与抗原标记阻断病变的复制体遭遇的可视化

摘要

虽然与DNA加合物的复制叉碰撞可以诱导双链断裂，但对爬酶体和阻断病变之间的相互作用知之甚少。我们采用邻近连接测定来可视化这些遭遇并表征对重复体组成的影响。

摘要

对由核酸酶、辐射和其他 DNA 破坏者诱导的双链断裂 （DSB） 的细胞反应存在相当多的见解。这在一定程度上反映了识别断裂位点的方法的可用性，以及这些序列中招募到DSB的因素的特征。然而，DSB在加工由不直接引起断裂且不在特定序列位点反应的化合物形成的DNA加合物的过程中也作为中间体出现。因此，对于大多数这些药物，允许分析与反应因子和修复蛋白的结合相互作用的技术是未知的。例如，DNA链间交联（ICL）可以在复制叉遭遇后引起断裂。虽然由被广泛用作癌症化疗药物的药物形成，但没有监测它们与复制蛋白相互作用的方法。

在这里，我们描述了我们用这些具有挑战性的加合物跟踪细胞对叉子碰撞的反应的策略。我们将类固醇抗原与补骨脂素联系起来，补骨脂素在活细胞核中形成光活化依赖性ICL。通过针对抗原标签的免疫荧光观察ICL。该标签也可以是邻近连接测定（PLA）的合作伙伴，该测定报告两种抗原的密切关联。PLA被用来区分与标记的ICL密切相关的蛋白质和不与标记ICL密切相关的蛋白质。可以定义在遇到ICL后保留的复制体蛋白质，并识别其他丢失的蛋白质。这种方法适用于任何可以通过免疫学检测的结构或DNA加合物。

引言

细胞对双链断裂的反应有据可查，因为一系列越来越强大的方法将断裂引导到特定的基因组位点¹，^2，3。位置的确定性能够明确表征在位点积累并参与DNA损伤反应（DDR）的蛋白质和其他因子，从而驱动修复断裂的非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）途径。当然，许多中断是由不攻击特定序列的辐射和化学物质等因素引入的⁴.但是，对于这些，有一些程序可以将末端转换为适合标记和本地化的结构^5，6。生物过程也引入了断裂，例如免疫球蛋白重排，最近的技术允许它们的定位，以及⁷。然后可以确定响应因素与这些站点之间的关系。

断裂也作为由化合物形成的加合物的间接结果出现，这些化合物不是固有的破坏者，而是破坏DNA交易，如转录和复制。它们可能是细胞对这些障碍物的反应的一个特征，可能是在修复过程中，或者因为它们引发了易受核酸酶攻击的结构。通常，加合物、断裂以及与响应因子的关联之间的物理关系是推断性的。例如，ICL由顺铂和丝裂霉素C⁸等化疗药物形成，并作为非碱性位点⁹的反应产物。众所周知，ICL是复制叉¹⁰的有效阻断，从而阻止可以被核酸酶¹¹切割的叉。链之间的共价连接通常通过作为中间体¹²，¹³具有专性断裂的途径来缓解^，因此需要同源重组以重建复制叉¹⁴。在大多数实验中，研究者遵循感兴趣的因素对复制叉与ICL碰撞下游形成的断裂的反应。然而，由于尚无定位激发性病变的技术，因此只能假设重复体及其组成部分与ICL的接近程度。

我们已经开发了一种策略，能够分析蛋白质与非序列特异性共价加合物的关联，此处由ICL说明。在我们的系统中，这些是由补骨脂素引入的，补骨脂素是一种光活性天然产物，数千年来一直用作治疗皮肤病的方法¹⁵。我们的方法基于补骨脂素的两个重要特征。首先是它们的交联形成频率高，可以超过90%的加合物，而顺铂或丝裂霉素C^8，16等流行化合物形成的不到10%。第二个是化合物在不损失交联能力的情况下进行偶联。我们已经将三甲基补骨脂素与地高辛（Dig）共价连接，地高辛是一种长期建立的免疫标签。这可以通过对 Dig 标签进行免疫染色来检测基因组 DNA 中的补骨脂素加合物，并通过常规免疫荧光¹⁷ 进行可视化。

在我们以前的工作中，该试剂被应用于使用基于DNA纤维的测定^法16分析与ICL的复制叉遭遇。在这项工作中，我们发现复制可以通过完整的ICL继续。这取决于ATR激酶，它被复制应激激活。考虑到 CMG 复制解旋酶的结构，复制重新启动是意外的。它由MCM异质六聚体（M）组成，其在模板链周围形成一个偏移间隙环，用于前导链合成，该链被GINS复合物（G，由PSF1，2，3和SLD5组成）和CDC45（C）¹⁸的蛋白质锁定。复制可以在回复体碰撞侧远端的ICL一侧重新开始的提议主张改变回复体的结构。为了解决在遇到ICL时哪些组件在回复中的问题，我们开发了此处描述的方法。我们利用 Dig 标签作为邻近连接测定 （PLA）¹⁹ 的合作伙伴来询问 ICL 与²⁰ 爬发体蛋白质的密切关联。

方案

1. 细胞制备

1. 第一天
   1. 用细胞粘合剂溶液预处理 35 mm 玻璃底培养皿。
   2. 在治疗前一天将细胞铺在预处理的培养皿中。细胞应在实验当天积极分裂和50-70%汇合。
      注意:HeLa细胞用于本实验，使用Dulbecco修饰的鹰培养基DMEM，补充有10%胎牛血清，1x青霉素/链霉素。对贴壁细胞系没有限制。然而，在PLA分析之前，必须将非贴壁细胞离心到载玻片上并固定。
2. 第二天
   1. 通过在 1:1 EtOH:H₂O 中重悬先前合成的 Dig-TMP 的冷冻等分试样来制备地高辛三甲基补骨脂素 （Dig-TMP） 的储备溶液。Dig-TMP的消光系数为25，000。每次使用前通过测量 250 nm 处的 OD 来验证浓度并计算原液浓度:Abs x 100 x 10⁶/25，000 = 浓度（单位为 μM）。通常，储备溶液约为 3 mM。该溶液可在–20°C下储存约一个月。
      注意:Dig-TMP必须按照此处描述的过程提前化学合成。将4'-氯甲基-4，5'，8-三甲基补骨脂素与4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺在甲苯中氮气下回流12小时。除去溶剂，用硅胶色谱法回收4'-[N-（13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷）]氨甲基-4，5'，8-三甲基补骨脂素产物。将产物与地高辛NHS酯在二甲基甲酰胺和三乙胺中的偶联在50°C下18小时。除去溶剂，通过制备薄层硅胶色谱法纯化残留物。洗脱产物带氯仿:甲醇:28%氢氧化铵（8∶1∶0.1）混合物。蒸发溶剂并将沉淀溶解在50%EtOH:H₂O中。
   2. 将50%EtOH:H₂O中的Dig-TMP储备液加入细胞培养基中，终浓度为5μM。 从板中吸出培养基，加入预热的含有Dig-TMP的培养基，并将板置于培养箱（37°C，5%CO₂）中30分钟以使Dig-TMP平衡。
   3. 当细胞孵育时，将UV盒（见 材料表）预热至37°C。
   4. 将板放在预热的UV盒中，并将细胞暴露在3J /^{cm 2} 的UVA光下5分钟以进行本实验。在照射期间，将板放置在保持在37°C的热块的顶部。使用以下公式计算时间:
      
   5. 使用移液管吸出培养基，加入新鲜的预热培养基，并将板放回培养箱中，温度为37°C，5%CO₂₁ 小时。
   6. 取出培养基，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻清洗餐具一次。
   7. 除去PBS，并在室温（RT）下在PBS中加入0.1%甲醛（FA）5分钟。这可以防止在提取细胞质元件和降低PLA背景所需的CSK-R（含有RNase的细胞骨架提取缓冲液，如1.2.9中所述）预处理期间细胞脱离。
   8. 吸出FA并用PBS洗碗一次。
   9. 加入CSK-R缓冲液并在室温下孵育5分钟以除去细胞质[CSK-R缓冲液:10mM PIPES，pH 7.0，100mM NaCl，300mM蔗糖，3mM MgCl₂，0.5%Triton X-100，300μg/ mL RNase A]。吸出缓冲液，加入新鲜的CSK-R，并在室温下孵育5分钟。
      注意:CSK缓冲液的库存可以储存在4°C，并在使用前添加Triton X和RNaseA。
   10. 用PBS清洗三次。
   11. 用4%甲醛在PBS中固定细胞在室温下10分钟。
   12. 用PBS清洗细胞。执行此步骤三次。
   13. 加入冷的100%甲醇，在-20°C孵育20分钟。
   14. 用PBS清洗细胞三次。此时，细胞可以在4°C的潮湿室中储存在PBS中长达一周。
   15. 将细胞在80μL的5mM TritonX-100中在4°C下孵育10分钟。
   16. 在补充有1μL 100 mg / mL RNase A的PBS中用100μL 5mM EDTA在37°C孵育细胞30分钟。
   17. 用PBS清洗细胞三次。
   18. 将细胞储存在封闭缓冲液（5%BSA和PBS中的10%山羊血清）中，在4°C的潮湿室中过夜。

2. 邻近连接试验

注意:在第3天进行邻近连接测定。

1. 抗体染色
   1. 每板制备 40 μL 一抗溶液:加入适量的一抗以获得所需的稀释度（小鼠抗地高辛和兔抗体针对重复体组分，如 MCM5、CDC45、PSF1 或 pMCM2， 材料表中指定的稀释度）到封闭缓冲液中（以达到 24 μL 的最终体积）。通过敲击混合，让它在室温下静置20分钟。 为多个样品准备预混液，并在应用于孔之前通过敲击混合。
   2. 向孔中心加入40μL一抗溶液，并在37°C下在潮湿的室中孵育1小时。 在染色过程中，让PLA探针和封闭缓冲液升温至室温。
   3. 在室温下用 PBS-T [PBS-T:0.05% 吐温-20 在 1X PBS 中] 洗涤细胞。 执行此步骤三次。
   4. 洗涤时，每培养皿准备 40 μL PLA 探针溶液（PLA 探针由识别兔或小鼠 IgG 的二抗组成，共价连接到正寡核苷酸或减寡核苷酸）:8 μL PLA 探针抗小鼠 + 8 μL PLA 探针抗兔减抗体 + 24 μL 封闭缓冲液。混合并在室温下静置20分钟。 为多个样品准备预混液并在施用孔之前充分混合。将溶液放在板中孔的中间。
   5. 除去最后一次洗涤，向孔中心加入40μLPLA探针溶液，并在37°C下在潮湿的室中孵育1小时。
   6. 在缓冲液A中洗涤三次，每次10分钟，在室温的倾斜平台上。在洗涤过程中，将连接混合物带到室温。
2. 连接和扩增
   1. 每板制备 40 μL 连接混合物:8 μL （5x） 连接原液 + 31 μL 蒸馏水 + 1 μL 连接酶。为多个板准备预混液，并在施用到孔之前充分混合。
   2. 向每个板中加入40μL连接溶液，并在37°C的潮湿室中孵育30分钟。
   3. 用缓冲液A洗涤细胞3次，每次2分钟，在室温的倾斜平台上。
   4. 每培养皿制备 40 μL 扩增溶液:8 μL （5x） 扩增原液 + 31.5 μL 蒸馏水 + 0.5 μL DNA 聚合酶。为多个样品准备预混液，并在施用孔之前充分混合。
   5. 向每个板中加入40μL扩增溶液，并在37°C的潮湿室中孵育100分钟。
   6. 吸出扩增溶液并用缓冲液B洗涤.在室温的倾斜平台上进行6次洗涤，每次10分钟。
   7. 在室温下用0.01x缓冲液B洗涤一次1分钟。
   8. 吸出缓冲液B并将板与二抗Alexa Fluor 488抗小鼠IgG和Alexa Fluor 568抗兔IgG在封闭溶液中以适当的稀释度在封闭溶液中孵育，在潮湿的室内，在37°C下30分钟或在4°C下过夜。
   9. 用PBS-T洗涤细胞三次，每次在室温的倾斜平台上洗涤10分钟。
   10. 吸出 PBS-T 并使用 DAPI 安装在安装介质中。安装的板可以立即成像或在成像前在4°C的黑暗中储存不超过4天。

3. 成像和定量

1. 在落射荧光或共聚焦显微镜中进行成像（如果需要3D成像，请在15个堆叠中覆盖至少3μm）。一式三份执行实验，并对足够数量的场进行成像，以便每个样本或条件至少进行 100 次观察。使用相同的曝光设置对所有场和样本（包括对照）进行成像。
2. 使用适当的图像分析软件进行量化（有关能够在单个或多个平面图像中执行此分析的开源和商业软件，请参阅 材料表 ）。
   1. 基于 DAPI 染色的分段细胞核。对核聚乳酸点进行检测。将PLA点分配给其相应的原子核。将每个原子核结果的PLA点导出为csv文件（参见补充 文件1 和 补充文件2）。
3. 统计分析（建议的开源和商业软件见 材料表 ）。
   1. 使用夏皮罗-威尔克检验验证样本是否服从正态分布。
   2. 使用 Student-t 检验（如果满足正态分布假设）或 Wilcoxon-秩和检验（如果违反样本的正态分布假设）确定两个样本之间是否存在显著差异。
4. 数据可视化:生成点图与箱线图相结合，以可视化不同样本的数据分布、中位数 （Q₂）、第 25^个 （Q₁） 和第 75^个 百分位数（有关建议的开源和商业软件，请参阅 材料表 ）。

4.3D pMCM2的显示:ICL相互作用

1. 使用Plan Fluor 60x/1.25数值孔径油物镜在转盘共聚焦显微镜上成像PLA板。采集 16 个覆盖 1.6 mm 的堆栈，并使用适当的图像分析软件生成 3D 重建（参见 材料表）。

结果

具有重复体蛋白的Dig-TMP的PLA
Dig-TMP的结构如图 1所示。合成的细节，其中三甲基补骨脂素通过乙二醇接头与地高辛结合，之前已经讨论过^17，21。将细胞与化合物孵育，然后暴露于365nm光（UVA）下，使化合物光活化并驱动交联反应。略多于 90% 的加合物是 ICL¹⁶。Dig标签可以通过免疫荧光可视化，从而揭示整个细胞核中ICL的存在（图2）。MCM2等爬生体蛋白的免疫荧光也表明在整个细胞核中的分布，这种分布不受ICL引入的影响。这些结果表明，反应蛋白的焦点外观，如对DSB的DNA损伤反应（DDR）所示，不是回复体的特征:ICL相互作用。

为了可视化图2所示实验中回复体与ICL的相互作用，我们应用了PLA，它报告了两种抗原的接近性（

讨论

尽管PLA是一种非常强大的技术，但为了获得清晰和可重复的结果，必须解决一些技术问题。抗体必须具有高亲和力和特异性。此外，尽可能减少非特异性背景信号也很重要。我们发现膜和细胞碎片有助于背景，我们已经尽可能地去除了它们。固定前用含有缓冲液的洗涤剂洗涤，固定后用甲醇洗涤有助于减少非特异性结合。需要注意的是，固定前的去垢剂处理会导致细胞脱离。我们发现，在CSK处理之前，用细胞粘合剂处理板并用0.1%FA作为前缀可以缓解这个问题。

在监测S相特异性事件时，识别非S期细胞也很有帮助。这可以通过用PCNA或NPAT^24，25等细胞周期标志物进行PLA染色来完成。这些标记物不仅证实了S相现象，而且还为非特异性相互作用提供了内部生物控制。在测量S期特有的事件的测定中，G1期细胞中的阳性信号表明需要额外的努力来减少非特异性相互作用。

单细胞成像策略具有其他监测分子相互作用的方法所不具备的优势。均质化技术，例如在免疫沉淀实验中使用的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 568，山羊抗兔 IgG （H+L） 交叉吸附二抗	Invitrogen	A-10011	1 合 1000
35 mm 板，带玻璃 1.5 盖玻片	MatTek	P35-1.5-14-C	玻璃底微孔培养皿 35 mm 培养皿微孔
Alexa Fluor 488，山羊抗小鼠 IgG （H+L） 交叉吸附二抗	Invitrogen	A-10001	1/1000
牛血清白蛋白 （BSA）	SeraCare	1900-0012	封闭液，试剂需在 4 °C 下储存;C
CDC45 抗体（兔子）	Abcam	ab126762	1 合 200
细胞胶粘剂	生命科学	354240	用于细胞-TAK 溶液
共聚焦显微镜	尼康	尼康 TE2000 转盘显微镜	配备 Volocity 软件
地高辛 （Dig） 抗体（小鼠）	Abcam	ab420	1 分 200
Dig-TMP	合成Seidman Lab
Duolink 扩增试剂（5 次;）	Sigma-Aldrich	DUO82010	试剂需要储存在 -20 &°;C
Duolink 原位检测试剂	Sigma-Aldrich	DUO92007	试剂需要储存在 -20 °C;C
Duolink 原位寡核苷酸 PLA 探针 MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	抗小鼠 MINUS，试剂需要储存在 4 °C;C
Duolink 原位寡核苷酸 PLA 探针 PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	抗兔 PLUS，试剂需要储存在 4 °C;C
Duolink 原位洗涤缓冲液 A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink 洗涤缓冲液，试剂需要储存在 4 °C;C
Duolink 原位洗涤缓冲液 B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink 洗涤缓冲液，试剂需要储存在 4 °C;C
落射荧光显微镜	蔡司	Axiovert 200M 显微镜	配备 Axio Vision 软件包（蔡司，德国）
醛 16%	Fisher Scientific	固定	液
山羊血清	Thermo	31873	封闭液，试剂需要储存在 4 °C;C
图像分析软件	开源	Cell profiler	用于分析单平面图像
需要图像分析软件许可证	Bitplane	Imaris	Cell Biology 模块。可以量化图像堆栈 （3D） 中的 PLA 点/细胞核并进行 3D 重建连接
酶 （1 unit/μl）	Sigma-Aldrich	DUO82029	试剂需要储存在 -20 °C;C
连接试剂（5 次;）	Sigma-Aldrich	DUO82009	试剂需要储存在 -20 &°;C
MCM2 抗体（兔）	Abcam	ab4461	1 合 200
MCM5 抗体（兔单克隆抗体）		Abcam Ab75975	1 合 1000
甲醇	实验室 ALLEY	A2076	在 -20°C 下预冷;C 使用前
phosphoMCM2S108 抗体 （兔子）	Abcam	ab109271	1 in 200
聚合酶 （10 unit/μl）	Sigma-Aldrich	DUO82030	试剂需要储存在 -20 °C;C
使用 DAPI 延长金封片剂	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 抗体（兔）Abcam		ab181112	1/200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	试剂需要储存在 4 &°;C
统计分析和数据可视化软件	开源	R studio	ggplot2 软件包，用于生成点图和箱形图
分析和数据可视化软件 需要许可证	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP（三恶沙灵）	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV 盒	Southern New England Ultraviolet		已停产。参见 Opsytec 紫外线测试室作为可能的替代品
紫外线测试室	Opsytec	紫外线测试室 BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	最终浓度为 1µ米