可视化复制体与抗原标记阻断损伤位点的相互作用

摘要

尽管复制叉与DNA加合物的碰撞可导致双链断裂，但关于复制体与阻断性损伤之间相互作用的研究仍较为有限。我们采用邻近连接实验来可视化这些相互作用，并表征其对复制体组成的影响。

摘要

目前对双链断裂（DSBs）所引发的细胞反应已有相当深入的认识，这类断裂可由核酸酶、辐射及其他DNA断裂剂诱导产生。部分原因在于已有多种方法可用于鉴定断裂位点，并表征在这些位点募集至DSBs的各类因子。然而，在由不直接引起断裂且不在特定位点反应的化合物所形成的DNA加合物的加工过程中，DSBs也会作为中间产物出现。因此，对于大多数此类试剂而言，尚无技术可用于分析其与应答因子及修复蛋白之间的结合相互作用。例如，DNA链间交联（ICLs）在复制叉遭遇后可引发断裂。尽管这类交联由多种广泛用作抗癌化疗药物的化合物形成，但至今仍缺乏监测其与复制蛋白相互作用的有效方法。

本文中，我们描述了研究细胞对复制叉与这些难处理的加合物发生碰撞后所产生应答的策略。我们将一种类固醇抗原连接到补骨脂素上，该复合物可在活细胞核内形成依赖光激活的DNA链间交联（ICL）。通过针对抗原标签的免疫荧光技术可对ICL进行可视化检测。该抗原标签还可作为邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）中的一个配对分子，用于报告两种抗原之间的紧密关联。我们利用PLA区分出与标记的ICL紧密关联的蛋白质和未发生关联的蛋白质，从而能够确定在遭遇ICL后仍保留在复制体上的复制体蛋白，并鉴定出那些丢失的蛋白。该方法适用于任何可通过免疫学手段检测的结构或DNA加合物。

引言

由于一系列日益强大的方法能够将双链断裂定向至特定基因组位点，细胞对双链断裂的响应已被充分记录^1,2,3。断裂位置的确定性使得研究人员能够明确鉴定在断裂位点富集并参与DNA损伤应答（DDR）的蛋白质及其他因子，从而推动非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）修复通路的研究。当然，许多断裂是由辐射和化学物质等非特异性作用于特定序列的因子所引发⁴。然而，对于此类断裂，已有方法可将其末端转化为适合标记和定位的结构^5,6。此外，某些生物学过程（如免疫球蛋白重排）也会引入断裂，而最新的技术也允许对这些位点进行定位⁷。由此便可确定响应因子与这些断裂位点之间的关系。

断裂也可能作为非固有断裂剂但干扰DNA转录和复制等过程的化合物所形成的加合物的间接后果而出现。这些断裂可能是细胞对这些阻碍作出应答时的特征性产物，可能发生在修复过程中，或因其引发了一种易受核酸酶攻击的结构所致。通常情况下，加合物、断裂以及应答因子之间的物理关系是推断得出的。例如，DNA链间交联（ICLs）可由顺铂和丝裂霉素C等化疗....

方案

1. 细胞制备

1. 第1天
   1. 使用细胞粘附溶液预处理35 mm玻璃底培养皿。
   2. 在实验前一天将细胞接种至预处理过的培养皿中。实验当天，细胞应处于活跃分裂状态，融合度为50–70%。
      注意：本实验使用HeLa细胞，培养基为添加10%胎牛血清和1×青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。对于贴壁细胞系无特殊限制。然而，悬浮细胞必须在PLA分析前经离心沉降到载玻片上并进行固定。
2. 第2天
   1. 通过将先前合成并冷冻保存的Dig-TMP分装物溶于1:1的乙醇:H₂O中，配制地高辛标记三甲基补骨脂素（Dig-TMP）储备液。取溶解后的Dig-TMP用H₂O稀释100倍，测定250 nm处的光密度（OD），以确定其浓度。Dig-TMP的消光系数为25,000。每次使用前均需在250 nm处测定OD值，并按以下公式计算储备液浓度：Abs × 100 × 10⁶/25,000 = 浓度（单位：µM）。通常储备液浓度约为3 mM。该溶液可在–20 °C保存约一个月。
      注意：Dig-TMP需提前化学合成，具体步骤如下：在氮气保护下，将4'-氯甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素与4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺在甲苯中回流反应12小时。除去溶剂后，通过硅胶柱层析回收产物4'-[N-(13-氨基-4,7,10....

结果

Dig-TMP 与复制体蛋白的邻近连接实验（PLA）
Dig-TMP 的结构如图1所示。其合成细节此前已有报道^17,21，其中三甲基补骨脂素通过乙二醇连接子与地高辛配基相连。将细胞与该化合物孵育后，经365 nm（UVA）光照可激活该化合物，从而引发交联反应。所形成的加合物中，略高于90%为DNA链间交联（ICLs）¹⁶。通过免疫荧光可检测Dig标签，显示ICL在整个细胞核中的分布（图2）。对复制体蛋白（如MCM2）进行免疫荧光染色同样显示其在细胞核内广泛分布，且该分布模式在引入ICL后未发生改变。这些结果表明，响应蛋白（如DNA损伤应答（DDR）中对双链断裂（DSB）的响应蛋白）所呈现的焦点样聚集现象，并非复制体与ICL相互作用的特征。

为了在图2所示实验中.......

讨论

尽管 PLA 是一种非常强大的技术，但为了获得清晰且可重复的结果，必须解决一些技术问题。抗体必须具有高亲和力和高特异性。此外，尽可能降低非特异性背景信号非常重要。我们发现膜成分和细胞碎片会增加背景信号，因此已尽可能将其去除。固定前使用含去污剂的缓冲液进行洗涤，以及固定后用甲醇洗涤，有助于减少非特异性结合。需要注意的是，固定前使用去污剂处理可能导致细胞脱落。我们发现，在 CSK 处理前，先用细胞黏附剂处理培养板，并用 0.1% 甲醛进行预固定，可缓解这一问题。

在监测S期特异性事件时，识别非S期细胞也十分有帮助。这可以通过在PLA染色后使用细胞周期标志物（如PCNA或NPAT^24,25）进行标记来实现。这些标志物不仅能够确认S期相关现象，还可为非特异性相互作用提供内在的生物学对照。在G1期细胞中出现阳性信号，提示在检测应仅限于S期发生的事件时，需要进一步努力以减少非特异性相互作用。

单细胞成像策略在监测分子相互作.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG (H+L) 交叉吸附二抗	Invitrogen	A-10011	1:1000
35 mm 玻璃底培养皿（1.5 盖玻片）	MatTek	P35-1.5-14-C	玻璃底微量培养皿，35 mm 培养皿
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗	Invitrogen	A-10001	1:1000
牛血清白蛋白 (BSA)	SeraCare	1900-0012	封闭液，试剂需在 4 °C 下保存
CDC45 抗体（兔源）	Abcam	ab126762	1:200
细胞黏附剂	Life Science	354240	用于 Cell-TAK 溶液
共聚焦显微镜	Nikkon	Nikon TE2000 转盘显微镜	配备 Volocity 软件
地高辛 (Dig) 抗体（鼠源）	Abcam	ab420	1:200
Dig-TMP	Seidman 实验室合成
Duolink 扩增试剂 (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82010	试剂需在 -20 °C 下保存
Duolink 原位检测试剂	Sigma-Aldrich	DUO92007	试剂需在 -20 °C 下保存
Duolink 原位寡核苷酸 PLA 探针 MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	抗小鼠 MINUS，试剂需在 4 °C 下保存
Duolink 原位寡核苷酸 PLA 探针 PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	抗兔 PLUS，试剂需在 4 °C 下保存
Duolink 原位洗涤缓冲液 A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink 洗涤缓冲液，试剂需在 4 °C 下保存
Duolink 原位洗涤缓冲液 B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink 洗涤缓冲液，试剂需在 4 °C 下保存
落射荧光显微镜	Zeiss	Axiovert 200M 显微镜	配备 Axio Vision 软件包（Zeiss，德国）
16% 甲醛	Fisher Scientific	PI28906	用于固定液
山羊血清	Thermo	31873	封闭液，试剂需在 4 °C 下保存
图像分析软件	开源	Cell Profiler	适用于单平面图像分析
图像分析软件（需许可证）	Bitplane	Imaris	需细胞生物学模块。可对图像堆栈（3D）中的 PLA 点/细胞核进行定量，并进行 3D 重建
连接酶（1 单位/μl）	Sigma-Aldrich	DUO82029	试剂需在 -20 °C 下保存
连接反应试剂（5×）	Sigma-Aldrich	DUO82009	试剂需在 -20 °C 下保存
MCM2 抗体（兔源）	Abcam	ab4461	1:200
MCM5 抗体（兔单克隆）	Abcam	Ab75975	1:1000
甲醇	Lab ALLEY	A2076	使用前预冷至 -20°C
磷酸化 MCM2S108 抗体（兔源）	Abcam	ab109271	1:200
聚合酶（10 单位/μl）	Sigma-Aldrich	DUO82030	试剂需在 -20 °C 下保存
含 DAPI 的 Prolong Gold 封片剂	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 抗体（兔源）	Abcam	ab181112	1:200
RNase A 100 mg/ml	Qiagen	19101	试剂需在 4 °C 下保存
统计分析与数据可视化软件	开源	R Studio	使用 ggplot2 包生成点图和箱线图
统计分析与数据可视化软件（需许可证）	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP（三氧杂蒽）	Sigma-Aldrich	T6137_1G
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
吐温 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
紫外照射箱	Southern New England Ultraviolet		已停产。可考虑使用 Opsytec 紫外测试舱作为替代
紫外测试舱	Opsytec	UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	终浓度为 1µM