尽管复制叉与DNA加合物的碰撞可导致双链断裂，但关于复制体与阻断性损伤之间相互作用的研究仍较为有限。我们采用邻近连接实验来可视化这些相互作用，并表征其对复制体组成的影响。
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摘要
摘要
目前对双链断裂（DSBs）所引发的细胞反应已有相当深入的认识，这类断裂可由核酸酶、辐射及其他DNA断裂剂诱导产生。部分原因在于已有多种方法可用于鉴定断裂位点，并表征在这些位点募集至DSBs的各类因子。然而，在由不直接引起断裂且不在特定位点反应的化合物所形成的DNA加合物的加工过程中，DSBs也会作为中间产物出现。因此，对于大多数此类试剂而言，尚无技术可用于分析其与应答因子及修复蛋白之间的结合相互作用。例如，DNA链间交联（ICLs）在复制叉遭遇后可引发断裂。尽管这类交联由多种广泛用作抗癌化疗药物的化合物形成，但至今仍缺乏监测其与复制蛋白相互作用的有效方法。
本文中，我们描述了研究细胞对复制叉与这些难处理的加合物发生碰撞后所产生应答的策略。我们将一种类固醇抗原连接到补骨脂素上，该复合物可在活细胞核内形成依赖光激活的DNA链间交联（ICL）。通过针对抗原标签的免疫荧光技术可对ICL进行可视化检测。该抗原标签还可作为邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）中的一个配对分子，用于报告两种抗原之间的紧密关联。我们利用PLA区分出与标记的ICL紧密关联的蛋白质和未发生关联的蛋白质，从而能够确定在遭遇ICL后仍保留在复制体上的复制体蛋白，并鉴定出那些丢失的蛋白。该方法适用于任何可通过免疫学手段检测的结构或DNA加合物。
引言
由于一系列日益强大的方法能够将双链断裂定向至特定基因组位点，细胞对双链断裂的响应已被充分记录1,2,3。断裂位置的确定性使得研究人员能够明确鉴定在断裂位点富集并参与DNA损伤应答（DDR）的蛋白质及其他因子，从而推动非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）修复通路的研究。当然，许多断裂是由辐射和化学物质等非特异性作用于特定序列的因子所引发4。然而，对于此类断裂，已有方法可将其末端转化为适合标记和定位的结构5,6。此外，某些生物学过程（如免疫球蛋白重排）也会引入断裂，而最新的技术也允许对这些位点进行定位7。由此便可确定响应因子与这些断裂位点之间的关系。
断裂也可能作为非固有断裂剂但干扰DNA转录和复制等过程的化合物所形成的加合物的间接后果而出现。这些断裂可能是细胞对这些阻碍作出应答时的特征性产物，可能发生在修复过程中，或因其引发了一种易受核酸酶攻击的结构所致。通常情况下，加合物、断裂以及应答因子之间的物理关系是推断得出的。例如，DNA链间交联（ICLs）可由顺铂和丝裂霉素C等化疗药物形成8，也可由无碱基位点的反应产物形成9。ICLs是已知的强烈阻碍复制叉进程的因素10，从而导致复制叉停滞，并可能被核酸酶切割11。链间的共价连接通常通过必须经过断裂中间体的修复通路来解除12,13，因此需要同源重组来重建复制叉14。在大多数实验中，研究者追踪的是复制叉与ICL碰撞后下游产生的断裂所引发的相关因子的应答。然而，由于目前尚无技术能够精确定位引发性损伤，因此复制体及其组分与ICL之间的空间邻近性只能被假设。
我们开发了一种策略，用于分析蛋白质与非序列特异性共价加合物的相互作用，本文以交联剂（ICLs）为例进行说明。在本系统中，这些交联由补骨脂素（psoralen）引入，后者是一种光活性天然产物，数千年来已被用作皮肤疾病的治疗药物15。我们的方法基于补骨脂素的两个重要特性：第一，其形成交联的频率极高，交联产物可占所有加合物的90%以上，相比之下，顺铂或丝裂霉素C等常用化合物的交联率则不足10%8,16；第二，该化合物易于进行化学偶联修饰，且在此过程中仍能保持其交联能力。我们将三甲基补骨脂素共价连接至地高辛（Digoxigenin, Dig）——一种长期广泛应用的免疫标记分子。该设计使得基因组DNA中的补骨脂素加合物可通过Dig标签的免疫染色进行检测，并利用常规免疫荧光技术实现可视化17。
在我们之前的研究中，该试剂被用于通过基于DNA纤维的检测方法分析复制叉与ICL的相遇过程16。在该研究中，我们发现复制能够越过完整的ICL继续进行，这一过程依赖于ATR激酶，而ATR激酶可被复制应激激活。考虑到CMG复制解旋酶的结构，这种复制重启现象令人意外。CMG解旋酶由MCM异源六聚体（M）组成，该六聚体在前导链合成模板链周围形成一个错位的带缺口环状结构，并由GINS复合物（G，包含PSF1、2、3和SLD5）和CDC45（C）蛋白锁定18。有假说认为，复制可在复制体碰撞侧的ICL远端重新启动，这提示复制体结构可能发生改变。为探究在与ICL相遇时复制体中包含哪些组分，我们开发了此处描述的方法。我们利用Dig标签作为邻近连接实验（PLA）19中的配对分子，以检测ICL与复制体蛋白之间的紧密关联20。
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方案
1. 细胞制备
- 第1天
- 使用细胞粘附溶液预处理35 mm玻璃底培养皿。
- 在实验前一天将细胞接种至预处理过的培养皿中。实验当天，细胞应处于活跃分裂状态，融合度为50–70%。
注意：本实验使用HeLa细胞，培养基为添加10%胎牛血清和1×青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。对于贴壁细胞系无特殊限制。然而，悬浮细胞必须在PLA分析前经离心沉降到载玻片上并进行固定。
- 第2天
- 通过将先前合成并冷冻保存的Dig-TMP分装物溶于1:1的乙醇:H2O中，配制地高辛标记三甲基补骨脂素（Dig-TMP）储备液。取溶解后的Dig-TMP用H2O稀释100倍，测定250 nm处的光密度（OD），以确定其浓度。Dig-TMP的消光系数为25,000。每次使用前均需在250 nm处测定OD值，并按以下公式计算储备液浓度：Abs × 100 × 106/25,000 = 浓度（单位：µM）。通常储备液浓度约为3 mM。该溶液可在–20 °C保存约一个月。
注意：Dig-TMP需提前化学合成，具体步骤如下：在氮气保护下，将4'-氯甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素与4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺在甲苯中回流反应12小时。除去溶剂后，通过硅胶柱层析回收产物4'-[N-(13-氨基-4,7,10-三氧代十三烷)]氨甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素。将该产物与地高辛-NHS酯在二甲基甲酰胺和三乙胺中于50 °C反应18小时进行偶联。除去溶剂后，采用制备型薄层硅胶层析纯化残余物，以氯仿:甲醇:28%氢氧化铵（8:1:0.1）混合液洗脱目标条带。蒸发溶剂后，将沉淀物溶解于50% EtOH:H2O中。 - 将Dig-TMP储备液以50% EtOH:H2O稀释后加入细胞培养基中，终浓度为5 µM。将培养基预热至37 °C。吸除原培养基，加入预温的含Dig-TMP培养基，将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟，使Dig-TMP充分平衡分布。
- 在细胞孵育期间，将紫外照射箱（见材料表）预热至37 °C。
- 将培养皿放入预热的紫外照射箱中，本实验中以3 J/cm2的UVA剂量照射5分钟。照射过程中，培养皿置于维持在37 °C的加热金属块上。照射时间可通过以下公式计算：
- 用移液器吸除培养基，加入新鲜预温的培养基，将培养皿放回37 °C、5% CO2培养箱中继续孵育1小时。
- 移除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤一次。
- 吸除PBS，加入含0.1%甲醛（FA）的PBS，在室温（RT）固定5分钟。此步骤可防止细胞在后续CSK-R缓冲液（含RNase的细胞骨架提取缓冲液，见步骤1.2.9）预处理过程中脱落，该处理用于去除细胞质成分并降低PLA背景信号。
- 吸除FA，用PBS洗涤一次。
- 加入CSK-R缓冲液，在室温孵育5分钟以去除细胞质 [CSK-R缓冲液：10 mM PIPES，pH 7.0，100 mM NaCl，300 mM蔗糖，3 mM MgCl2，0.5% Triton X-100，300 µg/mL RNase A]。吸除缓冲液，加入新鲜CSK-R缓冲液，再次在室温孵育5分钟。
注意：CSK缓冲液储备液可于4 °C保存，使用前现加Triton X和RNase A。 - 用PBS洗涤三次。
- 用含4%甲醛的PBS在室温固定细胞10分钟。
- 用PBS洗涤细胞，重复三次。
- 加入冷的100%甲醇，在-20 °C孵育20分钟。
- 用PBS洗涤细胞三次。此时细胞可在4 °C湿盒中以PBS保存最多一周。
- 在4 °C下用80 µL 5 mM TritonX-100孵育细胞10分钟。
- 在37 °C下用100 µL含1 µL 100 mg/mL RNase A的5 mM EDTA PBS溶液孵育细胞30分钟。
- 用PBS洗涤细胞三次。
- 将细胞置于封闭缓冲液（含5% BSA和10%山羊血清的PBS）中，在4 °C湿盒中过夜孵育。
- 通过将先前合成并冷冻保存的Dig-TMP分装物溶于1:1的乙醇:H2O中，配制地高辛标记三甲基补骨脂素（Dig-TMP）储备液。取溶解后的Dig-TMP用H2O稀释100倍，测定250 nm处的光密度（OD），以确定其浓度。Dig-TMP的消光系数为25,000。每次使用前均需在250 nm处测定OD值，并按以下公式计算储备液浓度：Abs × 100 × 106/25,000 = 浓度（单位：µM）。通常储备液浓度约为3 mM。该溶液可在–20 °C保存约一个月。
2. 邻近连接实验
注意：在第3天进行邻近连接实验。
- 抗体染色
- 每孔准备 40 μL 一抗溶液：将适量的一抗加入封闭缓冲液中，以达到所需的稀释倍数（使用小鼠抗地高辛抗体和兔抗复制体组分抗体，如 MCM5、CDC45、PSF1 或 pMCM2，具体稀释比例见材料表），最终体积为 24 μL。轻轻敲击混匀，室温静置 20 分钟。若处理多个样本，可配制总混合液，使用前轻轻敲击混匀后再加入各孔。
- 向孔中央加入 40 μL 一抗溶液，在湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。染色期间，将 PLA 探针和封闭缓冲液恢复至室温。
- 在室温下用 PBS-T [PBS-T：含 0.05% Tween-20 的 1× PBS] 洗涤细胞，重复此步骤三次。
- 洗涤的同时，为每孔准备 40 μL PLA 探针溶液（PLA 探针为识别兔或鼠 IgG 的二抗，分别共价连接 PLUS 或 MINUS 寡核苷酸）：8 μL PLA 探针抗鼠-PLUS + 8 μL PLA 探针抗兔-MINUS 抗体 + 24 μL 封闭缓冲液。混匀后室温静置 20 分钟。若处理多个样本，可配制总混合液，使用前充分混匀，并将溶液加至孔中央。
- 吸除最后一次洗涤液，向孔中央加入 40 μL PLA 探针溶液，在湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。
- 在室温下于倾斜摇床上用缓冲液 A 洗涤三次，每次 10 分钟。洗涤期间，将连接反应混合液恢复至室温。
- 连接与扩增
- 每孔准备 40 μL 连接反应混合液：8 μL（5×）连接反应原液 + 31 μL 去离子水 + 1 μL 连接酶。若处理多个孔，可配制总混合液，使用前充分混匀后再加入各孔。
- 向每孔加入 40 μL 连接反应液，在湿盒中 37 °C 孵育 30 分钟。
- 在室温下于倾斜摇床上用缓冲液 A 洗涤细胞三次，每次 2 分钟。
- 为每孔准备 40 μL 扩增反应溶液：8 μL（5×）扩增反应原液 + 31.5 μL 去离子水 + 0.5 μL DNA 聚合酶。若处理多个样本，可配制总混合液，使用前充分混匀后再加入各孔。
- 向每孔加入 40 μL 扩增反应液，在湿盒中 37 °C 孵育 100 分钟。
- 吸除扩增反应液，用缓冲液 B 洗涤。在室温下于倾斜摇床上洗涤 6 次，每次 10 分钟。
- 用 0.01× 缓冲液 B 在室温下洗涤一次，持续 1 分钟。
- 吸除缓冲液 B，将孔板在湿盒中与二抗（Alexa Fluor 488 标记抗鼠 IgG 和 Alexa Fluor 568 标记抗兔 IgG）在封闭缓冲液中按适当稀释比例孵育，37 °C 孵育 30 分钟，或 4 °C 过夜。
- 在室温下于倾斜摇床上用 PBS-T 洗涤细胞三次，每次 10 分钟。
- 吸除 PBS-T，用含 DAPI 的封片剂封片。封片后的样品可立即成像，或在避光条件下于 4 °C 保存不超过 4 天后成像。
3. 成像与定量
- 在落射荧光显微镜或共聚焦显微镜下进行成像（若需三维成像，至少覆盖 3 µm 在15个堆栈中进行实验，每个实验重复三次，并对足够数量的视野进行成像，以确保每个样本或条件至少获得100次观测。对所有视野和样本（包括对照）均使用相同的曝光设置进行成像。
- 使用合适的图像分析软件进行定量分析（参见 材料表 用于能够对单平面或多平面图像执行此分析的开源和商业软件）。
- 基于DAPI染色对细胞核进行分割。检测细胞核内的PLA信号点。将PLA信号点分配至其对应的细胞核。将每个细胞核的PLA信号点结果导出为csv文件（参见 补充文件 1 和 补充文件 2).
- 统计分析（参见 材料表 有关推荐的开源和商业软件）。
- 使用Shapiro-Wilk检验验证样本是否符合正态分布。
- 使用学生t检验（若满足正态分布假设）或Wilcoxon秩和检验（若某一样本不满足正态分布假设）判断两个样本之间是否存在显著性差异。
- 数据可视化：生成点图与箱线图结合的图形，以展示数据分布、中位数（Q2), 25th (Q1）和 75th 不同样本的百分位数（参见 材料表 （有关推荐的开源和商业软件）。
4. pMCM2：ICL 相互作用的三维展示
- 使用 Plan Fluor 60x/1.25 数值孔径油镜，在转盘共聚焦显微镜上对 PLA 平板进行成像。采集覆盖 1.6 mm 的 16 个焦平面堆栈，并使用相应的图像分析软件生成 3D 重建图像（参见材料表）。
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结果
Dig-TMP 与复制体蛋白的邻近连接实验（PLA）
Dig-TMP 的结构如图1所示。其合成细节此前已有报道17,21，其中三甲基补骨脂素通过乙二醇连接子与地高辛配基相连。将细胞与该化合物孵育后，经365 nm（UVA）光照可激活该化合物，从而引发交联反应。所形成的加合物中，略高于90%为DNA链间交联（ICLs）16。通过免疫荧光可检测Dig标签，显示ICL在整个细胞核中的分布（图2）。对复制体蛋白（如MCM2）进行免疫荧光染色同样显示其在细胞核内广泛分布，且该分布模式在引入ICL后未发生改变。这些结果表明，响应蛋白（如DNA损伤应答（DDR）中对双链断裂（DSB）的响应蛋白）所呈现的焦点样聚集现象，并非复制体与ICL相互作用的特征。
为了在图2所示实验中...
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讨论
尽管 PLA 是一种非常强大的技术，但为了获得清晰且可重复的结果，必须解决一些技术问题。抗体必须具有高亲和力和高特异性。此外，尽可能降低非特异性背景信号非常重要。我们发现膜成分和细胞碎片会增加背景信号，因此已尽可能将其去除。固定前使用含去污剂的缓冲液进行洗涤，以及固定后用甲醇洗涤，有助于减少非特异性结合。需要注意的是，固定前使用去污剂处理可能导致细胞脱落。我们发现，在 CSK 处理前，先用细胞黏附剂处理培养板，并用 0.1% 甲醛进行预固定，可缓解这一问题。
在监测S期特异性事件时，识别非S期细胞也十分有帮助。这可以通过在PLA染色后使用细胞周期标志物（如PCNA或NPAT24,25）进行标记来实现。这些标志物不仅能够确认S期相关现象，还可为非特异性相互作用提供内在的生物学对照。在G1期细胞中出现阳性信号，提示在检测应仅限于S期发生的事件时，需要进一步努力以减少非特异性相互作用。
单细胞成像策略在监测分子相互作...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了美国国立卫生研究院国家衰老研究所院内研究计划（Z01-AG000746–08）的资助。J.H. 得到了中国国家自然科学基金（21708007 和 31871365）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG (H+L) 交叉吸附二抗 | Invitrogen | A-10011 | 1:1000 |
| 35 mm 玻璃底培养皿（1.5 盖玻片） | MatTek | P35-1.5-14-C | 玻璃底微量培养皿，35 mm 培养皿 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗 | Invitrogen | A-10001 | 1:1000 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | 封闭液，试剂需在 4 °C 下保存 |
| CDC45 抗体（兔源） | Abcam | ab126762 | 1:200 |
| 细胞黏附剂 | Life Science | 354240 | 用于 Cell-TAK 溶液 |
| 共聚焦显微镜 | Nikkon | Nikon TE2000 转盘显微镜 | 配备 Volocity 软件 |
| 地高辛 (Dig) 抗体（鼠源） | Abcam | ab420 | 1:200 |
| Dig-TMP | Seidman 实验室合成 | ||
| Duolink 扩增试剂 (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | 试剂需在 -20 °C 下保存 |
| Duolink 原位检测试剂 | Sigma-Aldrich | DUO92007 | 试剂需在 -20 °C 下保存 |
| Duolink 原位寡核苷酸 PLA 探针 MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | 抗小鼠 MINUS，试剂需在 4 °C 下保存 |
| Duolink 原位寡核苷酸 PLA 探针 PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | 抗兔 PLUS，试剂需在 4 °C 下保存 |
| Duolink 原位洗涤缓冲液 A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink 洗涤缓冲液，试剂需在 4 °C 下保存 |
| Duolink 原位洗涤缓冲液 B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink 洗涤缓冲液，试剂需在 4 °C 下保存 |
| 落射荧光显微镜 | Zeiss | Axiovert 200M 显微镜 | 配备 Axio Vision 软件包（Zeiss，德国） |
| 16% 甲醛 | Fisher Scientific | PI28906 | 用于固定液 |
| 山羊血清 | Thermo | 31873 | 封闭液，试剂需在 4 °C 下保存 |
| 图像分析软件 | 开源 | Cell Profiler | 适用于单平面图像分析 |
| 图像分析软件（需许可证） | Bitplane | Imaris | 需细胞生物学模块。可对图像堆栈（3D）中的 PLA 点/细胞核进行定量，并进行 3D 重建 |
| 连接酶（1 单位/μl） | Sigma-Aldrich | DUO82029 | 试剂需在 -20 °C 下保存 |
| 连接反应试剂（5×） | Sigma-Aldrich | DUO82009 | 试剂需在 -20 °C 下保存 |
| MCM2 抗体（兔源） | Abcam | ab4461 | 1:200 |
| MCM5 抗体（兔单克隆） | Abcam | Ab75975 | 1:1000 |
| 甲醇 | Lab ALLEY | A2076 | 使用前预冷至 -20°C |
| 磷酸化 MCM2S108 抗体（兔源） | Abcam | ab109271 | 1:200 |
| 聚合酶（10 单位/μl） | Sigma-Aldrich | DUO82030 | 试剂需在 -20 °C 下保存 |
| 含 DAPI 的 Prolong Gold 封片剂 | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 抗体（兔源） | Abcam | ab181112 | 1:200 |
| RNase A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | 试剂需在 4 °C 下保存 |
| 统计分析与数据可视化软件 | 开源 | R Studio | 使用 ggplot2 包生成点图和箱线图 |
| 统计分析与数据可视化软件（需许可证） | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP（三氧杂蒽） | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| 吐温 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| 紫外照射箱 | Southern New England Ultraviolet | 已停产。可考虑使用 Opsytec 紫外测试舱作为替代 | |
| 紫外测试舱 | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | 终浓度为 1µM |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 1/09/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.
The Authors section was updated from:
Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally
to:
Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally
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