优化用于中子大分子晶体学的晶体生长

摘要

通过晶体学对生物大分子进行结构研究需要高质量的晶体。本文我们展示了一种可用于OptiCrys（由我们实验室开发的全自动仪器）和/或微透析装置的实验方案，该方案基于对结晶相图的理解，用于生长大尺寸、高质量的晶体。

摘要

得益于新建的中子大分子晶体学（NMX）光束线以及结构精修软件的日益普及，NMX 的应用正在迅速扩展，过去十年中测定的大多数结构均由此推动。然而，目前可用于 NMX 的中子源强度显著弱于X射线晶体学的相应光源。尽管该领域已取得进展，中子衍射研究始终需要更大尺寸的晶体，尤其随着研究趋势不断转向更大尺寸的大分子和复合物。因此，为进一步推动 NMX 的应用，亟需在适用于生长大晶体的方法和仪器方面取得进一步改进。

在本研究中，我们介绍了一系列合理的策略以及本实验室开发的晶体生长平台（OptiCrys），该平台结合了显微镜连接的摄像机进行实时观察，以及对结晶溶液（如沉淀剂浓度、pH值、添加剂、温度）的精确自动控制。随后，我们展示了如何通过调控温度和化学成分，利用可溶性模式蛋白来寻找最优的结晶条件。充分了解结晶相图对于选择任何结晶实验的起始位置和动力学路径至关重要。我们进一步说明了如何基于多维相图的知识，采用合理的方法来控制所生成晶体的大小和数量。

引言

理解蛋白质的结构-功能关系以及生理通路的机制，通常依赖于了解氢原子（H）在蛋白质中的位置及其内部电荷的转移方式。^1,2由于氢原子对X射线的散射较弱，其位置只能通过极高分辨率的X射线衍射数据来确定（>1 Å^3,4相反，中子晶体学可用于精确定位生物大分子中氢原子的位置，因为氢和氘（H²，氢的同位素）原子的散射长度与氧、氮和碳的散射长度大小相近⁵然而，现有中子源产生的中子通量弱于X射线束，因此通常需要对此进行补偿^2,3。这可以通过将H替换为H来实现² 和/或增加晶体体积，以减少氢原子的非相干散射，并提高衍射图像的信噪比。

有多种结晶方法（相应的示意图相图见图1）可用于获得适用于X射线和中子生物大分子晶体学的高质量大尺寸晶体⁶。在蒸气扩散法中，将由蛋白质和结晶溶液混合制备的液滴，通过水或其他挥发性物质的蒸发，随时间与含有更高浓度相同结晶溶液沉淀剂的储液槽达到平衡。液滴中蛋白质和沉淀剂浓度的增加导致过饱和状态，从而引发自发成核，并在这些成核位点上进一步生长为晶体^6,7。尽管蒸气扩散法是晶体生长中最常用的技术⁴，但其结晶过程难以精确控制⁸。在自由界面扩散法中，结晶溶液缓慢扩散进入高浓度蛋白质溶液，使体系逐渐趋向过饱和状态。该方法可被视为一种混合速率极慢的批量法^6,9,10,11,12。在批量法中，蛋白质迅速与结晶溶液混合，导致快速过饱和，进而引发均匀成核并形成大量晶体^3,7。该方法目前约占蛋白质数据库中所有已解析结构的三分之一。透析法也常用于生长高质量且衍射性能良好的蛋白质晶体。在透析法中，沉淀剂分子从储液槽中通过半透膜扩散进入含有蛋白质溶液的独立腔室。平衡过程的动力学依赖于多种因素，如温度、膜孔径大小、蛋白质样品及结晶试剂的体积和浓度⁶。

结晶相图可用于描述蛋白质在不同物理或化学变量条件下的各种状态³。如图1所示，每种结晶技术均可被视为通过不同的动力学路径到达该相图中的成核区和亚稳区^6,10,13。这提供了有关蛋白质溶解度的信息，以及观察到晶体与溶液之间达到热力学平衡时的蛋白质浓度，从而确定成核与生长的最佳条件^3,14。在二维相图中，蛋白质浓度作为单一变量的函数进行绘制，其他变量保持恒定¹⁵。在此类相图中，当蛋白质浓度低于溶解度曲线时，溶液处于未饱和区，不会发生成核 或晶体生长。高于该曲线的区域为过饱和区，其中蛋白质浓度超过其溶解度极限^3,14。该区域进一步划分为三个区域：亚稳区、自发成核区和沉淀区。在亚稳区中，过饱和程度不足以在合理时间内发生成核，但可支持晶种的晶体生长。而在过饱和程度过高的沉淀区，则倾向于发生聚集和沉淀^14,15。

当达到足以引发自发成核的过饱和度时，首批晶核将出现¹⁰。晶体生长会导致蛋白质浓度降低，直至达到溶解度极限。只要过饱和度保持在溶解度曲线附近，晶体的尺寸就不会发生显著变化。然而，已有研究表明，结晶溶液的温度和化学成分（例如，沉淀剂浓度）的变化会影响蛋白质的溶解度，并可能引发进一步的晶体生长^8,13,16。

由于透析有利于高质量晶体的生长，我们实验室设计并开发了如图2所示的OptiCrys结晶工作台，以实现对结晶过程的全自动控制⁸。为此，我们使用LabVIEW编写了软件，通过电子控制器和冷却器，控制并监测与帕尔贴元件接触的流动储液透析装置的温度。同一软件还利用多通道流体系统自动调节结晶溶液的化学组成（例如更换结晶剂）。此外，系统配备数字相机和倒置显微镜，用于观察和记录结晶过程。该设备提供两个结晶室，体积分别为15 μL和250 μL，可用于不同目的的晶体生长。由于结晶过程是可逆的，只要样品未受损，仅需几微升蛋白质溶液即可筛选多种条件⁸。因此，该方法显著减少了所需蛋白质材料的用量。

由先前的研究⁸可以看出，在晶体生长过程中， 原位 观察需以固定的时间间隔进行，时间间隔可短至数秒，长至数天，具体取决于所观察的现象（沉淀、成核或晶体生长）。

利用OptiCrys优化晶体生长基于温度-沉淀剂浓度相图。对于溶解度随温度升高而直接增加的蛋白质，可利用盐析区¹⁸，即通过提高溶液离子强度（可在蛋白质-沉淀剂相图中可视化）来降低蛋白质的溶解度。同样，对于具有逆向溶解度特性的蛋白质，则可利用盐溶区¹⁸。成核发生在成核区，靠近亚稳区的位置，随后晶体在相图的亚稳区内生长，直至蛋白质浓度达到其溶解度极限。如图3A所示，在化学组成恒定的情况下，可通过逐步降低温度，使结晶溶液始终保持在亚稳区内，从而避免新的成核。晶体持续生长直至达到第二次晶体/溶液平衡状态，此后晶体尺寸不再进一步增大。通过多次逐步降温，直至晶体达到所需大小。在图3B中，在温度恒定的情况下，通过逐步增加沉淀剂浓度，使溶液保持在亚稳区内。该过程可重复多次，以获得大尺寸晶体。通过调节温度并控制结晶溶液条件，精确调控过饱和度水平，是实现成核与晶体生长分离的两种有效手段，而这些操作可由OptiCrys精确且自动地完成^5,8,14。

通过温度控制，或温度与沉淀剂浓度共同控制的结晶方法所获得的蛋白质晶体实例，以及相应的衍射数据，可在文献和蛋白质数据库（PDB）中找到。其中包括人γ-晶状体蛋白E、PA-IIL凝集素、酵母无机焦磷酸酶、尿酸氧化酶、人碳酸酐酶II、YchB激酶和乳酸脱氢酶^5,14,17,18。

尽管OptiCrys已由NatX-ray公司实现商业化，但仍有许多实验室无法获得该仪器或其提供的序列化方法。该技术的替代方案是使用市售的、具有不同体积的塑料微透析小室。通过这些小室，可手动调节和改变温度与化学成分。微透析小室的检查无法进行 原位 而必须使用光学显微镜手动完成。温度控制可通过将样品置于无振动且温度可控的培养箱中实现。保持温度恒定对于确保结晶实验的可重复性至关重要。温度的显著波动可能导致晶体受损或破坏。⁵.

本文提供了一种详细的实验方案，描述了样品制备以及控制软件的使用，用于生长适合中子蛋白质晶体学研究的大尺寸、高质量晶体。该逐步操作流程旨在利用结晶相图，选择起始条件和动力学路径，以控制所生成晶体的尺寸和质量。此外，还提供了一种使用微透析装置生长晶体的详细方案，该方案采用相同的原理来获得大尺寸、高质量晶体。

方案

1. 使用微透析按钮的透析方法

1. 样品制备
   1. 将30 mg鸡蛋清溶菌酶冻干粉溶于1 mL CH₃COONa缓冲液（100 mM醋酸钠，pH 4）中，配制蛋白溶液，最终浓度为30 mg·mL^-1。
   2. 在277 K条件下以13,000 × g离心样品10分钟。此步骤有助于在开始结晶前去除任何聚集物。
   3. 测定样品在280 nm处的吸光度，并利用比尔-朗伯方程（A = εcl）计算蛋白浓度。
      注：根据比尔-朗伯方程，电子吸光度（A）与吸光物质的浓度（c，mg·mL^-1）成正比，前提是光程长度（l，cm）恒定。该线性关系的斜率为摩尔消光系数（ε，溶菌酶在280 nm处的值为2.64 mL·mg⁻¹·cm⁻¹）¹⁹。芳香族氨基酸残基（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）以及半胱氨酸残基之间的二硫键在约280 nm处具有强吸收，源于光谱允许的π – π*跃迁。由于大多数蛋白质含有这些残基，因此在已知消光系数的情况下，通常可通过测量280 nm处的吸光度简便地计算蛋白浓度。
   4. 按照图4所示配制结晶溶液。在配制结晶溶液前，使用0.22 μm Millipore滤膜过滤所有储备液。
2. 晶体生长
   1. 裁剪适当截留分子量（6–8 kDa）的纤维素透析膜，并将其浸泡于蒸馏水中。
      注：微透析按钮可使用市售的透析膜圆片；若使用透析管，则需注意剪开边缘，以分离管状结构中的双层膜，获得单层膜。
   2. 按照图4所示顺序，向24孔板的各孔中加入2 mL结晶溶液。
      注：若使用较大体积的按钮（例如200 μL），则应向50 mL离心管中加入至少5 mL结晶溶液，以确保高效的物质交换。
   3. 如图5A所示，用移液器向微透析按钮的腔室中加入35 μL溶菌酶溶液。
      注：为避免在关闭30 μL透析按钮时形成气泡，需额外加入5 μL蛋白溶液（死体积），即总共加入35 μL蛋白样品。该额外体积会使腔室顶部呈现轻微凸起形状，如图5B所示，从而防止气泡形成。
   4. 取合适尺寸的施用器，将弹性O型圈置于其末端（图5C）。然后将此前用无纤维纸轻轻擦拭/沥干的透析膜放置在透析按钮腔室上方。操作纸张时注意避免灰尘进入腔室。通过将弹性O型圈从施用器转移至透析按钮的凹槽中，固定透析膜位置（图5C）。
      注：操作的关键步骤是将弹性O型圈从施用器转移至透析按钮凹槽，以固定透析膜。所有动作必须完全同步，以避免在蛋白腔室中包裹气泡。建议在正式操作前练习拉伸O型圈以熟悉其刚性，使用镊子夹持部分膜以辅助安装，并先用模型蛋白进行初步测试实验。
   5. 使用镊子将按钮转移至孔板或50 mL离心管中（图5D）。
   6. 用盖玻片覆盖孔板，轻轻按压使其与油脂接触，从而密封孔板（图5E）。
      注：若孔板顶部无油脂，务必在实验开始前添加，或改用胶带代替玻璃盖玻片。微透析按钮用于蛋白结晶的原理如图5所示。
   7. 将样品置于293 K的温控培养箱中孵育。根据所用蛋白及结晶条件，可能需要不同温度。
      注：可将图4所示的相同结晶条件网格（允许沉淀剂浓度变化）在不同温度下进行筛选。此时需复制相同的结晶板，每份置于不同温度设定的培养箱中。这要求配备多个无振动的温控培养箱。
   8. 定期（通常每日）检查孔板或离心管中的晶体形成情况（图4），并做好记录，以区分各孔内容。详尽的记录对于避免假阳性结果以及区分灰尘与晶体至关重要。

2. 使用 OptiCrys 的晶体生长过程

1. 样品制备
   1. 按照第1.1节所述方法制备蛋白溶液和透析膜。
   2. 配制 NaCl（4 M）和 CH 的储备液₃COONa pH 4（1 M）并过滤至50 mL离心管中。
   3. 加入蛋白溶液（15 μL 溶菌酶，浓度为 30 mg·mL⁻¹）^-1) 加入温度控制的流动储液透析装置的透析室中。参考 图6 有关温控流动储液透析装置的详细信息，请参见 OptiCrys。OptiCrys 具有两个透析室，最小体积为 15 µL，最大体积为 250 µL。
   4. 用透析膜覆盖上腔室，并用弹性O形环固定膜图6B).
      注意：此装置与微透析池不同，在微透析池中，每个腔室均由透析膜直接密封。而在流动池中，透析膜固定在上腔室上，从而可在不拆除透析膜的情况下安装晶体。为此，上腔室可简单地 从储液罐上拧下。
   5. 翻转上腔室并将其放置在透析腔室上方。缓慢而轻柔地按压，以排出两部分之间滞留的所有空气，避免腔室内产生气泡（图6C使用模型蛋白进行练习在培训中有助于避免气泡产生和样品损失。
   6. 通过轻轻旋转将储液槽固定在适当位置，再次注意避免困住气泡。过度拧紧储液槽也可能在结晶室中产生气泡。图6D).
   7. 加入结晶溶液，并用密封盖盖住储液室。图 6G最大储液量为1 mL。
   8. 将该组件转移并插入黄铜支架中。该支架与用于控温的珀尔帖元件相接触。
   9. 如图所示 图6，密封盖上配有光学窗口，可实现对透析室的顶部照射。将光源（图2）在窗口上，允许光线穿过腔室。
   10. 储液室可连接泵，以使其作为连续流动池使用。将装有储备溶液和蒸馏水的50 mL试管顶部的管路按照图示连接至旋转阀 图7.
       注意：如果实验过程中不需要自动配制和更换结晶溶液，请省略步骤 2.1.10。在此情况下，必须手动配制结晶溶液，并手动预先填充储液池。
2. 软件
   1. 打开计算机并启动软件 晶体生长。该控制软件使用 LabVIEW 编写（http://www.ni.com/labview/）并提供用户友好的图形界面。它包含 4 种不同的图形界面（首页，设置，测试 和 维护 [Maintenance]) (图8).
      注意：法语翻译内容在方括号内。
   2. 选择 维护 通过点击按钮查看，如图所示 图8该视图目前使用最为广泛，可使用户在实验过程中控制大多数参数。
      注意：单击后 维护 视图中，将弹出一个包含多个区域的新窗口，用于控制温度或光照等参数。在 图8 该视图的不同部分用箭头和框标示。在接下来的步骤中，我们将演示如何通过软件控制每个参数。
   3. 温度控制器 该部分可实现对温度的控制与监测。点击按钮一 (1) 在 图8，以启动它。
      注意：OptiCrys 的温度范围为 233.0 – 353.0 ± 0.1 K。
   4. 设定温度 设定值 [setpoint] 部分并按回车键图8(2)）。此按钮下方有一个包含两条曲线（红色和黄色）的图表。红色曲线显示最终（设定）温度，黄色曲线显示当前温度。如图所示 图8(2)，温度设定为 20 °C。
      注意：为了生长晶体，如晶体生长部分所述，需要选择多个温度。要改变温度，需将每个新温度输入到 设定值 [setpoint] 切片并按下键盘上的 Enter 键。
   5. 通过增加亮度来打开光源 光 切片 图8亮度范围为0到100， "0" 表示灯已关闭且处于 "100" 将光强和亮度调至最大。通过增加光照，在 显微镜 在切片中可观察到透析室内部。实验过程中，细胞内的亮度可能会发生变化；请调整参数以清晰观察透析室内部。也可通过点击“缩放”前的“+”和“–”按钮，增加或减少放大倍数，以获得更佳的观察效果。
   6. 在右侧的 显微镜 在该部分中，设有多个区段用于存储每次结晶实验的相关信息。每位用户均可创建一个文件夹，用以保存结晶条件、蛋白质名称以及所用透析膜的分子量截留值等信息。图8(3)).
   7. 用户只需在框中输入即可为实验定义名称 文件夹名称. 点击 文件夹 [文件夹按钮] （以绿色边框显示） 图8) 将打开一个新窗口。在此窗口中，会有一个文本文件，包含为该实验定义的全部信息。此外，带时间戳的图像也保存在此文件夹中，以供后续处理。
   8. 从 NB图像 部分, 选择在实验过程中应拍摄的图像数量。在右侧面板中指定图像数量以及各图像之间期望的时间间隔（例如，min、hour、day）。 图8 显示在一分钟内记录零图像的软件设置。
      注意：使用 庞佩 [泵] 用于混合储备溶液并将结晶溶液注入储液室的部分。参见第 2.1.10 节及 图7 有关流体混合系统原理的说明。
   9. 储备溶液的输入浓度 步骤1：配制储备液。 在下一节的结晶实验中，使用4 M NaCl和CH₃将使用1 M pH 4的COONa。
      注意：储备液的浓度单位为摩尔浓度。
   10. 定义每种溶液的最终浓度，例如 NaCl 为 0.75 M，CH 为 0.1 M₃COONa pH 4。将这些信息填入最终浓度部分（图8）在 步骤2：待配制溶液 按压 计算 按钮，如图中红框所示 图8每种储备液在混合时的最终体积将显示在各浓度面板前方的体积面板中。
   11. 按压 启动准备 按钮（图8）。如图所示 图7旋转阀通过切换将每种储备溶液注入混合管中。
   12. 在结晶溶液配制完成后，点击 进入溶液 [Solution Entry] 按钮在 步骤3：通量 泵部分（黄色框内） 图8）。切换开关以将混合管中的新结晶溶液注入储液室。要停止交换过程，请按下 停止分配 按钮
       注意：在实验过程中观察结晶过程，并通过监控软件的相应图形界面调整温度、结晶溶液和放大倍数等参数。使用该软件时，无需在实验过程中取下密封盖或流动池，因此唯一的变量即为用户通过软件所更改的参数。
3. 大晶体生长
   1. 加入15 μL浓度为30 mg·mL的溶菌酶^-1 到透析室（图6A).
      注意：按照第1.1节所述方法制备蛋白质样品。
   2. 按照第2.1节所述组装温控流动储液透析装置，并 图6.
   3. 配制结晶溶液。在样品制备前，切勿忘记使用0.22 μm滤膜对所有储备液进行过滤。本实验所用结晶溶液包含0.75 M NaCl和0.1 M CH₃COONa，pH 4。可手动添加，也可通过储液室加入 以及2.2.10至2.2.12节所述的泵送系统。
   4. 将温度设置为295 K，具体操作见2.2.3和2.2.4节，如图8所示。在初始条件下，透析室与储液室之间约90分钟后达到平衡，22小时后将出现首个可见的晶核。
   5. 让晶体生长至观察不到晶体尺寸的进一步明显变化为止（图9，图1）。
      注意：为了确定成核时间并测量晶体尺寸的变化，应每15或20分钟记录一次图像，即每小时分别记录4次或3次图像。 NB图像 部分。对于 原位 观察蛋白质变性、聚集和沉淀，或晶体溶解或成核，通常需要几秒到几十分钟。然而，对于晶体生长，该时间范围为几分钟到几小时。
   6. 三天后，将温度降至291 K以重新启动晶体生长。保持温度恒定，使晶体继续发育（图9，第2组）。在此实验阶段，每2小时记录一次图像，并每10至12小时检查一次晶体尺寸是否发生变化即可。若未观察到晶体尺寸变化，可继续进行实验。
      注意：根据结晶溶液中蛋白质和沉淀剂的浓度以及所用蛋白质的体积，每一步达到平衡所需的时间可能有所不同。
   7. 将温度降低至288 K以重新启动晶体生长。在本案例所展示的实验条件下，一天时间足以达到平衡状态。图9，第3组）
   8. 检查晶体大小，并在晶体持续生长期间保持恒定温度。
   9. 4天后，将温度降至275 K，以重新启动晶体生长（图9，第4组）
      – 在本案例所呈现的实验条件下，经过约10天可获得一个单边尺寸为500 μm的晶体图9).
4. 控制晶体尺寸
   1. 按照第2.3.1和2.3.2节所述，制备蛋白溶液并设置温度可控的流动贮液透析装置。
   2. 用 0.9 M NaCl 和 0.1 M CH 配制结晶溶液₃COONa pH 4.0
   3. 将温度设置为 291 K，使晶体生长。在初始条件下，约一小时后开始出现首次成核事件，随后在透析室中持续生长出大量晶体，历时三小时（图10，步骤：1 和 2）。在晶体生长过程中，每 20 分钟记录一次图像以检查晶体大小。
      注意：结晶条件的优化对于控制所生成晶体的大多数最终性质至关重要。可通过改变结晶溶液的温度和化学组成，使晶体溶解并重新生长为大小均一的晶体。还需注意，在此类实验中蛋白质样品不会被消耗，只要样品未发生变性，即可通过逆转条件使其重新溶解。当通过改变温度并保持化学组成恒定来溶解晶体时，应按以下步骤继续实验：
   4. 一旦晶体在291 K下生长，可将其溶解以重新生长出更少但更大的晶体。在20分钟内逐渐升温至313 K。透析室内的所有晶体完全溶解约需一小时。图10，步骤：3-5）。每5至15分钟记录一次图像，以监测溶解过程。
      注意：许多蛋白质对高温敏感。务必在蛋白质保持稳定的温度范围内操作，以避免任何损伤或变性。除了蛋白质溶解度外，温度也会影响缓冲液溶液。例如，缓冲液的pH值可能随温度变化，尤其是在Tris缓冲液中。在此情况下，必须根据实验所用温度来调节缓冲液的pH值。¹⁸还需注意，与蛋白质晶体生长（数小时至数天）相比，蛋白质溶解所需时间显著更短（数分钟至数小时）。通常情况下，在晶体溶解过程中，温度应逐渐且缓慢地上升（尽管总溶解时间较短），尤其是在晶体部分溶解时，以避免晶体镶嵌度增加。而在晶体生长过程中，温度可在不到一分钟内迅速降至设定温度（考虑到总的生长周期较长）。建议通过图像记录定期监测结晶腔室，以防止蛋白质受损，并有助于确定每种被研究蛋白质晶体溶解或生长的最佳时间。
   5. 所有晶体溶解后，将温度设为295 K以引发第二次成核事件（图10，步骤：6、7）。每5分钟记录一次图像，以监测第二次成核过程。在此步骤中，第一个核开始出现 大约18分钟后。
      注意：在此温度下，溶液将处于成核区，靠近亚稳区。因此，结晶室中仅会出现少量晶核。
   6. 继续实验，重复第2.3节中所述的优化流程，以培养更大的晶体。该实验的总持续时间如图所示。 图10 只有几天。
      注意：在成核阶段，如果晶体在不同时间出现，则会在结晶室中获得不同大小的晶体。在此情况下，升高温度（针对具有直接溶解度的蛋白质）将导致较小的晶体更快溶解。根据动力学熟化效应，溶解所产生的额外蛋白质可用于较大晶体的生长。
      在恒温条件下通过改变结晶溶液的化学组成来溶解晶体时，按以下步骤继续实验：
      也可以在实验过程中通过改变结晶溶液的化学成分，使先前生长的晶体重新溶解，从而在新的条件下重新生长出一批尺寸均一的晶体。
   7. 制备蛋白溶液（2.3.1）、控温流动储液透析装置（2.1）和结晶溶液（2.4.2），方法如上所述。在初始条件下，于远离亚稳区的成核区内，结晶室中将出现大量微小晶体并开始生长。图11，步骤：1,2。
   8. 三小时后，当结晶室中可见大量中等大小的晶体时（图11，步骤3）逐渐降低NaCl浓度（从0.9 M）至零。为此，配制一种新的结晶溶液，仅含缓冲液和0.1 M CH₃COONa，pH 4。使用泵系统将储液室中的溶液置换为结晶溶液。按照步骤 2.2.10 至 2.2.12 的操作，向储液室中配制并注入新溶液。通过该新溶液进行溶液置换，使储液室中的 NaCl 浓度逐步降低，直至储液室中的最终溶液所含 CH 浓度不超过 0.1 M₃COONa，pH 4，不添加 NaCl。每10分钟拍摄一次图像，记录溶解过程。
   9. 让晶体完全溶解（图11，步骤：4、5）。本实验的溶解时间约为两小时。如前所述，溶解时间取决于蛋白质体系和结晶条件， 以及透析室的体积。应定期观察结晶室（参见 显微镜 部分）以及在实验过程中记录图像和笔记 必需的。
   10. 当腔室内的所有晶体均溶解后（图11，步骤5）使用泵系统再次注入浓度低于前一次的NaCl（0.75 M NaCl，溶于0.1 M CH）以制备新的结晶溶液₃COONa，pH 4）
   11. 将新溶液注入储液室（图11，步骤：6、7），并重复第2.3节所述的结晶生长优化流程。将获得一群大小均匀且更大的晶体。所示结果见于 图11 几天后获得。

结果

在第2.3和2.4节中，展示了三个优化晶体生长的实例，说明了仪器的使用方法以及用于生长大尺寸晶体的实验设计。在本演示中，我们以溶菌酶作为模型蛋白进行实验，尽管使用该方法已成功实现了多种其他蛋白质体系的晶体生长（见上文）。通过使用并掌握本文所介绍的实验方案，研究人员可将其适配于其他蛋白质样品。

在第2.3节中，我们证明了已建立的理性结晶策略有助于生长出具有足够散射体积的晶体，以用于中子蛋白质晶体学。在此，我们证明所提出的理性优化策略还能够生成适用于后续结构测定方法所需特定尺寸的均一晶体群体。

这两个实验旨在强调相图在控制晶体成核与生长过程中的重要性。通过调控结晶溶液的温度和化学组成，并结合实时监测结晶过程，可研究其定性相图。利用该方法，能够以可逆的方式合理优化晶体的成核与生长过程。采用这种串联式策略还可减少用于控制晶体尺寸和质量所需的蛋白用量及时间。

在透析法中，蛋白质溶液与结晶溶液通过半透膜分隔开⁶（图5）。这种透析膜允许小分子（如添加剂、缓冲液和离子）通过膜扩散，而蛋白质等大分子则不能通过^6,20。这一特性使得在实验过程中可以对结晶溶液进行调整⁶。溶液的更换可以手动进行，例如使用微型透析按钮，也可以利用专为此设计的自动化仪器OptiCrys实现⁸。

在第一组实验中，使用微透析按钮法对鸡卵清溶菌酶进行结晶。将微透析按钮浸入含有不同盐浓度的结晶溶液中。在此简单的结晶条件筛选实验中，唯一变量是沉淀剂浓度，而温度保持恒定（293 K）。如图4所示，盐浓度的微小变化会引起所观察到的晶体大小和数量的变化，从而可对结晶相图进行研究。在图4的第1个图板中，结晶溶液含有0.7 M NaCl，按钮中出现数量有限的较大晶体。当盐浓度从0.7 M增加至1.2 M时，过饱和度升高，溶液在成核区的位置逐渐远离亚稳区（图4，图板1至6）。结果，晶体数量增加，而晶体尺寸减小。

在首次使用全自动仪器进行温度控制透析结晶的实验中，采用OptiCrys（图9），实验设计旨在促进大晶体的生长。实验初始温度设为295 K，结晶溶液包含0.75 M NaCl和0.1 M乙酸钠缓冲液（pH 4）。在这些实验条件下，结晶溶液接近相图亚稳区的成核区（图9，箭头1）。因此，在实验的第一阶段仅生成少量晶核。为了进一步生长选定的晶体（如图9所示），一旦达到晶体-溶液平衡，即通过调节温度，将晶体生长优化流程导向亚稳区。

每当晶体与溶液达到平衡后，温度逐步降低，依次降至291 K、288 K，最后降至275 K，以使结晶溶液保持在亚稳区。该实验最终获得一颗适用于大分子X射线和中子晶体学研究的单一完整大晶体。

对于大多数蛋白质而言，由于缺乏能够准确实时测量蛋白质浓度（或仅能观察/检测结晶过程）的实验设备，其精确的定量相图（或仅仅是定性相图）尚未获得¹⁸。因此，通常无法在相图的亚稳区附近这一最佳区域启动结晶，从而难以据此设计出理想的实验方案。

因此，在开展大体积晶体生长实验之前，必须进行结晶优化研究。该研究需要一方面在恒定化学组成的条件下改变温度，另一方面在恒定温度条件下改变化学组成，以确定亚稳区并明确大晶体生长实验的最佳条件。

为此，本文还介绍了另外两个实验，这些实验专门设计用于验证OptiCrys在温度控制透析结晶过程中晶体成核、生长、溶解及再生长的可逆性。通过调控温度或沉淀剂浓度，优化了晶体生长流程，从而获得数量较少但尺寸更大、分布均匀的溶菌酶晶体。

在第二次使用OptiCrys的实验中，结晶溶液的化学组成在整个实验过程中保持恒定（0.9 M NaCl，0.1 M CH₃COONa，pH 4），仅改变温度。初始温度设定为291 K。本实验的结果总结于图10中。由于过饱和度较高，结晶室中出现了大量微小晶体（图10，图版1和2）。根据直接蛋白质溶解度的概念，通过逐步升高温度至313 K，所有晶体均被溶解（图10，图版3、4和5）。最后，将温度降低至295 K，在亚稳区附近引发第二次成核，从而控制形成较少的晶核。随后的晶体生长导致生成数量较少但尺寸较大的均匀晶体群体（图10，图版7）。

如图11所示，在恒定温度291 K下，通过改变结晶溶液的化学组成，同样可以获得尺寸更大且分布均匀的晶体群体。与之前的实验类似，初始条件为0.9 M NaCl溶于0.1 M CH₃COONa（pH 4）缓冲液中。随后，NaCl浓度从0.9 M逐步降低至零，以溶解晶体（图11，第4和第5图）。此时，NaCl被完全替换为0.1 M CH₃COONa（pH 4）缓冲溶液。降低盐浓度可使溶液保持在相图的未饱和区，从而导致晶体溶解。随后，将一种离子强度较低的新结晶溶液（0.75 M NaCl溶于0.1 M CH₃COONa，pH 4）注入储液室。在此沉淀剂浓度下，90分钟后首次出现晶核（图11，第6图）。生成的晶体数量较少，但晶体体积比之前更大（图11，第7图）。

图1：相图示意图。 三种结晶技术的动力学轨迹在盐析区域中表示。每种方法通过相图中不同的动力学路径进入成核区和亚稳区，从而以不同方式实现成核与结晶。溶解度曲线将未饱和区与过饱和区分隔开来。过饱和区进一步分为三个区域：亚稳区、成核区和沉淀区。在成核区内发生自发成核，而在亚稳区内则发生晶体生长。本图改编自 Junius et al.⁸ 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：结晶实验台（OptiCrys）的示意图。LED 光源位于温控透析流动池的上方。倒置显微镜和数码相机如图中右上角红色箭头所示。红色圆圈表示冷却循环管路的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：蛋白质二维结晶相图示意图，显示温度（A）和沉淀剂浓度（B）的影响。（A）对于具有直接溶解度的蛋白质，降低温度可使结晶溶液保持在亚稳区。可通过多次改变温度来控制晶体生长过程，直至获得所需体积的晶体。（B）调节沉淀剂溶液的浓度也可用于使结晶溶液在晶体生长期间保持在亚稳区。本图改编自 Junius et al.⁸ 请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：通过透析法获得的溶菌酶晶体。本实验在 293 K 恒温条件下，使用 0.1 M 乙酸钠缓冲液（pH 4）进行。将 NaCl 浓度从 0.7 M 提高至 1.2 M，可提高成核速率，导致晶体数量增多。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：透析法蛋白质结晶过程示意图。（A）将蛋白质加入透析按钮的腔室中，（B）在腔室顶部形成穹顶状结构。（C）使用施用器将O型圈转移至透析按钮的凹槽中，以固定透析膜的位置。（D）透析按钮已准备就绪，可浸入储液溶液中。（E）结晶溶液透过半透膜进入腔室，晶体开始在腔室内形成。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：温控流动透析装置的示意图。(A) 将蛋白质样品加入透析室中。(B) 使用涂布器将透析膜通过O型圈固定在上室上。(C) 将上室旋转并固定在透析室顶部。白色箭头指示上室上螺钉的位置。(D) 储液室顺时针旋转(E)并固定在上室顶部。(F) 储液室由带有连接至泵系统的接头的气密盖密封，(G) 流通池置于黄铜支架中。本图改编自Junius et al.⁸ 请点击此处查看此图的放大版本。

图7：流体系统将结晶溶液制备并注入储液池的过程（A）。 装有盐溶液和水的管路连接至压力/真空控制器（B）和旋转阀（C）。通过施加压力，压力/真空控制器驱动液体从管路持续流至旋转阀。每种液体依次经过流量计（D）和切换开关后，被注入混合管（F）。当所有液体均加入混合管后，经若干改进的切换开关将最终混合溶液从混合管注入储液池（G）。液体在系统中的流动方向如图中箭头所示，按升序编号（从1到6）进行。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 8：监控软件的维护界面。该界面用于控制温度、光照、结晶溶液和放大倍数等不同参数。请点击此处查看此图的放大版本。

图9：温度函数下的相图（所选图像按升序追踪）。 通过将温度从295 K系统地降低至275 K，可获得单个大的溶菌酶晶体。每一步中，当达到溶解度曲线时即停止晶体生长。通过将溶液保持在亚稳区内降低温度，可重新启动晶体生长。图像具有不同的放大倍数。本图改编自Junius et al.^8,18 请点击此处查看此图的放大版本。

图10：通过温度控制在恒定化学组成下优化晶体生长（所选图像按升序追踪）。在291 K下于成核区启动成核过程（远离亚稳区），会导致大量晶体形成。随后将温度升至313 K，晶体逐渐溶解，直至透析室中无可见晶核。最后，将温度降至295 K，第二次重启成核过程，从而形成数量有限但尺寸较大的晶体。本图改编自 Junius et al.^8,18 请点击此处查看此图的放大版本。

图11：通过改变沉淀剂浓度在恒定温度下优化晶体生长（所选图像应按升序追踪）。 将沉淀剂浓度从 0.9 M 降低至 0 M 会溶解第一次成核事件中获得的晶体。通过注入相同沉淀剂但离子强度较低（0.75 M）重新启动结晶过程，从而形成少数较大的晶体。本图改编自 Junius et al.^8,18 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

不同的物理、化学和生物变量通过影响蛋白质的溶解度来影响蛋白质结晶²¹。在这些变量中，温度和结晶溶液的化学组成在此与透析技术结合使用，以改进并生长出用于中子衍射研究的生物大分子的大尺寸高质量晶体。通过利用相图的知识，结晶过程变得更加可预测。尽管以序列方式筛选不同的结晶条件也是可行的，但采用本文所述理性方法的主要目的是分离并控制晶体成核与生长的动力学过程。

与所有结晶研究类似，高质量、纯净且均一的蛋白质样品以及无尘的结晶溶液可提高实验的成功率。在所述方案中，溶液的过滤和离心是必不可少的步骤。了解所研究蛋白质的理化性质，例如分子量（用于选择合适的透析膜）、等电点以及蛋白质溶解度，对于设计最优的晶体生长实验至关重要。此外，还需考虑蛋白质在不同温度或不同化学试剂条件下的稳定性，以防止样品损失并提高实验成功的可能性。鉴于OptiCrys的温度范围（233.0–353.0 ± 0.1 K），该仪器适用于广泛种类的蛋白质结晶。但需要强调的是，主要具有热稳定性的蛋白质，例如来源于嗜热菌的蛋白质，将最能受益于该仪器所提供的温度可控的大体积晶体生长实验条件。

使用小体积透析室（使用OptiCrys时）或微透析按钮，并筛选多个温度和结晶条件（例如，沉淀剂浓度或pH值的矩阵实验），可以获得关于亚稳区边界位置的信息（即成核区与亚稳区之间的动力学平衡）。这对于设计成功的晶体生长实验至关重要，尤其是在针对新蛋白质候选物进行结晶时尤为如此。若缺乏此类信息，实验可能从相图中过饱和度过高的区域开始，远离亚稳区边界，导致难以控制晶体成核过程。尽管可以尝试通过提高温度等方式使蛋白质沉淀重新溶解（例如在直接溶解度情况下），但对于热稳定性较差的蛋白质，长时间处于高温可能导致沉淀不可逆。因此，最佳策略是采用初始较低的过饱和度条件，使其位于接近亚稳区边界的区域，在此条件下可控制成核过程并避免蛋白质沉淀。据此，结晶预筛选能够降低蛋白质在透析室中发生沉淀的可能性，从而提高实验成功率。

设计实验后，制备透析室（OptiCrys）或微透析按钮是另一个重要步骤。防止透析室/按钮中形成气泡可提高结晶成功的几率，尤其是在使用小体积样品时。透析室中存在气泡还可能改变结晶过程的动力学，并降低实验的可重复性（因为蛋白质/溶液接触表面积已发生改变）。不仅蛋白质本身，结晶溶液也会影响实验的成功。每次开始新实验时使用新的50 mL离心管作为泵系统组件，并在每次实验后清洗管路，可降低污染风险，并避免装置中形成盐结晶。

当无法获得OptiCrys时，可使用微透析按钮作为替代方案。上述用于优化结晶及监测晶体生长的策略必须手动完成。通常这需要将样品置于温度受控培养箱之外，而当温度调控是本方法中的关键步骤时，这一操作可能带来问题。此外，该方法无法实时调整结晶溶液的化学成分，也无法通过成像手段监测晶体生长，因此无法对晶体生长过程进行实时控制。

了解相图是使用结晶平台 OptiCrys 系统化地以自动化方式生长大尺寸、高质量晶体的基础。在结晶过程中，通过对温度、沉淀剂浓度和 pH 等理化参数的控制，可使蛋白质-溶液平衡沿相图中明确的动能轨迹移动。该过程结合透析膜的使用，调节物质传输并在结晶室中建立可控的浓度梯度，从而影响晶体的尺寸和质量。因此，为了控制结晶过程并生长出高质量晶体，必须同时利用热力学数据和动能轨迹。得益于 OptiCrys，现在可以通过串联方法在多维空间中系统研究相图，且所需样品量显著少于以往。为展示该方法，本文以鸡卵清溶菌酶这一模型蛋白为例进行案例研究。通过使用并掌握本文所提供的实验方案，研究人员可将其适配于实际的蛋白质体系^5,14,17,18。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
200 µl 透析按钮	Hampton Research	HR3-330	透析按钮
24 孔板	Jena Bioscience	CPL-132	结晶板
2-开关	FLUIGENT	2SW001	开关
30 μl 透析按钮	Hampton Research	HR3-324	透析按钮
50 mL Corning 离心管	Sigma-Aldrich	CLS430828-500EA	离心管
乙酸	Sigma-Aldrich	S2889	化学试剂
鸡蛋清溶菌酶	Sigma-Aldrich	L6876	冻干蛋白粉末
透析膜圆片，6–8 kDa 截留分子量	Spectrum	132478	透析膜
透析膜管，6–8 kDa 截留分子量	Spectrum	132650T	透析膜
微量离心机	Eppendorf	Minispin	台式离心机
流量单元	FLUIGENT	FLU-XL	流量计
Flowboard	FLUIGENT	FLB	Flowboard
微流控流量控制系统 EZ	FLUIGENT	EZ-01000002	压力/真空控制器
MilliporeSigma 0.22 µm 注射器滤器	Millipore	GSWP04700	孔径 0.22 μm 的滤器
M-开关	FLUIGENT	MSW002	旋转阀
Opticrys	NatX-ray	PRT008	结晶工作台
硅化圆形盖玻片	Hampton Research	HR3-231	玻璃盖片
氯化钠 ≥ 99%	Sigma-Aldrich	746398	化学试剂
Switchboard	FLUIGENT	SWB002	Switchboard
温控培养箱	Memmert	IPP30	温控培养箱