方法文章

与抗原标记阻断病变的复制体遭遇的可视化

DOI：

10.3791/61689

⸱

2021年7月27日

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1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine

* These authors contributed equally

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摘要

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虽然与DNA加合物的复制叉碰撞可以诱导双链断裂，但对爬酶体和阻断病变之间的相互作用知之甚少。我们采用邻近连接测定来可视化这些遭遇并表征对重复体组成的影响。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对由核酸酶、辐射和其他 DNA 破坏者诱导的双链断裂 （DSB） 的细胞反应存在相当多的见解。这在一定程度上反映了识别断裂位点的方法的可用性，以及这些序列中招募到DSB的因素的特征。然而，DSB在加工由不直接引起断裂且不在特定序列位点反应的化合物形成的DNA加合物的过程中也作为中间体出现。因此，对于大多数这些药物，允许分析与反应因子和修复蛋白的结合相互作用的技术是未知的。例如，DNA链间交联（ICL）可以在复制叉遭遇后引起断裂。虽然由被广泛用作癌症化疗药物的药物形成，但没有监测它们与复制蛋白相互作用的方法。

在这里，我们描述了我们用这些具有挑战性的加合物跟踪细胞对叉子碰撞的反应的策略。我们将类固醇抗原与补骨脂素联系起来，补骨脂素在活细胞核中形成光活化依赖性ICL。通过针对抗原标签的免疫荧光观察ICL。该标签也可以是邻近连接测定（PLA）的合作伙伴，该测定报告两种抗原的密切关联。PLA被用来区分与标记的ICL密切相关的蛋白质和不与标记ICL密切相关的蛋白质。可以定义在遇到ICL后保留的复制体蛋白质，并识别其他丢失的蛋白质。这种方法适用于任何可以通过免疫学检测的结构或DNA加合物。

引言

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细胞对双链断裂的反应有据可查，因为一系列越来越强大的方法将断裂引导到特定的基因组位点1，2，3。位置的确定性能够明确表征在位点积累并参与DNA损伤反应（DDR）的蛋白质和其他因子，从而驱动修复断裂的非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）途径。当然，许多中断是由不攻击特定序列的辐射和化学物质等因素引入的4.但是，对于这些，有一些程序可以将末端转换为适合标记和本地化的结构5，6。生物过程也引入了断裂，例如免疫球蛋白重排，最近的技术允许它们的定位，以及7。然后可以确定响应因素与这些站点之间的关系。

断裂也作为由化合物形成的加合物的间接结果出现，这些化合物不是固有的破坏者，而是破坏DNA交易，如转录和复制。它们可能是细胞对这些障碍物的反应的一个特征，可能是在修复过程中，或者因为它们引发了易受核酸酶攻击的结构。通常，加合物、断裂以及与响应因子的关联之间的物理关系是推断性的。例如，ICL由顺铂和丝裂霉素C8等化疗药物形成，并作为非碱性位点<....

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方案

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1. 细胞制备

  1. 第一天
    1. 用细胞粘合剂溶液预处理 35 mm 玻璃底培养皿。
    2. 在治疗前一天将细胞铺在预处理的培养皿中。细胞应在实验当天积极分裂和50-70%汇合。
      注意:HeLa细胞用于本实验，使用Dulbecco修饰的鹰培养基DMEM，补充有10%胎牛血清，1x青霉素/链霉素。对贴壁细胞系没有限制。然而，在PLA分析之前，必须将非贴壁细胞离心到载玻片上并固定。
  2. 第二天
    1. 通过在 1:1 EtOH:H2O 中重悬先前合成的 Dig-TMP 的冷冻等分试样来制备地高辛三甲基补骨脂素 （Dig-TMP） 的储备溶液。Dig-TMP的消光系数为25，000。每次使用前通过测量 250 nm 处的 OD 来验证浓度并计算原液浓度:Abs x 100 x 106/25，000 = 浓度（单位为 μM）。通常，储备溶液约为 3 mM。该溶液可在–20°C下储存约一个月。
      注意:Dig-TMP必须按照此处描述的过程提前化学合成。将4'-氯甲基-4，5'，8-三甲基补骨脂素与4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺在甲苯中氮气下回流12小时。除去溶剂，用硅胶色谱法回收4'-[N-（13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷）]氨甲基-4，5'，8-三甲基补骨脂素产物。将产物与地高辛NHS酯在二甲基甲酰胺和三乙胺中的偶联在50°C下18小时。除去溶剂，通过制备薄层硅....

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结果

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具有重复体蛋白的Dig-TMP的PLA
Dig-TMP的结构如图 1所示。合成的细节，其中三甲基补骨脂素通过乙二醇接头与地高辛结合，之前已经讨论过17，21。将细胞与化合物孵育，然后暴露于365nm光（UVA）下，使化合物光活化并驱动交联反应。略多于 90% 的加合物是 ICL16。Dig标签可以通过免疫荧光可视化，从而揭示整个细胞核中ICL的存在（图2）。MCM2等爬生体蛋白的免疫荧光也表明在整个细胞核中的分布，这种分布不受ICL引入的影响。这些结果表明，反应蛋白的焦点外观，如对DSB的DNA损伤反应（DDR）所示，不是回复体的特征:ICL相互作用。

为了可视化图2所示实验中回复体与ICL的相互作用，我们应用了PLA，它报告了两种抗原的接近性（

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讨论

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尽管PLA是一种非常强大的技术，但为了获得清晰和可重复的结果，必须解决一些技术问题。抗体必须具有高亲和力和特异性。此外，尽可能减少非特异性背景信号也很重要。我们发现膜和细胞碎片有助于背景，我们已经尽可能地去除了它们。固定前用含有缓冲液的洗涤剂洗涤，固定后用甲醇洗涤有助于减少非特异性结合。需要注意的是，固定前的去垢剂处理会导致细胞脱离。我们发现，在CSK处理之前，用细胞粘合剂处理板并用0.1%FA作为前缀可以缓解这个问题。

在监测S相特异性事件时，识别非S期细胞也很有帮助。这可以通过用PCNA或NPAT24，25等细胞周期标志物进行PLA染色来完成。这些标记物不仅证实了S相现象，而且还为非特异性相互作用提供了内部生物控制。在测量S期特有的事件的测定中，G1期细胞中的阳性信号表明需要额外的努力来减少非特异性相互作用。

单细胞成像策略具有其他监测分子相互作用的方法所不具备的优势。均质化技术，例如在免疫沉淀实验中使用的.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到了美国国家老龄化研究所NIH校内研究计划（Z01-AG000746-08）的部分支持。J.H.得到了中国国家自然科学基金（21708007和31871365）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 568，山羊抗兔 IgG （H+L） 交叉吸附二抗InvitrogenA-100111 合 1000
35 mm 板，带玻璃 1.5 盖玻片MatTekP35-1.5-14-C玻璃底微孔培养皿 35 mm 培养皿微孔
Alexa Fluor 488，山羊抗小鼠 IgG （H+L） 交叉吸附二抗InvitrogenA-100011/1000
牛血清白蛋白 （BSA）SeraCare1900-0012封闭液，试剂需在 4 °C 下储存;C
CDC45 抗体（兔子）Abcamab1267621 合 200
细胞胶粘剂生命科学354240用于细胞-TAK 溶液
共聚焦显微镜尼康尼康 TE2000 转盘显微镜配备 Volocity 软件
地高辛 （Dig） 抗体（小鼠）Abcamab4201 分 200
Dig-TMP合成Seidman Lab
Duolink 扩增试剂（5 次;）Sigma-AldrichDUO82010试剂需要储存在 -20 &°;C
Duolink 原位检测试剂Sigma-AldrichDUO92007试剂需要储存在 -20 °C;C
Duolink 原位寡核苷酸 PLA 探针 MINUSSigma-AldrichDUO92004抗小鼠 MINUS，试剂需要储存在 4 °C;C
Duolink 原位寡核苷酸 PLA 探针 PLUSSigma-AldrichDUO92002抗兔 PLUS，试剂需要储存在 4 °C;C
Duolink 原位洗涤缓冲液 ASigma-AldrichDUO82046Duolink 洗涤缓冲液，试剂需要储存在 4 °C;C
Duolink 原位洗涤缓冲液 BSigma-AldrichDUO82048Duolink 洗涤缓冲液，试剂需要储存在 4 °C;C
落射荧光显微镜蔡司Axiovert 200M 显微镜配备 Axio Vision 软件包（蔡司，德国）
醛 16%Fisher Scientific固定液
山羊血清Thermo31873封闭液，试剂需要储存在 4 °C;C
图像分析软件开源Cell profiler用于分析单平面图像
需要图像分析软件许可证BitplaneImarisCell Biology 模块。可以量化图像堆栈 （3D） 中的 PLA 点/细胞核并进行 3D 重建连接
酶 （1 unit/μl）Sigma-AldrichDUO82029试剂需要储存在 -20 °C;C
连接试剂（5 次;）Sigma-AldrichDUO82009试剂需要储存在 -20 &°;C
MCM2 抗体（兔）Abcamab44611 合 200
MCM5 抗体（兔单克隆抗体）Abcam Ab759751 合 1000
甲醇实验室 ALLEYA2076在 -20°C 下预冷;C 使用前
phosphoMCM2S108 抗体 （兔子）Abcamab1092711 in 200
聚合酶 （10 unit/μl）Sigma-AldrichDUO82030试剂需要储存在 -20 °C;C
使用 DAPI 延长金封片剂ThermoFisher ScientificP36935
PSF1 抗体（兔）Abcamab1811121/200
RNAse A 100 mg/mlQiagen19101试剂需要储存在 4 &°;C
统计分析和数据可视化软件开源R studioggplot2 软件包，用于生成点图和箱形图
分析和数据可视化软件 需要许可证Systat SoftwareSigmaplot V13
TMP（三恶沙灵）Sigma-AldrichT6137_1G
TritonX-100Sigma-AldrichT8787_250ML
Tween 20Sigma-AldrichP9416_100ML
UV 盒Southern New England Ultraviolet已停产。参见 Opsytec 紫外线测试室作为可能的替代品
紫外线测试室Opsytec紫外线测试室 BS-04
VE-821SelleckchemS8007最终浓度为 1µ米
甲PI28906 需要 统计

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al.

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勘误

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 1/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

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