本方案介绍了脉络膜 sprouting 实验，这是一种微血管增殖的离体模型。该实验可用于评估参与脉络膜微血管增殖的相关通路，并利用野生型和基因修饰小鼠组织评估药物治疗效果。
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摘要
摘要
病理性脉络膜血管生成是年龄相关性黄斑变性的显著特征，可导致视力损害甚至失明。利用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）或分离的原代视网膜内皮细胞（EC）进行的内皮细胞增殖实验，是研究视网膜血管生成的常用体外模型。然而，纯小鼠视网膜内皮细胞的分离在技术上具有挑战性，且视网膜内皮细胞的增殖反应可能与脉络膜内皮细胞不同，并具有不同的细胞间相互作用。为此，我们建立了一种高度可重复的脉络膜出芽培养实验模型，用于模拟脉络膜微血管增殖。该模型包含了脉络膜血管系统（内皮细胞、巨噬细胞、周细胞）与视网膜色素上皮（RPE）之间的相互作用。通过分离小鼠RPE/脉络膜/巩膜组织块，并将其接种于生长因子减少的基底膜提取物（BME）中（第0天），随后每隔一天更换培养基，并在第6天对脉络膜出芽数量进行定量分析。使用倒置相差显微镜拍摄各个脉络膜组织块的图像，并利用本实验室开发的ImageJ软件半自动宏插件对出芽面积进行定量。这种可重复的脉络膜出芽培养实验模型可用于评估潜在治疗化合物，也可用于微血管疾病研究，以利用野生型及基因修饰小鼠组织探究参与脉络膜微血管增殖的相关通路。
引言
脉络膜血管生成失调与新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）相关1。脉络膜是位于视网膜色素上皮（RPE）下方的微血管床。研究表明，脉络膜血流减少与AMD的进展相关2。血管内皮细胞、RPE、巨噬细胞、周细胞及其他细胞之间复杂的相互作用共同维持组织的稳态3,4,5。因此，建立可重复的模拟脉络膜微环境的实验模型对于研究新生血管性AMD至关重要。
离体血管生成实验和体外内皮细胞培养可作为体内微血管行为研究的补充，用于新药测试和发病机制研究。在眼科血管生成研究的体外实验中，常使用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以及分离的原代动物脑或视网膜内皮细胞（ECs）6,7,8特别是人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）已被广泛用作体外脉络膜新生血管（CNV）的模型9 通过评估内皮细胞增殖、迁移、管状结构形成及血管通透性，以评价干预措施
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方案
所有所述动物实验均经波士顿儿童医院机构动物照护与使用委员会批准（ARCH方案编号19-04-3913R）。
1. 准备
- 向500 mL含血清的完全经典培养基中加入5 mL青霉素/链霉素（10000 U/mL）以及5 mL和10 mL市售补充剂。最初分装50 mL培养基。
注意：为避免污染，切勿将任何培养基倒回原储备液中。 - 将一份完全经典培养基置于冰上。
- 使用70%乙醇清洁解剖显微镜、镊子和剪刀。
- 准备两个细胞培养皿（10 cm），一个放在解剖显微镜下，另一个置于冰上；每个培养皿中加入10 mL完全经典培养基。
2. 实验步骤（图1）
- 使用腹腔注射75-100 mg/kg的氯胺酮和7.5-10 mg/kg的赛拉嗪，在出生后（P）20天左右处死C57BL/6J小鼠。解剖前将眼球保存在冰上的完全经典培养基中。
- 去除眼球上的结缔组织（肌肉和脂肪组织）以及视神经。
- 使用显微剪刀在角膜缘后方约0.5 mm处做环形切割，移除角膜/虹膜复合体、玻璃体和晶状体。
- 从切口边缘垂直朝向视神经方向做1 mm长的切口，并切割出一条宽约1 mm的环形组织带。分离该复合体的中央区与周边区，用镊子将视....
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结果
每日脉络膜出芽生长的比较
我们分离了带有巩膜的脉络膜，将其嵌入BME中并培养6天（图1）。利用显微镜观察C57BL/6J小鼠从第3天到第6天的脉络膜出芽情况，并使用ImageJ中的半自动定量方法SWIFT-Choroid进行量化。在一个代表性案例中，脉络膜出芽面积（即从组织块延伸出的血管部分，不包括组织块本身）在第3天为0.38 mm2（图3A），第4天为1.47 mm2（图3B），第5天为5.62 mm2（图3C），第6天达到10.09 mm2（图3D）。
游离脂肪酸受体（FFAR）4 抑制会加.......
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讨论
脉络膜出芽实验有助于研究新生血管性年龄相关性黄斑变性（neovascular AMD）9,10,18,19,20。脉络膜外植体可从小鼠、大鼠以及人类中分离获得17,21。脉络膜外植体包含内皮细胞（ECs）、巨噬细胞和周细胞17。在该实验中，脉络膜内皮细胞与邻近细胞（如视网膜色素上皮细胞，RPE细胞）之间的相互作用有助于阐明脉络膜血管生长的相关机制17。此外，这种可重复且半自动化的评估方法可降低观察者间的变异度17。
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披露
作者没有财务披露。该计算机化方法可免费提供给学术机构，详情请联系作者。
致谢
本工作获得了Manpei Suzuki糖尿病基金会（YT）、波士顿儿童医院OFD/BTREC/CTREC教师职业发展基金、波士顿儿童医院眼科基金会、BCH试点奖、BCH Manton中心博士后奖学金和Little Giraffe基金会（ZF）、德国研究基金会（DFG；资助BC [CA1940/1-1]）、NIH R24EY024868、EY017017、R01EY01717-13S1、EY030904-01、BCH智力与发育障碍研究中心（1U54HD090255）以及马萨诸塞州狮子会眼科基金会（LEHS）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 阿法沙龙（赛拉嗪） | AKORN | 59339-110-20 | |
| 基底膜提取物（BME）Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| 细胞培养皿 | NEST | 704001 | 10 cm |
| 含血清和CultureBoost的完全经典培养基 | Cell systems | 4Z0-500 | |
| 200 证明乙醇 | Pharmco | 111000200 | 用于配制 70% |
| Kimwipes 擦镜纸 | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| 显微镜 | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| 组织培养板（24孔） | Olympus | 25-107 | |
| 维他克特 CIII（氯胺酮） | AKORN | 59399-114-10 |
参考文献
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Oph....
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