牛卵巢皮质组织培养

摘要

介绍了牛卵巢皮质的体外培养以及营养性阶梯饮食对卵巢微环境的影响。卵巢皮质组织片段被培养七天，随后评估了类固醇激素、细胞因子及卵泡发育阶段。阶梯饮食处理促进了类固醇生成，从而在培养过程中推动了卵泡的发育进展。

摘要

从原始卵泡到有腔卵泡阶段的卵泡发育是卵巢皮质内一个动态的过程，涉及体细胞的内分泌和旁分泌因子以及卵丘细胞与卵母细胞之间的通讯。目前对卵巢微环境及其周围环境中产生的细胞因子和类固醇如何影响卵泡发育进程或停滞尚了解甚少。通过体外培养卵巢皮质组织，可在由邻近基质支持的标准化环境中实现卵泡发育。本研究旨在通过牛卵巢皮质的体外培养，探讨营养“阶梯式”饮食对卵巢微环境（包括卵泡发育、类固醇和细胞因子生成）的影响。为此，从青春期前经历两种不同营养发育方案的小母牛体内获取卵巢皮质组织，分为对照组（传统营养发育）和阶梯式组（发育期间交替饲喂与限制营养），并将组织切成约0.5–1 mm³的小块。这些组织块经过一系列洗涤后，置于置于含Waymouth培养基的培养板孔中的组织培养插入物上。卵巢皮质组织在每日更换培养基的条件下连续培养7天。通过组织学切片分析培养前后卵泡阶段的变化，以评估营养干预的影响以及在无额外处理条件下培养本身的作用。收集培养期间多日的培养基混合样本，用于检测类固醇、类固醇代谢物及细胞因子水平。结果显示，在阶梯式组相较于对照组的卵巢皮质培养中，卵巢微环境中类固醇激素水平呈现升高趋势，有助于卵泡的进一步发育。卵巢皮质培养技术有助于更深入理解卵巢微环境，以及内分泌分泌改变如何影响体内和体外干预条件下卵泡的发育与生长进程。该培养方法还可用于测试潜在治疗手段，有望改善女性卵泡发育，促进生育能力。

引言

卵巢皮质是卵巢的外层，卵泡发育在此发生¹。原始卵泡最初处于发育停滞状态，随后在旁分泌因子和促性腺激素作用下被激活，依次发育为初级、次级，最终形成腔隙性或三级卵泡^1,2,3,4。为了更深入地理解卵巢内的生理过程，可采用卵巢组织培养作为体外研究模型，从而在受控环境中开展实验。已有大量研究将卵巢组织培养应用于辅助生殖技术、生育力保存以及卵巢癌等领域^5,6,7。此外，卵巢组织培养也被用作研究损害卵巢健康的生殖毒性物质，以及多囊卵巢综合征（PCOS）等生殖系统疾病病因的模型^8,9,10,11。因此，该培养系统适用于多种专业领域的研究。

在啮齿类动物....

方案

卵巢取自美国肉类动物研究中心¹⁶。如先前所述¹⁶，所有操作均经美国肉类动物研究中心（USMARC）动物护理与使用委员会批准，符合《农业研究与教学中农业动物护理与使用的指南》的要求。卵巢被运送至内布拉斯加-林肯大学生殖实验室，在该实验室进行处理和培养。

1. 所需培养基的制备

1. Waymouth MB 752/1 培养基
   1. 取一个 1 L 的组织培养瓶，加入 900 mL 无菌水。在搅拌器上轻轻搅拌的同时，逐渐加入粉末状培养基。待粉末完全溶解后，加入 2.24 g 碳酸氢钠，随后加入 1.25 g 牛血清白蛋白（BSA）。使用 pH 计将 pH 值调节至 7.25–7.35。再添加无菌水至终体积为 1 L。
   2. 转移至生物安全柜中，加入青霉素-链霉素硫酸盐，使其终浓度为培养基体积的 0.1%（v/v）。使用孔径为 0.22 µm、面积为 33.2 cm²、容量为 500 mL 的瓶顶滤器过滤培养基。
   3. 将过滤后的培养基分装至多个 50 mL 圆锥形离心管中。每 50 mL 分装的培养基中加入 0.5 mL 胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium）。
   4. 用铝箔包裹离心管及培养基原液瓶，于 4....

结果

该牛皮质培养方法可用于从小块卵巢组织中获取多种激素、细胞因子及组织学数据。染色方法，如苏木精和伊红（H&E）可用于通过卵泡分期来确定卵巢形态^16,23,31 (图3）。简言之，卵泡根据形态分为以下类型：原始卵泡，即卵母细胞周围被单层扁平的前颗粒细胞包绕（0）；过渡期卵泡或早期初级卵泡，即卵母细胞周围主要为扁平的前颗粒细胞，伴有部分立方形颗粒细胞（1）；初级卵泡，即卵母细胞周围有1–1.5层立方形颗粒细胞（2）；次级卵泡，即卵母细胞周围有两层或以上立方形颗粒细胞（3）；窦前卵泡，即直径不超过1 mm，被两层或以上颗粒细胞包绕，并含有明显窦腔结构（4）^16,23 (图3）。可通过在培养前后固定卵巢皮质来对卵泡进行分.......

讨论

如本文所述，体外卵巢皮质培养的优点在于，卵泡在标准化的环境中发育，且周围有相邻的基质组织包绕。体细胞和卵母细胞保持完整，并能够实现类似于体内模型的适当细胞间通讯。本实验室发现，7天的培养体系可为代表性的卵泡发生和类固醇生成数据提供可靠的卵巢皮质处理方案。其他卵巢组织培养方案的培养时间较短，为1–6天^7,32，或较长，为10–15天^5,6,10。然而，我们观察到，培养时间超过7天会导致组织退化、类固醇生成减少，并可能增加污染风险（数据未显示）。在卵巢切除术后对卵巢皮质进行培养，还可直接揭示特定动物体内卵巢微环境的状况。这一点对我们的研究实验室尤为重要，因为我们已发现，在断奶后至青春期期间实施不同营养干预后，小母牛的卵泡发育出现了变化¹⁶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#11 手术刀片	Swann-Morton	303	手术刀片
#21 手术刀片	Swann-Morton	307	手术刀片
500 mL 瓶顶过滤器	Corning	430514	孔径为 0.22 µm 的瓶顶过滤器，用于培养基过滤
AbsoluteIDQ Sterol17 检测试剂盒	Biocrates	Sterol17 Kit	样本送至 Biocrates 进行类固醇谱检测，结果返回
雄烯二酮双抗体放射免疫分析试剂盒	MPBio	7109202	用于测定培养基中雄烯二酮含量的放射免疫分析法
比利时 A4 检测试剂盒	DIA Source	KIP0451	用于测定培养基中雄烯二酮含量的放射免疫分析法
牛细胞因子阵列 Q3	RayBiotech	QAB-CYT-3-1	用于测定培养基中细胞因子的细胞因子检测试剂盒
cellSens 软件标准版 1.3	Olympus	7790	成像软件
胰岛素-转铁蛋白-硒-X 添加剂	Gibco ThermoFisher Scientific	5150056	添加至培养基中的补充剂
Leibovitz's L-15 培养基	Gibco ThermoFisher Scientific	4130039	用于洁净台和生物安全柜中的组织清洗
显微镜	Olympus	SZX16	用于成像组织培养样本的解剖显微镜
显微镜相机	Olympus	DP71	用于成像组织培养样本的显微镜相机
Millicell 细胞培养插件 0.4 µm，直径 12 mm	Millipore Sigma	PICM01250	使组织可置于培养基上方而不完全浸没其中的插件
多孔板 24 孔板	Falcon	353047	用于盛放培养基、插件和组织的培养板
培养皿 60 × 15 mm	Falcon	351007	用于培养前清洗步骤的培养皿
磷酸盐缓冲液 (PBS 1X)	Corning	21-040-CV	用于组织清洗
SAS 软件版本 9.3	SAS Institute	9.3 TS1M2	统计分析软件
Thomas Stadie-Riggs 组织切片器	Thomas Scientific	6727C10	用于制备新鲜组织的薄而均匀切片的组织切片器
Waymouth MB 752/1 培养基	Sigma-Aldrich	W1625	用于组织培养的培养基