一种眼微血管新生的离体脉络膜出芽实验方法

摘要

本方案介绍了脉络膜 sprouting 实验，这是一种微血管增殖的离体模型。该实验可用于评估参与脉络膜微血管增殖的相关通路，并利用野生型和基因修饰小鼠组织评估药物治疗效果。

摘要

病理性脉络膜血管生成是年龄相关性黄斑变性的显著特征，可导致视力损害甚至失明。利用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）或分离的原代视网膜内皮细胞（EC）进行的内皮细胞增殖实验，是研究视网膜血管生成的常用体外模型。然而，纯小鼠视网膜内皮细胞的分离在技术上具有挑战性，且视网膜内皮细胞的增殖反应可能与脉络膜内皮细胞不同，并具有不同的细胞间相互作用。为此，我们建立了一种高度可重复的脉络膜出芽培养实验模型，用于模拟脉络膜微血管增殖。该模型包含了脉络膜血管系统（内皮细胞、巨噬细胞、周细胞）与视网膜色素上皮（RPE）之间的相互作用。通过分离小鼠RPE/脉络膜/巩膜组织块，并将其接种于生长因子减少的基底膜提取物（BME）中（第0天），随后每隔一天更换培养基，并在第6天对脉络膜出芽数量进行定量分析。使用倒置相差显微镜拍摄各个脉络膜组织块的图像，并利用本实验室开发的ImageJ软件半自动宏插件对出芽面积进行定量。这种可重复的脉络膜出芽培养实验模型可用于评估潜在治疗化合物，也可用于微血管疾病研究，以利用野生型及基因修饰小鼠组织探究参与脉络膜微血管增殖的相关通路。

引言

脉络膜血管生成失调与新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）相关¹。脉络膜是位于视网膜色素上皮（RPE）下方的微血管床。研究表明，脉络膜血流减少与AMD的进展相关²。血管内皮细胞、RPE、巨噬细胞、周细胞及其他细胞之间复杂的相互作用共同维持组织的稳态^3,4,5。因此，建立可重复的模拟脉络膜微环境的实验模型对于研究新生血管性AMD至关重要。

离体血管生成实验和体外内皮细胞培养可作为体内微血管行为研究的补充，用于新药测试和发病机制研究。在眼科血管生成研究的体外实验中，常使用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以及分离的原代动物脑或视网膜内皮细胞（ECs）^6,7,8特别是人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）已被广泛用作体外脉络膜新生血管（CNV）的模型⁹ 通过评估内皮细胞增殖、迁移、管状结构形成及血管通透性，以评价干预措施^6,10然而，由于缺乏与脉络膜中其他细胞类型的相互作用，且大多数实验所用内皮细胞并非来源于脉络膜，因此培养中的内皮细胞作为脉络膜新生血管（CNV）模型存在局限性。小鼠脉络膜内皮细胞在体外难以分离和长期维持培养。

主动脉环实验被广泛用作大血管增殖的模型。来自主动脉外植体的血管 sprouts 包括内皮细胞（ECs）、周细胞和巨噬细胞¹¹。主动脉环实验能很好地模拟大血管的血管生成过程^12,13,14。然而，作为脉络膜新生血管化的模型，该方法存在局限性，因为主动脉环属于大血管组织，缺乏脉络膜特有的微血管环境，且来自大血管的 sprouts 可能不同于参与微血管病变的毛细血管网络所产生的 sprouts。最近有研究团队发表了一种离体视网膜实验模型^15,16。尽管该模型适用于视网膜新生血管疾病的研究，但对于年龄相关性黄斑变性（AMD）中所见的脉络膜新生血管化而言，其适用性较差。

利用小鼠视网膜色素上皮（RPE）、脉络膜和巩膜外植组织建立的脉络膜新生血管出芽实验，旨在更真实地模拟脉络膜新生血管（CNV）。该组织可轻松从小鼠（或其他物种）眼球中分离获得¹⁷。该实验方法可用于可重复地评估药物化合物的促血管生成和抗血管生成潜力，并利用基因修饰小鼠及对照小鼠的组织来研究特定信号通路在脉络膜新生血管形成中的作用¹⁸。该脉络膜出芽实验已被后续多项研究引用^{9,10,18,19,20}。本文将演示该实验方法的具体操作步骤。

方案

所有所述动物实验均经波士顿儿童医院机构动物照护与使用委员会批准（ARCH方案编号19-04-3913R）。

1. 准备

1. 向500 mL含血清的完全经典培养基中加入5 mL青霉素/链霉素（10000 U/mL）以及5 mL和10 mL市售补充剂。最初分装50 mL培养基。
   注意：为避免污染，切勿将任何培养基倒回原储备液中。
2. 将一份完全经典培养基置于冰上。
3. 使用70%乙醇清洁解剖显微镜、镊子和剪刀。
4. 准备两个细胞培养皿（10 cm），一个放在解剖显微镜下，另一个置于冰上；每个培养皿中加入10 mL完全经典培养基。

2. 实验步骤（图1）

1. 使用腹腔注射75-100 mg/kg的氯胺酮和7.5-10 mg/kg的赛拉嗪，在出生后（P）20天左右处死C57BL/6J小鼠。解剖前将眼球保存在冰上的完全经典培养基中。
2. 去除眼球上的结缔组织（肌肉和脂肪组织）以及视神经。
3. 使用显微剪刀在角膜缘后方约0.5 mm处做环形切割，移除角膜/虹膜复合体、玻璃体和晶状体。
4. 从切口边缘垂直朝向视神经方向做1 mm长的切口，并切割出一条宽约1 mm的环形组织带。分离该复合体的中央区与周边区，用镊子将视网膜从RPE/脉络膜/巩膜复合体上剥离下来。 
5. 将周边部脉络膜组织带保存在冰上的完全经典培养基中；分离另一只眼球并重复上述步骤，获得第二条组织带。
6. 将环形组织带切成6个大小相近的方形小块（约1 mm × 1 mm）。
   注意：切勿触碰任何边缘。
7. 按照生产商说明解冻基底膜提取物（BME）。将30 µL BME加至24孔细胞培养板每孔的中央位置，确保BME液滴在孔底形成凸起的圆顶状，且不接触孔壁。
   注意：BME应在冰箱中过夜解冻。解冻后任何时候均需置于冰上。
8. 将组织置于BME的中央位置。
   注意：不要压平脉络膜外植体；通常让组织在BME内自然展开。组织的方向（巩膜面朝上或朝下）不影响实验结果。
9. 将培养板在37 °C孵育10分钟，使凝胶固化。
10. 每孔加入500 µL完全经典培养基。
11. 每隔一天更换一次经典培养基（500 µL/孔）。3天后可在显微镜下观察到脉络膜出芽现象。
    注意：如需进行生长因子处理，先对组织进行4小时的饥饿处理。将待试化合物稀释于低生长因子培养基中（以1:200增强，而非1:50）。

3. SWIFT-脉络膜计算机量化方法¹⁷（图2）

注意：采用计算机化方法测量血管生长所覆盖的面积。在进行定量分析之前，需要准备ImageJ软件的宏插件（详见补充信息）。

1. 使用 ImageJ 打开脉络膜出芽图像，并将图像类型设置为“图像 | 类型 | 8位”，采用灰度模式。
2. 进入“图像 | 调整 | 亮度/对比度 (Ctrl/shift/C)”，优化图像对比度。
3. 使用魔棒工具勾勒并去除图像中央出芽区域内的脉络膜组织（使用快捷键“F1”）（图2A,B）。
   注意：将魔棒工具的容差率设置为 20–30%。
4. 使用自由选择工具去除图像背景（图2C）。进入“图像 | 调整 | 阈值 (Ctrl/shift/T)”，利用阈值功能将微血管出芽结构与背景及周边区域区分开来（图2D）。
5. 点击“F2”，系统将显示统计摘要。点击“保存”以保存所选区域的图像，并将文件保存至与原始图像相同的文件夹中，以便后续参考。
6. 完成一组样本的测量后，复制记录的数据用于数据分析。
   注意：也可通过“分析 | 设置比例尺”功能，利用带有比例尺的图像来测量面积（µm²）。

结果

每日脉络膜出芽生长的比较

我们分离了带有巩膜的脉络膜，将其嵌入BME中并培养6天（图1）。利用显微镜观察C57BL/6J小鼠从第3天到第6天的脉络膜出芽情况，并使用ImageJ中的半自动定量方法SWIFT-Choroid进行量化。在一个代表性案例中，脉络膜出芽面积（即从组织块延伸出的血管部分，不包括组织块本身）在第3天为0.38 mm²（图3A），第4天为1.47 mm²（图3B），第5天为5.62 mm²（图3C），第6天达到10.09 mm²（图3D）。

游离脂肪酸受体（FFAR）4 抑制会加...

讨论

脉络膜出芽实验有助于研究新生血管性年龄相关性黄斑变性（neovascular AMD）^{9,10,18,19,20}。脉络膜外植体可从小鼠、大鼠以及人类中分离获得^17,21。脉络膜外植体包含内皮细胞（ECs）、巨噬细胞和周细胞¹⁷。在该实验中，脉络膜内皮细胞与邻近细胞（如视网膜色素上皮细胞，RPE细胞）之间的相互作用有助于阐明脉络膜血管生长的相关机制¹⁷。此外，这种可重复且半自动化的评估方法可降低观察者间的变异度¹⁷。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿法沙龙（赛拉嗪）	AKORN	59339-110-20
基底膜提取物（BME）Matrigel	BD Biosciences	354230
细胞培养皿	NEST	704001	10 cm
含血清和CultureBoost的完全经典培养基	Cell systems	4Z0-500
200 证明乙醇	Pharmco	111000200	用于配制 70%
Kimwipes 擦镜纸	Kimberly-Clark	06-666
显微镜	ZEISS	Axio Observer Z1
青霉素/链霉素	GIBCO	15140	10000 U/mL
组织培养板（24孔）	Olympus	25-107
维他克特 CIII（氯胺酮）	AKORN	59399-114-10