的 本方案旨在利用最新版本的分裂荧光素酶互补实验，在活体哺乳动物细胞中展示高尔基体驻留型III类膜蛋白之间发生的异源相互作用，这些膜蛋白具有胞质暴露的N端和/或C端。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案旨在探讨最新版分裂荧光素酶互补技术在验证核苷酸糖转运蛋白（NSTs）形成异源复合物方面的适用性。这些定位于内质网和高尔基体的多跨膜蛋白可将细胞质中合成的核苷酸糖转运通过细胞器膜，为介导糖基化反应的酶提供底物。NSTs 以二聚体和/或更高阶寡聚体形式存在。不同 NST 之间可发生异源相互作用。 也已有不同NST的报道。为了验证该技术是否适用于研究NST异源寡聚化现象，我们采用此前已通过多种其他方法证实能够相互结合的两种高尔基体定位的NST进行测试。 荧光素酶互补实验似乎特别适用于研究高尔基体驻留膜蛋白之间的相互作用，因为它不需要高表达水平，而高表达通常会导致蛋白质错误定位，并增加假阳性结果的风险。
引言
本文描述了一种逐步操作方案，用于检测瞬时转染的人源细胞中高尔基体定位的III型膜蛋白之间是否存在异源相互作用，该方法采用最新版本的分裂荧光素酶互补检测技术。该实验流程已针对核苷酸糖转运蛋白（NSTs）进行了最广泛的验证，但我们也成功获得了其他高尔基体定位的III型膜蛋白的阳性结果，这些蛋白的N端和/或C端朝向细胞质。
我们的研究小组致力于探索NST在大分子糖基化中的作用。NST是定位于高尔基体和/或内质网的III型膜蛋白，其N端和C端均朝向细胞器膜的胞质侧1. NSTs 被认为可将核苷酸活化的糖跨过细胞器膜转运，从而为糖基转移酶提供底物。NSTs 可形成二聚体 和/或高级寡聚体2,3,4,5,6,7,8,9,10此外，异源相互作用存在于 不同的NSTs也已有报道6,11. 研究还表明，NSTs 可与功能相关的糖基化酶形成复合物12,13,14我们寻求一种替代当前常用技术的方法，即基于荧光寿命成像（FLIM）的FRET方法，用于研究NSTs与功能相关高尔基体驻留蛋白之间的相互作用，因此决定测试分裂 荧光素酶互补试验。该方法使我们能够鉴定出一种新型的NST与功能相关的糖基化酶之间的相互作用9.
本文所述方案中采用的分裂荧光素酶互补检测技术的最新改进方法为NanoBiT15。该技术依赖于荧光素酶（例如NanoLuc）由两个片段重组而成：一个较大的片段称为大BiT（LgBiT），为17.6 kDa的蛋白质；另一个较小的片段仅由11个氨基酸组成，称为小BiT（SmBiT）。将两种目标蛋白分别与这两个互补片段融合，并在人源细胞系中进行瞬时表达。若两种融合蛋白发生相互作用，则在加入可穿透细胞的底物后，可在原位产生发光信号。这两个片段经过优化，使其自身之间的亲和力极低，只有当它们所融合的目标蛋白发生相互作用时才会被拉近并结合。
总体而言，基于生物发光的方法相较于基于荧光的方法具有一些优势。由于背景发光与荧光素酶产生的信号相比可忽略不计，生物发光信号具有更高的信噪比16。相比之下，基于荧光的方法通常因自发荧光现象而存在相对较高的背景信号。此外，与荧光相比，生物发光对被分析细胞的损伤更小，因为在生物发光过程中无需对样品进行激发。由于这些原因，研究体内蛋白质相互作用（PPIs）的生物发光方法优于常用的荧光方法，如 Förster 共振能量转移（FRET）或双分子荧光互补（BiFC）。
本实验方案依赖于将目标蛋白组合所获得的发光信号与对照组合所获得的发光信号进行比较。后者包括一个与较大片段融合的待测蛋白，以及一个与较小片段融合的对照 蛋白（例如 HaloTag） 。该对照 蛋白来源于细菌，在哺乳动物细胞中预期不会与任何哺乳动物蛋白发生相互作用。使用该蛋白作为对照对高尔基体驻留蛋白对的拓扑结构分析存在限制。由于该蛋白在哺乳动物细胞中于细胞质中合成，因此两个目标蛋白均应至少具有一个细胞质尾区。
该方法在蛋白质相互作用（PPI）的初步筛选中可能特别有用。当目标融合蛋白的表达水平过低，无法适用于其他方法时，该方法可能成为首选。类似地，如果目标蛋白表达水平较高，但会对其亚细胞定位产生不利影响，或已知会引发非特异性相互作用，则分裂荧光素酶互补实验可能是最佳选择。由于较小的片段仅含11个氨基酸，因此在无法使用较大标签的情况下，也可应用分裂荧光素酶互补实验。最后，该方法还可用于进一步验证通过其他技术获得的结果，如此处 所示案例所示。
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方案
1. 表达质粒的构建
- 使用拓扑预测工具分析目标蛋白的膜拓扑结构。
- 设计克隆策略，使得融合蛋白插入高尔基体膜后，较大的片段和较小的片段均朝向胞质侧。如果情况如此，例如 此处展示的感兴趣蛋白的N端和C端均为胞质朝向，可通过八种可能的方式对这些蛋白进行标记（参见 图1B）。如果目标蛋白之一或两者的N端或C端为腔内定位，则不应在其上添加标签。
- 将目的基因亚克隆至合适的表达载体中（参见 材料表按照标准的克隆实验方案进行。
注意：建议测试所有可能的方向，因为某些标记选项可能由于距离不足、方向不理想或空间限制而无法发挥作用。
2. 将表达质粒瞬时转染入细胞
- 通过胰酶消化收获贴壁生长的 HEK293T 细胞，并将细胞重悬于专用的完全培养基中。将细胞以每孔 100 µL 含 2 × 104 个细胞的密度接种至透明底、白色侧壁的 96 孔板中。根据所有待测组合及对照组（包括重复组）的数量调整所需孔数。
注意：建议仅使用板的内圈 60 个孔，以减少温度波动并避免过夜培养时发生蒸发。强烈推荐使用多聚-D-赖氨酸包被的 96 孔板（如材料表中所列产品），否则细胞可能在后续洗涤步骤中脱落。 - 在标准条件下（37 °C，5% CO2）培养细胞过夜。
- 次日，使用第 1.1 步中获得的目的表达质粒组合对细胞进行转染。
- 将表达质粒用无血清培养基（见材料表）稀释至每种质粒浓度为 6.25 ng/µL。
- 按适当的脂质体与 DNA 比例加入脂质体转染试剂，并根据生产商说明书进行孵育。
- 向指定孔中加入 8 µL 脂质体:DNA 混合物，通过轻轻旋转混匀孔内液体。最终每孔两种表达质粒的转染量均为 50 ng。
- 在标准条件（37 °C，5% CO2）下继续培养细胞 20–24 小时。
注意：延长培养时间可能导致融合蛋白表达水平升高，从而促进片段间的非特异性结合。
3. 培养基更换
- 次日，将每孔中的条件培养基更换为 100 µL 无血清培养基。确保换液过程中细胞未发生脱落。
注意：此步骤应在添加呋喃嗪工作液前 2–3 小时完成。去除血清可最大限度减少呋喃嗪自发光引起的背景信号。
4. 腔肠素工作液的制备
- 测量前，将1体积的呋喃嗪与19体积的稀释缓冲液混合（20倍稀释）。
注意：所需配制的呋喃嗪工作液总体积取决于待分析的孔数（呋喃嗪工作液以1:5的比例加入细胞培养基中，因此，对于先前已加入100 µL无血清培养基的每个孔，应加入25 µL呋喃嗪工作液）。 - 向指定孔中加入呋喃嗪工作液（25 µL/孔）。用手轻轻振荡或使用轨道摇床（例如，300–500 rpm下振荡15秒）混匀培养板。
5. 测量发光
- 将培养板放入化学发光微孔板检测仪中。
- 对于需在 37 °C 下进行的实验，将培养板在指定温度下平衡 10–15 分钟。
- 选择需要分析的孔。
- 设置积分时间为 0.3 秒，读取化学发光信号。根据需要，持续监测化学发光长达 2 小时。
6. 数据分析
- 计算所有测试组和对照组组合的平均值及标准差。
- 使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合多重比较方法对数据进行分析。
- 通过将感兴趣组合所获得的平均发光值除以相应阴性对照所获得的平均发光值，计算倍数变化（fold change）值，并对结果进行评估。
注意：此处提出的数据分析方法假设，只有当测试组合的发光值显著高于相应对照组合的发光值，且两者的比值超过10时，方可认定存在相互作用。
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结果
为了在此方法中获得最可靠的数据，应测试所有可能的组合（见图1）。同时，应设置阳性和阴性对照。阳性对照应包含两种已知能够相互作用的蛋白质，其中一种与较大的片段融合，另一种与较小的片段融合。阴性对照理想情况下应包含两种同样标记但不相互作用的III型跨膜蛋白。然而，建立此类对照可能存在挑战，因为必须通过多种替代方法充分验证这两种对照蛋白之间确实不存在相互作用。因此，如果待检测相互作用的蛋白质的N端和/或C端位于胞质侧（如本例所示），可选用一种非人源的胞质蛋白（例如HaloTag）作为阴性对照，该蛋白预期不会与任何人源蛋白发生相互作用。我们强烈建议通过共表达目标蛋白中任一种的未标记变体并结合相应质粒的滴定实验，对使用此类阴性对照获得的结果进行额外验证。如果两种蛋白质特异性相互作用，则任一蛋白若缺失荧光素酶片段，均会导致发光信号特异性下降。
阳性和阴性组合典型的相对发光单位（RLU）值列于表1中。这些结果针对两种NST蛋白SLC35A2和SLC35A3获得，此前已通过共免疫沉淀和FLIM-FRET<...
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讨论
本文提供了一种详细的实验方案，用于通过分裂荧光素酶互补分析法检测高尔基体驻留型III类膜蛋白（如NSTs）之间形成的异源复合物。所建议的数据分析与解释方法，是将目标蛋白组合所获得的发光信号，与相应的对照组合所获得的发光信号进行比较。该对照组合包含一个目标蛋白与较大片段融合，以及一个来源于细菌的对照蛋白与较小片段融合。后者在哺乳动物细胞的细胞质中表达； 因此，若以其作为参照，则要求待分析相互作用的蛋白的N端和/或C端位于高尔基体膜的细胞质侧。
实验方案中的关键步骤包括质粒设计、接种待转染细胞、转染操作、换液、呋喃荧光素工作液的配制以及将其加入细胞中。质粒设计应确保两个荧光素酶片段均朝向细胞质，否则对照组合将无法发挥作用，导致参考的相对光单位（RLU）值缺失。待转染细胞的接种应严格按照方案所述进行，否则可能导致转染效率不理想。我们建议使用表面涂有聚-L-赖氨酸的多孔板，以在换液过程中维持细胞贴壁。最后，呋喃荧光素工作液应现配现用，并立即加入细胞中。一旦加入后，应尽快进行信号检测。
为避免得出不明确的结果，实验中应始终设置...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由波兰克拉科夫国家科学中心（NCN）资助，项目编号为2016/23/D/NZ3/01314。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | |||
| 贴壁哺乳动物细胞系 | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96 孔白色/透明平底 TC 处理微孔板（带盖） | Corning | 356651 | |
| 细胞培养离心机 | |||
| 细胞培养添加剂（热灭活胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素） | |||
| CO2 培养箱 | |||
| 编码目标蛋白但未融合 NanoBiT 片段的表达质粒 | |||
| FuGENE HD 转染试剂 | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover 微孔板检测仪（或其它化学发光微孔板检测仪） | Promega | GM3000 | |
| 适用于所用细胞系的生长培养基 | |||
| 标准分子克隆所需材料与试剂（细菌、耐热 DNA 聚合酶、限制性内切酶、DNA 连接酶、核酸纯化相关材料与试剂） | |||
| NanoBiT MCS 起始系统 | Promega | N2014 | 该试剂盒包含可在不同方向上将目标蛋白与 NanoBiT 片段融合的载体，以及编码 HaloTag 蛋白与 SmBiT 融合蛋白的对照质粒和一对阳性对照质粒。 |
| Nano-Glo 活细胞检测试剂盒 | Promega | N2011 | 该试剂盒包含呋喃嗪（furimazine），其为可在活细胞中检测 NanoLuc 活性的底物，以及专用稀释缓冲液。 |
| Opti-MEM I 低血清培养基（无酚红） | Gibco | 11058021 | |
| 轨道摇床 | |||
| 数据分析软件（例如 GraphPad Prism） | |||
| PCR 仪 |
参考文献
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