本方案介绍了一种使用可吸收缝线获得短暂性心肌肥厚的改进方法，可模拟在去除压力超负荷后左心室肥厚的减轻过程。该方法对心肌肥厚预处理的相关研究具有重要价值。
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摘要
摘要
基于小鼠两次横主动脉缩窄术（TAC），已证实心肌肥厚预处理（MHP）可减轻心肌细胞肥厚，并延缓心力衰竭的进展。然而，对于初学者而言，由于呼吸机操作、反复开胸以及去绑扎时出血等技术难题，建立MHP模型通常较为困难。为了简化该模型，提高手术成功率并减少出血发生率，我们改用可吸收缝线进行首次TAC，并结合无呼吸机辅助的技术。使用2周可吸收缝线，我们证实该操作可在2周内诱导显著的心肌肥厚；术后4周，心肌肥厚几乎完全恢复至基线水平。采用本方案后，操作者可更轻松地掌握MHP模型，且手术死亡率较低。
引言
缺血预处理是一种通过对心脏施加短暂的非致死性缺血和再灌注发作，从而显著减轻心肌损伤的现象1。鉴于缺血预处理具有重要的临床意义，例如缩小心肌梗死面积2以及抑制心肌血运重建后室性心动过速性心律失常3，已有大量研究致力于解析预处理所诱导的心脏保护作用的潜在机制4,5。相比之下，其他非缺血类型的预处理受到的关注相对较少。在接受主动脉瓣置换术的主动脉瓣狭窄患者中，心肌肥厚可能受到抑制6。然而，在存在病理性心肌肥厚状态的情况下，预处理原则极少被报道。
1991年，Rockman等人首次通过横主动脉缩窄术（TAC）建立了小鼠左心室肥厚模型7。我们先前通过在小鼠中进行两次TAC手术，证实心肌肥厚预处理（MHP）可在心脏中引起短暂的肥厚刺激，从而使心脏在未来对持续性肥厚应激具有更强的耐受性8。该MHP模型的特征已通过超声生物显微镜和血流动力学评估得到验证9。构建该模型的关键步骤包括三次开胸手术：TAC持续1周，去缩窄持续1周，以及二次TAC持续6周。然而，去缩窄操作可能导致出血，使初学者难以掌握，也限制了该方法的推广应用。此外，小鼠气管插管也是一项技术难点，不当的插管操作可能引起气管损伤、气胸甚至小鼠死亡。因此，在构建MHP模型过程中，对部分操作步骤进行优化具有必要性和重要价值。
为了降低模型的难度并提高其成功率，我们首次在TAC手术中改用可吸收缝线，并通过超声心动图测量主动脉缩窄处的压力梯度来监测模型的成功情况10。根据我们的预实验结果，压力梯度过低难以在小鼠中诱导出足够的心肌肥厚，而压力梯度过高则会导致小鼠发生急性心力衰竭甚至死亡。该模型的理想压力梯度范围为40–80 mmHg11。此外，本实验不依赖呼吸机，可有效避免与呼吸机相关的技术操作及损伤12。
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方案
所有操作均按照以下指南进行 实验动物的护理与使用 由美国国立卫生研究院（NIH出版号85-23，1996年修订版）发布。C57BL/6J雄性小鼠（8–10周龄，20–25 g）由南方医科大学动物中心提供。
1. 术前准备
- 用持针器夹住25 G针头的尖端，并用持针器等硬物将其钝化。
- 将5-0可吸收缝线穿过针头，然后用持针器将其弯曲成90°13。
注意：根据不同的研究目的，研究人员可选择吸收时间不同的可吸收缝线。本方案中，我们使用吸收时间为2周的可吸收缝线来缩窄主动脉弓。 - 将另一根25 G针头弯曲成120°，并用持针器磨平其尖端，用于结扎步骤中的间隔物。
注意：对于体重（BW）>25 g的小鼠，使用25 G针头作为间隔物；对于体重为19–24 g的小鼠，则使用26 G针头。 - 用75%酒精对术区进行消毒。
- 将加热垫温度调节至37 °C。
- 准备已灭菌的外科手术器械（包括1把眼科剪、1把显微剪、2把显微外科弯镊、1把持针器和1把显微持针器）。
2. 麻醉诱导与剃毛
- 通过腹腔注射将赛拉嗪（5 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）溶于生理盐水（0.9% NaCl）的混合液，使小鼠麻醉。通过检测后肢足底回缩反射消失确认麻醉完全。
- 用缝线固定小鼠门齿，并用胶带固定四肢，使其保持仰卧位。
- 涂抹脱毛膏以去除颈部和剑突部位的毛发，随后用碘伏消毒，再用75%酒精脱碘。
3. 手术
- 使用手术刀在胸骨上切迹与胸部之间的中线位置做一个超过10 mm的切口，然后分离皮肤和浅筋膜。
- 从胸骨角开始计数肋骨以确定第一肋间间隙，在靠近胸骨的第一肋间间隙处做切口，并使用弯头镊子钝性穿入以打开该间隙。
- 轻柔分离实质组织和胸腺，直至横主动脉弓可见。
注意：避免损伤壁层胸膜，以防发生气胸。 - 使用持针器将5–0可吸收缝线从头臂动脉与左颈总动脉之间的主动脉弓下方穿过14。请确保手术视野中可见头臂动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉。
- 将步骤1.3中准备好的垫片放置于横主动脉上，并利用步骤3.4中的缝线在垫片上打双结。
注意：垫片尖端必须为钝头，以便在取出时避免损伤横主动脉。 - 迅速但轻柔地移除垫片，然后剪断缝线两端。
- 使用5–0尼龙缝线缝合第一肋间间隙和皮肤，并用75%酒精再次消毒皮肤。
- 将小鼠置于加热垫上以促进恢复，术后前3天每天两次（q12h）腹腔注射布托啡诺（0.1 mg/kg）。
- 当小鼠意识恢复后，将其放回饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中的笼内。
- 假手术组的操作与上述所有步骤相同，但不进行缩窄操作（步骤3.5）。
- 丝线缝合组的手术操作与上述所有步骤相同，但在步骤1.2中使用5–0丝线。
4. 成功结扎的超声心动图评估与测量
- 术后第7天进行超声心动图评估。
- 使用3%异氟烷通过吸入法对小鼠进行诱导麻醉，维持麻醉深度时使用1.5%异氟烷，氧流量为0.5–1 L/min。
- 将小鼠仰卧位固定于保持在37 °C的平台上，并将其四肢用胶带固定于电极上。
- 使用脱毛膏去除胸部毛发，并在小鼠胸部涂抹超声耦合剂。
- 使用30 MHz探头评估横主动脉缩窄（transverse aortic constriction）。
- 将平台向最左侧倾斜。保持探头垂直，沿右侧胸骨旁线下降至胸部。然后在B模式下调节X轴和Y轴，直至清晰显示主动脉弓。
- 通过B模式定位缩窄部位以获得主动脉弓视图11。使用彩色多普勒模式和脉冲波测量峰值血流速度，选择血流速度超过3,000 mm/s的小鼠作为TAC组（数值基于预实验结果）。
- 根据修正的伯努利方程11计算压力梯度：
压力梯度 = 4 × Vmax2。
注：横主动脉缩窄模型的理想压力梯度范围为40–80 mmHg11。 - 使用Cine Store和Frame Store保存数据和图像。
- 使用30 MHz探头评估左心室（LV）的尺寸和收缩功能。
- 将平台恢复至水平位置。探头相对于左侧胸骨旁线逆时针旋转30°。
- 使用B模式并调节X轴和Y轴，获得清晰完整的心脏长轴切面图像。
- 按下M模式按钮显示指示线。使用Cine Store和Frame Store采集图像，用于后续测量左心室腔尺寸、缩短分数及左心室壁厚度。
- 操作完成后，停止异氟烷吸入，让小鼠从麻醉中恢复，随后将其放回饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中的笼具内。
- 术后第14天和第28天，重复上述步骤测量心脏参数，之后取心脏组织进行组织学研究。
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结果
在本研究中，我们将45只小鼠随机分为三组：假手术组、丝线结扎组和可吸收缝线组（TAC术后第0天（基线）、第14天和第28天每组动物数量分别为15、10和5只）。术后第7、14、21和28天，通过超声心动图测定缩窄处的峰值流速。我们发现，即使使用可吸收缝线缩窄主动脉弓，术后第二周缩窄处的血流速度仍高于3,000 mm/s（图1A）。此外，可吸收缝线组缩窄处的压力梯度在术后两周内持续维持在40 mmHg以上（图1B）。有趣的是，术后第四周已无明显缩窄，表明可吸收缝线已被完全吸收。
我们还发现，在TAC术后第14天，左心室舒张末期后壁厚度增加，左心室舒张末期内径略有减小图2A-C）。有趣的是，可吸收缝线组在TAC术后第28天舒张末期左心室后壁厚度显著回落，与基线水平相比无显著差异。此外，使用可吸收缝线构建模型并未影响左心室的射血分数图 ...
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讨论
在心脏非缺血性预处理领域，仍存在一个尚未充分探索的广阔区域。根据我们之前的研究，我们改用可吸收缝合线以改进心肌肥厚预处理模型。
在以往的报道中，许多研究人员使用丝线缝合线缩窄主动脉弓8,14,15。丝线缝合线易于获取，常用于外科伤口缝合、组织结扎和组织固定。在本方案中，我们首次采用可吸收缝合线替代丝线进行TAC手术。我们发现，缩窄处的血流速度仍可达到3,000 mm/s或更高，并可持续2周，足以作为长期的肥厚性刺激。随后，该速度在第28天（D28）恢复至基线水平。然而，可吸收缝合线的吸收时间较难控制。其吸收时间与可吸收缝合线的材质和批次、组织的适应性以及缩窄时的松紧度有关。我们较早前发现，缩窄越紧，吸收时间越短，但同时小鼠的死亡率也会升高。因此，我们选择将峰值速度设定在约3,000 mm/s作为标准，从而使吸收时间控制在2周以内，同时提高小鼠的存活率。更为重要的一点是，使用可吸收缝合线可将开胸次数...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了国家自然科学基金（81770271；项目负责人：Y. Liao）、国家自然科学基金联合基金（U1908205；项目负责人：Y. Liao）以及广州市科技计划项目（201804020083；项目负责人：Liao 博士）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 可吸收缝合线（5-0） | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | 结扎 |
| 动物超声系统 VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | 超声心动图 |
| 冷光源照明器 | Olympus | ILD-2 | 照明 |
| 恒温手术加热垫系统（ALC-HTP-S1） | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | 加热 |
| 异氟烷 | RWD life science | R510-22 | 吸入麻醉 |
| Matrx VIP 3000 异氟烷挥发器 | Midmark Corporation | VIP 3000 | 麻醉 |
| 医用尼龙缝合线（5-0） | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | 关闭皮肤 |
| 戊巴比妥钠盐 | Merck | 25MG | 麻醉 |
| 精密电子天平 | Denver Instrument | TB-114 | 称重传感器 |
| 自制间隔器 | 25 号针头 | ||
| 丝线缝合线（5-0） | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | 结扎 |
| 小型动物显微外科设备 | Napox | MA-65 | 手术器械 |
| 超声传导凝胶 | Guang Gong pai | 250ML | 超声心动图 |
| Veet 脱毛膏 | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | 去除小鼠体毛 |
| 立式自动电热压力蒸汽灭菌器 | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | 自动清洁手术器械 |
参考文献
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Ban, K., et al. Phosphatidylinositol 3-kinase gamma is a critical mediator of myocardial ischemic and adenosine-mediated preconditioning. Circulation Research. 103 (6), 643-653 (2008).
- Wu, Z. K., Iivainen, T., Pehkonen, E., Laurikka, J., Tarkka, M. R. Ischemic preconditioning suppresses ventricular tachyarrhythmias after myocardial revascularization. Circulation. 106 (24), 3091-3096 (2002).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Preconditioning and postconditioning: underlying mechanisms and clinical application. Atherosclerosis. 204 (2), 334-341 (2009).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Lund, O., Emmertsen, K., Dorup, I., Jensen, F. T., Flo, C. Regression of left ventricular hypertrophy during 10 years after valve replacement for aortic stenosis is related to the preoperative risk profile. European Heart Journal. 24 (15), 1437-1446 (2003).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciiences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Wei, X., et al. Myocardial hypertrophic preconditioning attenuates cardiomyocyte hypertrophy and slows progression to heart failure through upregulation of S100A8/A9. Circulation. 131 (17), 1506-1517 (2015).
- Huang, J., et al. Ultrasound biomicroscopy validation of a murine model of cardiac hypertrophic preconditioning: comparison with a hemodynamic assessment. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 313 (1), 138-148 (2017).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circulation Research. 98 (6), 837-845 (2006).
- Li, L., et al. Assessment of cardiac morphological and functional changes in mouse model of transverse aortic constriction by echocardiographic imaging. Journal of Visualized Experiments. (112), e54101(2016).
- Veldhuizen, R. A., Slutsky, A. S., Joseph, M., McCaig, L. Effects of mechanical ventilation of isolated mouse lungs on surfactant and inflammatory cytokines. The European Respiratory Journal. 17 (3), 488-494 (2001).
- Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59431(2019).
- Eichhorn, L., et al. A closed-chest model to induce transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57397(2018).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of minimally invasive transverse aortic constriction in mice for induction of left ventricular hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (127), e56231(2017).
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重印与许可
