需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

体外楔形脑片制备以模拟体内神经元环路连接

5.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61664

⸱

2020年8月18日

 , 
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

本文内容

摘要

整合神经元对多种突触输入的响应，最佳方法是采用一种能够保留所有突触前核团、以维持自然时序和环路可塑性的实验体系；然而，脑片通常会切断大量连接。我们开发了一种改良的脑片制备方法，可在保持体外实验可行性的同时，模拟体内环路的活动状态。

摘要

体外脑片电生理技术能够以精确的电学和时间分辨率测量单个细胞的活动。为了便于使用膜片钳或成像技术对神经元进行观察和操作，脑片必须足够薄；然而，体外对脑环路的研究也因此仅限于急性脑片中实际存在的结构。为了在保留体外脑片实验优势的同时，保存更大范围的突触前核团，我们开发了一种新型脑片制备方法。这种“楔形脑片”专为膜片钳电生理记录而设计，用于表征脑干中介橄榄耳蜗（MOC）神经元所接收的多种单耳声驱动输入。这些MOC神经元的主要传入兴奋性和抑制性输入，来源于对侧耳及其相应耳蜗核（CN）中被刺激激活的神经元。该楔形脑片在某一侧半球的外侧边缘处沿前后方向最厚，并向对侧半球的外侧边缘逐渐变薄。在较厚的一侧，脑片包含了将听觉刺激信息传入大脑的听神经根、耳蜗核内部环路，以及汇聚到对侧MOC神经元上的双突触兴奋性传入通路和三突触抑制性传入通路。记录则在脑片较薄的一侧进行，此处的MOC神经元可通过微分干涉差（DIC）光学系统清晰观察，适用于常规膜片钳实验。通过在听神经进入听觉脑干的部位施加直接刺激，可引发耳蜗核内部环路的活动以及MOC神经元上游突触的突触可塑性变化。利用该技术，可在脑片条件下尽可能真实地模拟体内环路的激活状态。这种楔形脑片制备方法也可应用于其他脑环路研究，尤其适用于那些需要在保留上游连接性和长程输入的同时，结合体外脑片生理学技术优势的研究场景。

引言

在体内条件下，对神经环路功能的观察理想情况下应在保留天然感觉输入和反馈以及脑区之间完整连接的情况下进行。然而，在完整大脑中开展能够实现单细胞分辨率的神经环路功能研究，仍受限于技术上的挑战。尽管体内细胞外电生理记录或多光子成像方法可用于研究完整神经系统中的神经活动，但解析不同输入如何整合，或测量阈下突触输入仍然困难。体内全细胞记录可克服这些局限，但即使在易于接近的脑区，该技术的实施也颇具挑战性。对于位于大脑深部或空间分布弥散的特定神经元群体，单细胞分辨率实验的技术挑战进一步加剧，这些神经元通常需要借助遗传工具在体内定位细胞（例如，通道视紫红质的遗传表达结合光探针记录），或在记录位点标记后通过组织化学方法进行事后鉴定（例如，使用神经递质特异性标记物）。位于脑干腹侧表面附近且空间分布弥散的内侧橄榄耳蜗（MOC）神经元正面临上述种种限制1，使其在体内实验中极难被触及和研究。

脑片（厚度约100-500 µm）长期以来被用于研究脑内神经环路，包括听觉脑干环路，原因在于相互连接的神经元在物理上被保留在同一脑片内2,3,4,5,6,7,8,9。其他实验室已采用更厚的脑片（>1 mm）来研究双侧输入如何在上橄榄复合体（SOC）区域（包括内侧上橄榄核）整合10,11。这些脑片制备时保留了听神经（AN）轴突的完整性，并通过电刺激诱发耳蜗核（CN）内的突触神经递质释放，以模拟第一级听觉神经元在响应声音时的活动。这类厚脑片的一个主要缺点是难以在全细胞膜片钳电生理记录（“膜片钳”）过程中清晰观察神经元。随着动物年龄增长，该区域大量轴突发生髓鞘化12,13,14,15，导致组织光学密度增加，即使在常规的薄脑片中也会遮蔽神经元。我们的目标是建立一种体外制备方法，既能更接近体内记录中的神经环路连接性，又能保留脑片中视觉引导的膜片钳电生理技术所具备的高通量和高分辨率记录能力。

本实验室研究听觉传出系统神经元的生理学特性，包括MOC神经元。这些胆碱能神经元通过调节耳蜗外毛细胞（OHCs）的活动，向耳蜗提供传出反馈16,17,18,19,20。先前的研究表明，这种调节在耳蜗增益控制21,22,23,24,25,26以及抗声损伤保护27,28,29,30,31,32,33中发挥重要作用。在小鼠中，MOC神经元弥散分布于脑干听觉通路中的斜方体腹侧核（VNTB）1。我们课题组利用ChAT-IRES-Cre小鼠与tdTomato报告基因小鼠杂交，结合落射荧光照明技术，在脑干切片中标记MOC神经元。我们发现，MOC神经元接受来自同侧斜方体中核（MNTB）的传入性抑制性输入，而MNTB本身则由对侧耳蜗核（CN）中的球状树突细胞（GBC）轴突兴奋34,35,36,37,38。此外，MOC神经元的兴奋性输入很可能来自对侧CN的T型星形细胞39,40,41。综上所述，这些研究表明MOC神经元同时接收来自同一只耳朵（对侧耳）的兴奋性和抑制性输入。然而，突触前神经元及其汇聚到MOC神经元上的轴突彼此之间的距离较远，难以在典型的冠状切片制备中保持完整。为了研究突触输入在MOC神经元上的整合如何影响其动作电位发放模式，并重点关注新近描述的抑制机制，我们建立了一种实验制备方法，能够在体外脑片实验的技术优势基础上，以尽可能接近生理真实的方式刺激单侧耳朵来源的多种MOC传入通路。

楔形切片是一种改良的厚切片制备方法，旨在研究耳蜗外毛细胞（MOC）神经元的环路整合（示意图见图1A）。在切片较厚的一侧，楔形结构包含听神经进入脑干后终止于耳蜗核（CN）的离断轴突（下文称为“听神经根”）。可通过电刺激听神经根诱发神经递质释放，并激活CN中完全完整的神经元突触42,43,44,45,46。这种刺激方式在环路分析中具有多个优势。首先，与直接刺激向MOC神经元提供传入输入的T型星形细胞和GBC轴突不同，我们选择刺激听神经（AN），从而激活CN中丰富的固有环路。这些环路可调节CN神经元向大脑多个靶区（包括MOC神经元）的输出46,47,48,49,50,51。其次，通过听神经至耳蜗核的多突触传入通路对MOC神经元上游环路进行激活，可实现更接近生理状态的激活时序，并允许这些突触在听觉刺激过程中如体内状态一般发生可塑性变化。第三，我们可以调节刺激模式以模拟听神经的自然活动。最后，楔形切片中MOC神经元的单耳兴奋性和抑制性传入通路均保持完整，可通过膜片钳电生理技术精确测量这些输入信号在MOC神经元上的整合。总体而言，与传统的脑切片制备相比，该激活方案为MOC神经元提供了更为完整的神经环路。此外，这种脑干楔形切片还可用于研究其他接受同侧MNTB抑制性输入的听觉区域，包括外侧上橄榄核、上橄榄核和内侧上橄榄核10,11,52,53,54,55,56。除本研究特定的制备方法外，该切片技术还可用于或经修改后用于评估其他神经系统，其优势在于可维持长距离传入连接的完整性，并改善神经元的可视化效果，适用于多种单细胞分辨率的电生理或成像技术。

本方案需要使用可倾斜约15°的振动切片机载物台或平台。此处我们采用一种市售的两件式磁性载物台，其中“载物台”为底部呈弧形的金属圆盘，放置于凹形的磁性“载物台底座”中。通过移动载物台可调节切片角度。载物台底座上的同心圆可用于重复、准确地估算角度。将载物台和载物台底座置于切片室中，磁性载物台底座亦可在其中旋转。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验程序均经国家神经疾病和中风研究所/国家耳聋和其他沟通障碍研究所动物护理和使用委员会批准。

1. 实验准备

注意：关于脑片制备的细节，包括切片液、切片温度、脑片孵育温度及装置等，均针对本实验中进行的脑干制备条件而设定。脑片孵育的具体条件可根据各实验室的经验进行调整。

  1. 准备用于膜片钳的内液。
    1. 配制电压钳制溶液，其成分（单位为 mM）如下：76 Cs-甲烷磺酸盐、56 CsCl、1 MgCl2、1 CaCl2、10 HEPES、10 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、5 Na2-磷酸肌酸、5 QX-314 和 0.01 Alexa Fluor-488 肼。用 CsOH 将 pH 值调节至 7.2。
    2. 配制电流钳制溶液，其成分（单位为 mM）如下：125 K-葡萄糖酸盐、5 KCl、1 MgCl2、0.1 CaCl2、10 HEPES、1 EGTA、0.3 Na-GTP、2 Mg-ATP、1 Na2-磷酸肌酸和 0.01 Alexa Fluor-488 肼。用 KOH 将 pH 值调节至 7.2。
  2. 通过将 4 g 琼脂加入 100 mL 热水（接近沸腾）中，配制 100 mL 的 4% 琼脂溶液。置于加热磁力搅拌器上保持温度，并持续搅拌至完全溶解。将溶液倒入直径 100 mm 的塑料培养皿中，深度约为 1 cm，静置冷却。冷藏保存，待用时取出。
  3. 配制 1 L 人工脑脊液（ACSF），其成分（单位为 mM）如下：124 NaCl、1.2 CaCl2、1.3 MgSO4、5 KCl、26 NaHCO3、1.25 KH2PO4 和 10 葡萄糖。用碳合气（5% CO2 / 95% O2）通气至少 10 分钟，必要时用 1 M NaOH 将最终 pH 值调节至 7.4。实验全程持续用碳合气通气，以维持溶液的氧合状态和 pH 值。
  4. 在 ACSF 中加入 1 mM 犬尿酸，配制 200 mL 切片溶液。将溶液置于超声水浴中处理 10 分钟，直至犬尿酸完全溶解。持续用碳合气通气，并将溶液置于冰上。
    注意：操作犬尿酸时应佩戴适当个人防护装备。
  5. 按照制造商说明，将合适的刀片安装至振动切片机上。通过在切片室周围放置冰块，使其冷却。

2. 保留完整听觉神经根以进行刺激的脑组织摘除

注意：本实验所用小鼠通过将背景为 C57BL/6J 的 ChAT-IRES-Cre 转基因小鼠与 tdTomato 报告基因小鼠（Ai14）杂交获得。用于组织学和电生理实验的小鼠为听力开始后（P14-P23）的小鼠，相当于小鼠出生后约 P12 阶段。既往研究已证实，在该小鼠品系中，斜方体腹侧核（VNTB）表达 tdTomato 的神经元即为 MOC 神经元57。

  1. 采用机构批准的程序对动物实施安乐死（例如，CO2 窒息法），并进行断头。
  2. 使用剃刀刀片沿颅骨中线从鼻部至颈后部切开皮肤，向后剥离皮肤以暴露颅骨。
  3. 使用小型剪刀从颅骨底部（靠近脊髓的尾端）沿中线开始剪开颅骨，并向前延伸至鼻部。
  4. 在人字缝处，从颅骨中线向两侧耳部方向横向剪开颅骨。剥离颅骨以暴露脑组织。
  5. 从脑的吻端开始，用小型实验铲或钝头镊子轻轻将脑组织从颅骨上抬起。剪断视神经，并继续轻柔地向后分离脑组织，暴露其腹侧面。
  6. 用精细镊子在脑干腹侧面附近夹断三叉神经。
    注意：操作需谨慎，因前庭蜗神经紧邻其下方，需保持完整以便后续刺激。
  7. 将制备好的标本置于盛有冷切片液的玻璃培养皿中，将培养皿放置于解剖显微镜下，并用碳氧混合气（carbogen）轻轻通气。
  8. 在靠近脑干处修剪面神经，暴露前庭蜗神经。
  9. 使用精细镊子，将镊尖尽可能深入前庭蜗神经穿出颅骨的孔道内，夹断神经，使神经根仍附着于脑干。在另一侧重复此操作。
  10. 当两侧神经根均游离后，清除脑桥附近腹侧面、靠近斜方体区域的脑膜和血管组织。
  11. 通过夹断残留的脑神经和结缔组织，将脑组织完全从颅骨中分离，若可能，应尽量保留脊髓的完整性。

3. 将脑组织固定并安装到载片（磁性圆盘）上

  1. 通过在视交叉水平处修整脑组织，制备用于固定到切片台表面的脑样本。
    1. 将脑组织腹面朝上，使用钝头工具轻轻固定脊髓，以防止在下一步操作中脑组织发生倾斜。
    2. 在视交叉水平，使用张开的镊子插入脑组织直至培养皿底部，以创建修整平面。镊子插入角度约为垂直方向倾斜20˚，使镊尖从视交叉后方的脑背侧表面穿出。
    3. 沿镊子边缘用剃刀刀片进行切割。
  2. 将脑组织粘附至切片台表面。
    1. 准备一小块约1 cm3的4%琼脂块，用于支撑脑组织。
    2. 在切片台上滴加少量胶水，并将其涂抹成矩形区域，以便同时固定脑组织和琼脂块。
    3. 用镊子小心提起脑组织，用纸巾边缘轻轻吸去多余液体。将已修整的切面贴合于胶水上，确保在切片时腹面朝向刀片。
    4. 轻轻将琼脂块紧贴于脑组织背侧表面，以在切片过程中提供支撑，并确保脑组织位置正确（即角度合适）。

4. 切割脑组织以制备楔形脑片

注意：使用振动切片机制备脑片，使耳蜗神经根位于较厚的一侧，而内侧橄榄耳蜗（MOC）神经元和斜方体主核（MNTB）位于较薄的一侧。

  1. 将附有脑组织的磁性圆盘放置在切片台基座上，并将其放入切片室中，使脑的腹侧朝向刀片。
  2. 向切片室中加入冰冷的切片液，并用碳合气（carbogen）持续通气。
  3. 将刀片降入溶液中，从目标区域尾侧开始切片，以确保切片对称。若切片显示不对称，可轻微倾斜切片台以获得对称性。
    注意：刀片移动速度在 0.05–0.10 mm/s 范围内可有效切出健康的切片，具体速度可能因动物年龄和脑区不同而有所调整。
  4. 当切片对称后，将切片台向一侧移动约 15˚（相当于切片台基座上约 3 个同心环的距离）。
    注意：移动切片台时应远离需要在切片中保留的听觉神经根。
  5. 继续小心切片，直至听觉神经根接近一侧表面，而面神经可在另一侧表面清晰可见。
  6. 将切片台回转 15˚ 至原始位置。
  7. 将刀片移离组织，旋转切片台基座 90°，使薄侧的外侧边缘正对刀片。将刀片下降数百微米，然后缓慢靠近组织边缘。重复此操作，直至刀片接触外侧边缘。随后将刀片降至所需薄侧厚度，此处额外下降 200 微米。
    注意：理想情况下，在准备进行膜片钳记录的一侧，斜切片在腹侧斜方体核（VNTB）水平的厚度约为 300 µm。
  8. 将刀片移离组织，再将切片台基座旋转回原位，使腹侧重新朝向刀片。
  9. 进行切割，以确定楔形切片的头端表面。将切片转移到一片界面滤纸（1 cm2）上，尾端朝下。随后将切片转移至孵育室或其他合适的孵育装置中恢复 30 分钟（35 °C）。
    注意：在切片头端表面的两个半球上均应可见面神经（见 图 1B）。

5. 电生理学装置设置与记录

  1. 将楔形脑片放入记录室中，并使用网格固定器或稳定系统固定脑片。以持续灌流方式以7–10 mL/min的流速向组织灌注经碳合气饱和的温热人工脑脊液（ACSF，35 °C）。
  2. 在斜方体内侧核（VNTB）中，使用561 nm发射滤光片进行落射荧光观察，识别基因标记的MOC神经元，用于膜片钳记录。若无合适可记录细胞，可翻转脑片。
  3. 使用微分干涉差（DIC）光学系统，聚焦于脑片较厚一侧的听神经根，并使用显微操作器将双极钨刺激电极移至听神经根处，轻柔插入组织表面。
    注意：其他实验室在听神经刺激实验中曾使用过吸吮电极。若适用于特定实验条件，也可采用Theta玻璃电极或光学刺激方法。
  4. 将视野移回VNTB区域，选择一个MOC神经元作为膜片钳电生理记录的目标细胞。
  5. 使用适合实验设计的内液填充记录电极。
  6. 对MOC神经元进行全细胞膜片钳记录。根据需要补偿膜电容和串联电阻。
  7. 调节听神经根的电刺激强度，以在MOC神经元中获得稳定的突触后反应。
    注意：可能需要调整刺激电极的位置。
  8. 运行适当的刺激程序，以观察MOC神经元中诱发的突触电流（电压钳）或动作电位模式（电流钳）。
    注意：楔形脑片制备方法可与任何常规膜片钳技术联用，例如松散封接记录、药理学干预、光遗传学、钙成像、神经递质解笼锁等。

6. 脑干核团的组织学确认

注意：此步骤采用焦油紫染色法，在固定的重新切片的楔形切片上进行。该方法可用于观察切片中包含的细胞核。

  1. 制备楔形切片后，将切片浸入固定液（4% PFA 的 PBS 溶液）中过夜。随后在摇床上用 PBS 室温漂洗 3 次，每次 10 分钟，再将切片置于含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，4 °C 过夜以进行冷冻保护。
  2. 在冷冻切片机上重新切片（40–70 μm），并将连续切片收集至24孔板中的磷酸盐缓冲液（PBS）内。
  3. 将切片贴附于明胶包被的载玻片上，完全干燥。将载玻片放入切片架中。
  4. 配制焦油紫溶液
    1. 将5 g乙酸克里西蓝与500 mL去离子水混合，配制1%乙酸克里西蓝溶液2O
    2. 首先配制90 mL溶液A（540 mL冰醋酸 + 89.46 mL去离子水），用于制备乙酸盐缓冲液。2O) 和10 mL 溶液B（136 mg 醋酸钠溶于10 mL dH2O) 将溶液A与溶液B混合，得到乙酸盐缓冲液。
    3. 将1%醋酸克里西尔紫与醋酸缓冲液按1:1比例混合，得到含0.5%醋酸克里西尔紫的醋酸缓冲液。使用前过滤。
    4. 通过将100%乙醇与适量去离子水混合，配制95%和70%乙醇2O
  5. 进行焦油紫染色实验。将切片架依次移入各溶液容器中，在容器间用纸巾轻拍以去除多余液体：二甲苯 – 5 分钟；95% 乙醇 – 3 分钟；70% 乙醇 – 3 分钟；去离子水20 – 3 分钟；0.5% 焦宁蓝溶液 – 8–14 分钟，频繁观察，直至细胞核染成深紫色；去离子水2O – 3 分钟；70% 乙醇 – 3 分钟；95% 乙醇 – 1–2 分钟；100% 乙醇 – 载玻片浸入两次；二甲苯 – 5 分钟；二甲苯 – 25 分钟，直至进行封片。
    警告：二甲苯仅可在通风橱中使用。
  6. 一次从二甲苯中取出一张载玻片，并立即使用封片剂加盖盖玻片。让封片剂干燥（过夜）。
  7. 图像切片。

7. 活体未固定组织中用于轴突顺行示踪的生物胞素标记

  1. 按上述步骤（步骤 2-4）制备楔形切片。
  2. 将切片转移至界面滤纸（约 1 cm2）。在解剖显微镜下，于切片较厚的一侧定位耳蜗神经核（CN）。
  3. 用镊子卷起一张滤纸的角，小心吸除切片周围多余的 ACSF，以防止生物胞素扩散至切片其他区域，避免其被 CN 以外的细胞摄取。
  4. 使用精细镊子选取少量生物胞素晶体，将其置于 CN 表面。轻轻按压晶体，使其与神经元充分接触，促进其进入胞体并被摄取。重复此步骤，以覆盖目标区域，本实验中为目标区域内的 T-星状细胞和巨听觉细胞（GBC）所在的 CN 区域。
  5. 将切片放入孵育 chamber 中，在 35 °C 下孵育 2–4 小时，以允许生物胞素被摄取并运输。孵育结束后，用 ACSF 冲洗切片，去除残留的生物胞素颗粒。
  6. 将切片置于固定液（含 4% 多聚甲醛的 PBS）中过夜固定，随后用 PBS 漂洗 3 次，每次 10 分钟。
  7. 将切片在含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中 4 °C 下过夜进行冷冻保护，直至切片沉底。
  8. 使用冷冻切片机将组织重新切成 70–100 mm 的横切面。
  9. 采用标准免疫组织化学方法，使用荧光标记的链霉亲和素对组织进行处理。
    注意：若有助于标记突触前胞体、轴突、受体或其他对环路可视化重要的突触分子，可在切片上同时进行额外的免疫组织化学染色（即，一抗步骤不应影响生物胞素的二次显像）。
  10. 对组织进行成像。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

楔形切片的组织学检查
为了研究听觉脑干神经元的功能，我们设计的楔形切片包含听神经根以及与记录目标MOC神经元对侧的耳蜗核（示例切片见图1B）。初步组织学检查对于确认切片是否包含激活神经回路所必需的核团以及轴突投射是否完整至关重要。耳蜗核内的两种细胞类型向MOC神经元传递声音信息。T型星形细胞被认为为MOC神经元提供兴奋性输入39,40,41,58。球形树突细胞（GBC）通过特化的Held氏大突触，兴奋对侧半球的斜方体旁核（MNTB）神经元34,36,37,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述的切片方法称为楔形切片，该方法在保持突触前神经元环路完整的同时，便于利用脑片进行神经元功能分析。为最大限度地提高制备样本在环路分析中的可用性，初始阶段的多个步骤需格外谨慎。应通过组织学检查确认楔形切片的尺寸，这是验证突触前核团及其轴突投射是否均包含在所制备的楔形切片内的关键步骤。如果轴突投射被切断或仅有少量轴突到达目标核团，则可能需要调整切片几何形状。更普遍而言，振动切片机对楔形切片的最终切割步骤至关重要。优化的楔形切片制备需要一致使用振动切片机的配置，包括使用载物台基座上的同心圆标记，并结合已知脑部解剖标志对参数进行调整。在优化切片几何形状后，我们在18个楔形切片中的8个记录到耳蜗外侧丘系神经元（MOC神经元）中由电刺激听神经根所诱发的突触后电流（PSCs）。在我们之前的研究中，通过直接刺激MNTB轴突，可在约60%的MOC神经元中诱发抑制性PSCs57，这表明鉴于输入通路较长且需激活多突触环路，本研究的成功率仅略有下降。在制备切片时，建议略微增加切片厚度，因为较厚切片导致的可视性下降，优于因切片不完整或缺乏环路连接而无法使用的组织片段。只要切片能够置于记录显微镜物镜下，可被膜片...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD）院内研究项目资助，项目编号Z01 DC000091（CJCW）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>实验准备
琼脂，粉末Fisher ScientificBP1423500用于振动切片过程中稳定脑组织的4%琼脂块
AlexaFluor 肼 488InvitrogenA10436用于内部溶液的荧光染料，以确认MOC神经元膜片钳制成功
分析天平Geneses Scientific（Intramalls）AV114称量化学品
双面剃须刀片Ted Pella121-6振动切片机切割刀片
犬尿喹啉酸（5g）Sigma AldrichK3375-5G用于在解剖和切片过程中降低神经元活性的ACSF添加剂，以改善组织健康状态，便于进行膜片钳实验
pH计Fisher Scientific（Intramalls）13-620-451溶液pH测试仪
塑料培养皿 100 mm 直径 × 20 mmFisher Scientific（Intramalls）12-556-0024% 琼脂制备
搅拌加热板Fisher Scientific（Intramalls）11-500-1504% 琼脂制备的加热
<强>解剖与切片
生物胞素Sigma AldrichB4261-250MG用于轴突示踪的化学物质（与Streptavidin 488偶联）
体视显微镜AmscopeSM-1BN用于脑组织取出过程中的精细解剖
Dumont #5 镊子精细科学工具11252-20精细镊子解剖工具
经济型镊子 #3WPI501976镊子解剖工具
玻璃培养皿 150 mm 直径 × 15 mm 高Fisher Scientific（Intramalls）08-747E解剖皿
界面滤膜（203 × 254 mm PCTE 膜，10 μm）托马斯科学公司1220823切片孵育/生物胞素应用
Leica VT1200S 振动切片机Leica1491200S001用于楔形脑片切片的振动切片机
梅奥剪刀RobozRS-6872解剖工具
单刃碳素钢刀片Fisher Scientific（Intramalls）12-640解剖用剃刀刀片
样本圆盘，定位徕卡14048142068用于可重复倾斜的专用振动切片机载物台
药匙FisherSci14-375-10解剖工具
超级胶水Newegg15187用于将组织粘附至振动切片机载物台
万纳斯弹簧剪Fine Science Tools91500-09解剖工具
<强>电生理学
A1R 直立式共聚焦显微镜尼康仪器公司电生理学与成像显微镜，可使用任何兼容电生理学的显微镜
电极硼硅酸盐玻璃管，带细丝，外径1.5 mm，内径1.1 mm，长10 cmSutter InstrumentBF150-110-10膜片钳电极玻璃管
电极填充液 MicroFilWPICMF20G膜片电极移液管填充器
在线溶液加热器Warner Instruments (GSAdvantage)SH-27B切片灌流系统加热器
多微操作器系统Sutter InstrumentsMPC-200 配 MP285用于膜片钳和刺激电极定位的微操作器
P-1000水平玻璃微电极拉制仪Sutter 仪器FG-P1000膜片钳移液器拉制仪
膜片钳放大器和软件HEKAEPC-10 / Patchmaster Next可以是任意放大器/软件
记录室华纳仪器RC26G切片 "浴液" 记录期间
记录室竖琴架Warner Instruments640253在电生理记录过程中稳定脑片
切片孵育室定制构建切片后恢复期间用于切片的加热且供氧的孵育室
刺激隔离单元A.M.P.I.Iso-Flex电生理学用刺激隔离单元
60毫升注射器Fischer Scientific（Intramalls）14-820-11电生理灌流液处理
温度控制器Warner Instruments（GSAdvantage）TC-324C切片灌流系统温度控制器
外径1/8、内径1/16的导管Fischer Scientific（Intramalls）14-171-129电生理灌流液处理
钨同心双极微电极WPITM33CCINS电生理学刺激电极
<强>组织学
24孔板Fisher Scientific（Intramalls）12-556006组织学切片制备与免疫染色
Alexa Fluor 488 链霉亲和素杰克逊免疫实验室016-540-084用于生物胞素显色的二抗
康宁轨道摇床SigmaCLS6780FP免疫组织化学振荡器
乙酸焦油紫Sigma Aldrich（Intramalls）C5042-10G组织学细胞染色
一次性切片刀片Fisher Scientific22-210-052滑动式切片机刀片
Nalgene 4 mm 醋酸纤维素滤器注射器，0.2 μmFisher Scientific（Intramalls）09-740-34A用于向记录电极填充内液的注射器滤器
Fluoromount-G 封片剂Fisher ScientificOB100-01免疫组织化学荧光封片剂
带支架的载玻片染色缸Fisher Scientific（Intramalls）08-812焦油紫染色缸
Microm HM450 推拉式切片机赛默飞世尔科技910020用于组织学的冷冻切片机
显微镜盖玻片：50 mm × 24 mm 矩形Fisher Scientific（Intramalls）12-543D组织化学载玻片盖玻片
Permount封片剂Fisher ScientificSP15-100焦宁蓝切片封片介质
Superfrost 载玻片Fisher Scientific22-034980组织学切片

参考文献

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406(2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018(2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688(2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824(2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

脑片电生理内侧橄榄耳蜗神经元听神经根耳蜗核环路振动切片技术微分干涉相差光学膜片钳突触可塑性分析突前连接保留离体神经元环路
体外楔形脑片制备以模拟体内神经元环路连接
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。