 | 定制构建 | 切片后恢复期间用于切片的加热且供氧的孵育室 | |
| 刺激隔离单元 | A.M.P.I. | Iso-Flex | 电生理学用刺激隔离单元 |
| 60毫升注射器 | Fischer Scientific（Intramalls） | 14-820-11 | 电生理灌流液处理 |
| 温度控制器 | Warner Instruments（GSAdvantage） | TC-324C | 切片灌流系统温度控制器 |
| 外径1/8、内径1/16的导管 | Fischer Scientific（Intramalls） | 14-171-129 | 电生理灌流液处理 |
| 钨同心双极微电极 | WPI | TM33CCINS | 电生理学刺激电极 |
| <强>组织学 | |||
| 24孔板 | Fisher Scientific（Intramalls） | 12-556006 | 组织学切片制备与免疫染色 |
| Alexa Fluor 488 链霉亲和素 | 杰克逊免疫实验室 | 016-540-084 | 用于生物胞素显色的二抗 |
| 康宁轨道摇床 | Sigma | CLS6780FP | 免疫组织化学振荡器 |
| 乙酸焦油紫 | Sigma Aldrich（Intramalls） | C5042-10G | 组织学细胞染色 |
| 一次性切片刀片 | Fisher Scientific | 22-210-052 | 滑动式切片机刀片 |
| Nalgene 4 mm 醋酸纤维素滤器注射器，0.2 μm | Fisher Scientific（Intramalls） | 09-740-34A | 用于向记录电极填充内液的注射器滤器 |
| Fluoromount-G 封片剂 | Fisher Scientific | OB100-01 | 免疫组织化学荧光封片剂 |
| 带支架的载玻片染色缸 | Fisher Scientific（Intramalls） | 08-812 | 焦油紫染色缸 |
| Microm HM450 推拉式切片机 | 赛默飞世尔科技 | 910020 | 用于组织学的冷冻切片机 |
| 显微镜盖玻片：50 mm × 24 mm 矩形 | Fisher Scientific（Intramalls） | 12-543D | 组织化学载玻片盖玻片 |
| Permount封片剂 | Fisher Scientific | SP15-100 | 焦宁蓝切片封片介质 |
| Superfrost 载玻片 | Fisher Scientific | 22-034980 | 组织学切片 |
参考文献
- Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
- Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior ....
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