单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）是一种用于在单细胞水平上精确定量特定RNA表达水平及其定位的方法。本文中，我们报告了经过验证的实验室操作流程，包括湿实验处理、成像以及针对特定RNA的单细胞定量图像分析方法。
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摘要
摘要
基因转录是细胞生物学中的一个基本过程，使细胞能够解读并响应内部和外部信号。传统的群体检测方法（如Northern印迹、PCR和RNA测序）虽然可以测量mRNA水平，但无法提供细胞间反应差异的信息。通过单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）技术，可实现对单个细胞及等位基因的精确可视化与定量分析。RNA-FISH通过将靶标RNA与标记的寡核苷酸探针进行杂交来实现。这些样本可在中高通量模式下成像，并通过图像分析流程，在单细胞水平上对成熟和新生RNA进行定量分析。本实验方案所描述的模式系统已在实验室中经过多年优化，针对固定、通透、杂交和成像等步骤建立了稳定可靠的方法，从而实现高质量的smFISH标记单细胞分析。样品制备与处理的主要目标是获得信噪比高的优质图像，以减少假阳性结果，并提高数据的准确性。本文提供了一套从样品制备到数据分析的完整操作流程，并结合具体建议和优化步骤，以适应不同样品的需求。
引言
基因转录和翻译是生物学中心法则中的两个主要过程，即从DNA序列到RNA再到蛋白质1。在本研究中，我们重点关注转录过程中信使RNA（mRNA）的生成。新生的RNA分子包含非编码的内含子和编码的外显子。内含子在转录过程中被共转录剪接去除，然后mRNA进入细胞质，在核糖体上进行翻译2,3。
传统上，mRNA 的检测是在大量细胞群体（数百至数百万个细胞）中进行的，常用的经典方法包括 RT-qPCR 或 Northern 印迹杂交。尽管这些方法非常强大，但其应用存在局限性，因为它们无法提供细胞间变异（表型异质性）的信息，不能确定转录活性等位基因的数量，且更重要的是缺乏空间定位信息。近年来，全基因组范围的单细胞 RNA 测序（RNAseq）技术的发展开始弥合成像方法与测序技术之间的鸿沟4。然而，RNAseq 存在相对较低的检测效率问题，且其处理步骤会导致空间信息的完全丢失5。尽管单细胞 RNAseq 能够揭示同基因型细胞群体中的表型异质性，RNA 荧光原位杂交（RNA-FISH）则能够在空间层面以及逐个等位基因的基础上，更全面地探究目标基因的表达情况6,
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方案
为确保最佳结果，本实验方案的湿实验部分在所有步骤中均需采取标准的RNase-free防护措施。例如，强烈建议使用带滤芯的移液器吸头、无菌容器和RNase-free缓冲液。建议使用钒酸核糖核苷复合物等RNase抑制剂，特别是针对丰度较低的目标RNA。
1. 细胞培养与实验设置
- 在T75组织培养瓶中培养贴壁生长的MCF-7乳腺癌细胞（ATCC #HTB-22），使用不含酚红的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（仅激素刺激实验需要），并添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1 nM丙酮酸钠、50 I.U./mL青霉素和50 µg/mL链霉素。
- 将经酸蚀处理并涂覆多聚-D-赖氨酸的圆形盖玻片（厚度0.16至0.19 mm，直径12 mm）放入24孔组织培养板中。
注：根据标准操作流程，使用1 M HCl对盖玻片进行酸蚀处理，并用无菌PBS（不含Ca++和Mg++的磷酸盐缓冲液）配制的1 mg/mL多聚-D-赖氨酸溶液进行包被。 - 移除细胞培养液，用5 mL无菌PBS（不含Ca++和Mg++的磷酸盐缓冲液）洗涤一次。使用2–3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化MCF-7细胞。待细胞脱落后，加入等体积的完全培养基中和胰蛋白酶-EDTA溶液。 ....
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结果
以分析激素反应为例，我们选择了在高通量检测中用于检测环境灾难中内分泌干扰物存在的雌激素受体（ER）模型，该研究是参与NIEHS超级基金研究计划的一部分7。在本实验中，贴壁生长的MCF-7乳腺癌细胞用ER激动剂17β-雌二醇（E2，10 nM）或溶剂对照（DMSO）处理24小时。针对GREB1基因内含子（Atto 647N，图1中红色）和外显子序列（Quasar 570，图1中绿色）的光谱分离探针组可实现新生mRNA与成熟mRNA的同步可视化与定量；尤为重要的是，可标记每个细胞中转录活跃的等位基因数量，该指标已被证实为雌激素反应时间过程的一部分7。
完成的实验方案将为每个感兴趣区域生成16位最大强度投影图像（TIFF）。核分割基于DAPI染色的细胞核进行，并通过扩展核掩膜来估计细胞边界。随后对GREB1内含子和外显子信号进行分割，并分配至各个单个细胞。
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讨论
本文所述的smFISH方法基于先前已发表的方案7,12,14。在本方案中，我们详细说明了从湿实验环节（包括接种密度、固定时间、通透处理和探针浓度）到成像及图像分析等关键步骤的优化过程，为希望开展基因转录单细胞分析的研究实验室提供了一套完整的实验流程。
为了便于进行单细胞分析，细胞应处于亚融合状态且不相互重叠，以便在无需细胞边界标记的情况下准确估算细胞边界。我们建议在整个实验期间进行涵盖较宽接种密度范围的细胞增殖实验，以优化细胞密度。
确定最佳固定时间对于成功的单分子荧光原位杂交（smFISH）实验至关重要。我们发现，将样品在含有VRC的无菌PBS中稀释的4%纯甲醛溶液中于冰上固定30分钟，可显著提高高质量smFISH图像的一致性，尤其是在需要通过针对目标因子的抗体联合进行结构分析时。甲醛通过交联大分子来固定样品，相比使用有机溶剂等其他固定方法.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
MAM、FS 和 MGM 由美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）资助（项目 4，P42ES027704，项目负责人：Rusyn）。MAM、FS、RMM、MGM 和 PKS 还得到由癌症预防与研究机构（CPRIT）资助的 GCC 先进显微镜与图像信息学中心（RP170719）的支持。成像研究还得到了贝勒医学院综合显微镜核心设施的支持，资助来源包括美国国立卫生研究院（NIH）（DK56338 和 CA125123）、癌症预防与研究机构（CPRIT）（RP150578）、丹·L·邓肯综合癌症中心以及约翰·S·邓恩墨西哥湾沿岸化学基因组学联盟。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 17β 雌二醇 | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS 编号 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) 缓冲液，无 RNase | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM 培养基（含 L-谷氨酰胺和 4.5 g/L 葡萄糖） | Fisher Scientific | MT10017CV | 由 Invitrogen 生产 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | 不含丙酮酸钠 |
| 右旋糖酐硫酸钠，50% 溶液，无菌 | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco 磷酸盐缓冲液（含 Ca++/Mg++） | Corning | 21030CV | 由 Calbiochem 生产 |
| 乙醇，200 证明（100%） | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24 孔透明平底 TC 处理多孔细胞培养板 | Corning | 353047 | 由 Decon Laboratories 生产 |
| 胎牛血清 (FBS)，500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | 由 Gemini Bio Products 生产 |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE 高分辨率去卷积显微镜 | GE Healthcare | ||
| Hyclone 水，分子生物学级 | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| 浸油 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | 由 GE Healthcare Bio-Science 生产 |
| L-谷氨酰胺溶液 | Fisher Scientific | MT25005Cl | 由 Corning 生产 |
| MCF-7 细胞 | ATCC | HTB-22 | |
| 分子级甲酰胺 | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA 物镜 | Olympus | ||
| Parafilm 封口膜 | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | 由 VWR 销售 |
| 多聚甲醛，16% 溶液，电镜级 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Fisher Scientific | MT3001Cl | 由 Corning 生产 |
| 核糖核苷酸钒酸复合物 | VWR | 101229-716 | 由 New England Biosciences 生产 |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| 丙酮酸钠，100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | 由 Gibco 生产 |
| Thermo Scientific 玻璃盖玻片，#1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100，100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | 由 Fisher BioReagents 生产 |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield 抗荧光淬灭封片剂，10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | 由 Vector Laboratories 生产 |
参考文献
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E.
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重印与许可
