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一种高效的腺病毒制备方法

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DOI：

10.3791/61691

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2021年6月10日

 ,  ,  , 
1Institute of Cellular Biology and Pathology "Nicolae Simionescu"

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用pAdEasy系统制备腺病毒的实验方案。该技术包括pAdTrack与pAdEasy-1质粒的重组、腺病毒的包装与扩增、从细胞裂解物和培养基中纯化腺病毒颗粒、病毒滴度测定以及腺病毒的功能验证。

摘要

腺病毒转导具有在多种细胞类型和器官中实现目的基因强效且瞬时表达的优势。然而，重组腺病毒技术操作繁琐、耗时且成本较高。本文介绍了一种利用pAdEasy系统改进的实验方案，可获得纯化的腺病毒颗粒，从而在转导细胞中诱导强烈的绿色荧光蛋白（GFP）表达。与Bert Vogelstein最初开发的方法相比，该改进方法具有制备更快、生产成本更低的优点。腺病毒技术的主要步骤包括：（1）在BJ5183细菌中将pAdTrack-GFP与pAdEasy-1质粒进行重组；（2）腺病毒颗粒的包装；（3）在AD293细胞中扩增腺病毒；（4）从细胞裂解物和培养基中纯化腺病毒颗粒；（5）对腺病毒进行病毒滴度测定和功能检测。本方法的改进之处包括：（i）通过化学转化法在含有pAdEasy-1的BJ5183细菌中进行重组；（ii）通过“阴性”和“阳性”PCR筛选重组克隆；（iii）使用K2转染系统将AD293细胞转染以实现腺病毒包装；（iv）利用硫酸铵沉淀法沉淀AD293细胞释放到培养基中的病毒颗粒；（v）通过一步式氯化铯不连续密度梯度超速离心法纯化病毒。在多种来源（人、牛、小鼠）的不同类型转导细胞（如肝细胞、内皮细胞）中均获得了目的基因（本实验中为GFP）的高效表达。腺病毒介导的基因转移是开发现代基因治疗的主要工具之一。

引言

腺病毒是一类无包膜病毒，含有核衣壳和线性双链DNA基因组1,2,3。腺病毒可感染多种类型的细胞，且其感染不依赖于宿主细胞的活跃分裂。感染后，腺病毒将其基因组DNA导入宿主细胞核内，病毒DNA以附加体形式存在，并与宿主基因一同转录。因此，其插入突变或调控原癌基因的潜在风险极低4,5,6。腺病毒基因组不会随宿主基因组一同复制，因此在分裂的细胞群体中，腺病毒基因会被逐渐稀释。腺病毒转导的优势包括：(i) 外源基因高水平表达；(ii) 由于为附加体表达，病毒DNA整合入宿主基因组的相关风险降低；(iii) 可转导多种分裂和非分裂细胞类型。目前生物医学研究中使用的大多数腺病毒均为非复制型，缺失E1区7,8,9。其生产需要提供E1序列的细胞系（如HEK293）。此外，病毒生命周期中的非必需区E3已被删除，以允许将外源基因插入病毒基因组；某些腺病毒还进一步删除了其他区域（E2和E4），但在这些情况下，报道显示腺病毒产量降低且外源基因表达水平较低7。

本文介绍了一种利用 AdEasy 系统构建、包装和纯化腺病毒的改进方案。相较于 Bert Vogelstein 最初建立的方法2,10，本改进方案具有以下优势，使腺病毒的包装更加快速且经济：（i）通过化学转化法将含有 pAdEasy-1 的 BJ5183 细菌进行同源重组；（ii）利用 PCR 筛选重组克隆；（iii）采用 K2 转染系统转染 AD293 细胞以实现腺病毒包装；（iv）在病毒包装与扩增后，从培养基中沉淀腺病毒颗粒；（v）通过一步式氯化铯（CsCl）梯度超速离心法纯化腺病毒。

使用AdEasy系统（图1）进行腺病毒制备的方案包含以下步骤：

(1) pAdTrack-GFP 与 pAdEasy-1 在 BJ5183 细菌中的重组
(2) 腺病毒颗粒的包装
(3) 腺病毒的扩增
(4) 从细胞裂解液和培养基中纯化腺病毒颗粒
(5) 腺病毒滴度测定。

基因编辑过程示意图；pAdTrack-GFP 质粒的同源重组、包装、扩增与纯化。
图 1：腺病毒制备技术。腺病毒技术的主要步骤包括：（1）pAdTrack-GFP 质粒与 pAdEasy-1 质粒在 BJ5183 细菌中发生同源重组，筛选出的重组质粒在 DH5α 细菌中扩增，随后进行纯化；（2）在可表达腺病毒 E1 蛋白的 AD293 细胞中包装腺病毒颗粒；（3）在 AD293 细胞中扩增腺病毒；（4）通过 CsCl 密度梯度超速离心法，从细胞裂解液和培养基中纯化腺病毒颗粒；（5）腺病毒的滴度测定与功能检测。请点击此处查看本图的放大版本。

在本实验方案中，我们展示了用于制备腺病毒的技术，该病毒可诱导宿主细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达。GFP 已插入 pAdTrack-CMV 转移载体（Addgene #16405）的骨架中，位于第二个 CMV 启动子下游，作为报告基因使用（图1）。因此，本文中我们将 pAdTrack-CMV 载体命名为 pAdTrack-GFP，并以 GFP 的表达情况进行示例性评估。除 GFP 表达外，该系统还可用于过表达目的基因，目的基因可克隆至 pAdTrack-CMV 载体的多克隆位点中。与 cDNA 相比，克隆至 pAdTrack-CMV 载体中的基因或微型基因通常在诱导表达方面效率更高11。实验数据显示，在多种来源（人、牛、小鼠）的转导细胞（如肝细胞、内皮细胞）中均观察到强烈的 GFP 表达。腺病毒介导的基因转移是开发现代基因治疗的主要工具之一。

方案

安全须知：通常，腺病毒被归类为生物安全二级生物体，因此所有操作必须由经过培训的人员在二级生物安全柜中进行，并穿戴生物危害防护装备（包括手套、防生物气溶胶的口罩、实验服等）。所有被腺病毒污染的固体材料必须先用10%的次氯酸钠溶液消毒30分钟，再于121 °C、1 bar条件下高压灭菌30分钟。根据插入基因的不同，所构建的腺病毒可能具有潜在危险性，并可能被归入其他生物安全等级。

1. 实验准备

  1. 为腺病毒操作使用独立的细胞培养操作台，每种腺病毒使用单独的培养箱。病毒包装和扩增时使用带滤膜瓶盖的T型培养瓶；尽量避免在带通气孔的培养皿中进行转导实验。
  2. 每次使用后清空细胞培养操作台，并用紫外灯照射15分钟。
  3. 定期对移液器辅助装置、移液管及其他器具进行高压灭菌。如有可能，应在独立的细胞培养实验室或生物安全柜中分别培养用于腺病毒包装的细胞（AD293细胞）以及用于转导实验的细胞。同一时期扩增的不同腺病毒批次应通过PCR检测是否存在交叉污染。
  4. 配制以下溶液。
    1. 制备SOB（Super Optimal Broth）培养基：20 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、0.5 g NaCl（终浓度10 mM）、2.5 mL 1 M KCl（终浓度2.5 mM），并加H20 至 1 L。经高压灭菌后 121 °C，加入以下无菌溶液：5 mL 1 M MgCl2 和 5 mL 1 M MgSO₄4.
    2. 制备 SOC（含分解代谢抑制的超级优化肉汤）培养基：在 1 L 无菌 SOB 中加入以下无菌溶液：20 mL 1 M 葡萄糖、5 mL 1 M MgCl₂2, 和 5 mL 1 M MgSO₄4.
    3. 配制沉淀溶液：将29.5 g乙酸钾溶解于60 mL H2O，加入11.5 mL乙酸，以及H20 至 100 mL
    4. 配制重悬缓冲液：95 mL 20% 葡萄糖，5 mL 1 M Tris-Cl pH 8，4 mL 0.5 M EDTA pH 8，加水至 100 mL2O 至 200 mL。
    5. 制备裂解液：8.3 M NaOH 4.8 mL，20% SDS 10 mL，以及 H20 至 200 mL。

2. 在BJ5183细菌中将pAdTrack-GFP病毒载体与pAdEasy-1质粒进行重组

  1. pAdTrack-GFP 的线性化及线性化质粒的纯化。
    1. 在冰上配制以下消化体系：
      10 µg pAdTrack-GFP
      5 µL 10x 无色缓冲液
      2 µL Pme I
      加 H2O 至终体积为 50 µL。
    2. 在 37 °C 水浴中孵育 3 小时。
    3. 在 65 °C 灭活 20 分钟。
    4. 检测 Pme I 对 pAdTrack-GFP 的消化效率：将 1 µg 消化后的质粒与 1 µg 未消化的质粒平行上样于 0.8% 琼脂糖凝胶进行电泳分析。
  2. DNA 的分离与纯化
    注意：步骤 1–6 需在通风橱中操作。
    1. 向消化反应混合物中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），反复倒置离心管直至混合均匀。
    2. 在 16,200 x g 条件下离心 3 分钟，然后将上层水相转移至收集管中。
    3. 向下层有机相中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），涡旋混匀。
    4. 在 16,200 x g 条件下离心 3 分钟，然后将上层水相转移至同一收集管中。
    5. 向收集管中的水相中加入等体积氯仿，涡旋混匀。
    6. 在 16,200 x g 条件下离心 3 分钟，然后将上层水相转移至新的收集管中。
    7. 加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠和 2 体积的预冷 100% 乙醇，涡旋混匀。
    8. 在 -70 °C 孵育 1 小时，或在 -20 °C 过夜。
    9. 将样品置于冰上融化，并在 16,200 x g、4 °C 条件下离心 10 分钟。
    10. 弃去上清液，加入 750 µL 75% 乙醇。
    11. 在 16,200 x g、4 °C 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
    12. 短暂离心以去除残留上清液，在通风橱中干燥沉淀。不要长时间干燥 DNA 沉淀，因其难以溶解。
    13. 将沉淀溶解于 15 µL H2O 中。
    14. 使用分光光度计（例如 Nanodrop）测定 DNA 浓度。
  3. 用 pAdTrack-GFP 转化 AdEasier-1 细菌
    注意：此步骤中发生 pAdTrack-GFP 与 pAdEasy-1 质粒的重组。
    1. 使用商业转化试剂盒，按照制造商说明制备 AdEasier-1（含 pAdEasy-1 的 BJ5183，Addgene #16399）化学感受态细菌。将 100 µL 感受态细菌分装后保存于 -80 °C。
    2. 将一份 AdEasier-1 感受态细菌在冰上融化，加入 1 µg 经 Pme I 消化的纯化 pAdTrack-GFP。轻轻弹击离心管混匀（切勿使用移液器吹打）。冰上孵育 10 分钟。
    3. 加入 900 µL SOC 培养基，37 °C 摇床孵育 1 小时。
    4. 在 600 x g 条件下微量离心 5 分钟。
    5. 弃去 900 µL 上清液，将沉淀与剩余上清液混匀，将转化后的细菌涂布于含卡那霉素的 LB-琼脂平板上。
    6. 37 °C 孵育约 16 小时（不得超过 18 小时）。
  4. 通过 PCR 筛选可能的阳性克隆
    1. 将牙签分成两半，并通过高压灭菌对半牙签进行灭菌。
    2. 使用无菌半牙签挑取细小且半透明的菌落。
    3. 将带有细菌的半牙签在 10 µL 水（PCR 管中）中短暂旋转混匀，然后将该半牙签放入含 100 µL 加卡那霉素 SOC 培养基的 1.5 mL Eppendorf 管中。37 °C 孵育 4–6 小时，同时进行“阴性”和“阳性”PCR 检测。
    4. 将含细菌的 10 µL 水样 PCR 管在 95 °C 孵育 5 分钟以获得细菌模板，同时进行“阴性”和“阳性”PCR 扩增。
    5. “阴性”PCR —— 用于检测 pAdTrack-GFP 的完整性：在冰上配制以下阴性 PCR 反应体系：
      5 µL 细菌样本
      0.1 µL 正向引物（4631 F: 5’-CAGTAGTCGGTGCTCGTCCAG）
      0.1 µL 反向引物（5616 R: 5’-TATGGGGGCTGTAATGTTGTCTC）
      0.1 µL dNTP（10 mM）
      3 µL 5x 缓冲液
      1.5 µL MgCl2（25 mM）
      0.1 µL GoTaq DNA 聚合酶
      加 H2O 至终体积 15 µL
      注意：必须设置以 pAdTrack-GFP 质粒为模板的阳性对照。
    6. “阳性”PCR —— 用于检测目的基因的存在。使用插入基因的特异性引物，按上一步方法配制反应体系。GFP 所用引物如下：
      F: 5’-CAAGGACGACGGCAACTACA
      R: 5’-ATGGGGGTGTTCTGCTGGTA
    7. 同时运行“阴性”和“阳性”PCR。PCR 程序为：95 °C 5 分钟；40 个循环（95 °C 30 秒，68 °C 30 秒，72 °C 1 分钟）；最终延伸：72 °C 10 分钟。
      注意：根据目的基因调整退火温度。
    8. 在 1% 琼脂糖凝胶上分析 PCR 产物，并筛选克隆。
    9. 选择“阴性 PCR”无扩增产物且“阳性 PCR”出现特异性条带的克隆进行后续操作。
  5. 扩增筛选出的重组克隆细菌培养物
    1. 将疑似阳性克隆（来自步骤 2.4.3）的菌液按 1:4 比例稀释于含卡那霉素的 4 mL SOC 培养基中，37 °C 摇床过夜培养。
  6. 从 AdEasier-1 细菌中提取质粒 DNA（碱裂解法小量提取）
    1. 将 1.5 mL 细菌培养物转移至微量离心管中，在 16,200 x g 条件下离心 1 分钟，弃去上清液。
    2. 向同一离心管中再加入 1.5 mL 细菌培养物，重复离心并弃去上清液。
    3. 加入 200 µL 重悬缓冲液（50 mM 葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl，pH 8）。
    4. 加入 200 µL 裂解液（0.2 N NaOH，1% SDS），通过反复倒置离心管轻柔混匀。
    5. 加入 200 µL 沉淀液（5 M 醋酸钾 60 mL，冰乙酸 11.5 mL，加 H2O 至 100 mL），通过反复倒置离心管轻柔混匀。
    6. 在 16,200 x g 条件下离心 3 分钟。
    7. 将上清液转移至新的微量离心管中，加入 500 µL 异丙醇，混匀后在冰上孵育 20 分钟。
    8. 在 16,200 x g 条件下离心 15 分钟，加入 500 µL 75% 乙醇。
    9. 在 16,200 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
    10. 在 16,200 x g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液，加入 15 µL H2O。
  7. 扩增、提取及重新检测重组质粒
    1. 用从 AdEasier-1 细胞中提取的 DNA 转化 DH5α 细菌。
      1. 使用商业转化试剂盒，按照制造商说明制备 DH5α 感受态细菌。
      2. 将 100 µL DH5α 感受态细菌在冰上融化，加入重组 DNA，冰上孵育 10 分钟，然后涂布于含卡那霉素的 LB-琼脂平板上。
      3. 37 °C 过夜培养。
      4. 挑取多个单菌落，分别接种于 2 mL 含卡那霉素的 LB 培养基中，37 °C 摇床过夜培养。
    2. 提取 DNA（碱裂解法小量提取），并将所得 DNA 重悬于 25 µL H2O 中。
    3. 通过酶切验证阳性克隆。
      1. 在冰上配制以下反应体系：
        5 µL 重组 DNA
        1.5 µL 10x 无色缓冲液
        0.5 µL Hind III 或 Pst I
        加 H2O 至终体积 15 µL
      2. 37 °C 孵育 30 分钟。
        注意：同时对 pAdTrack-GFP 和 pAdEasy-1 质粒进行酶切作为对照。
      3. 向每个样品中加入 3 µL 含 RNase A 的 Sx6 上样缓冲液（若小量提取试剂盒中不含 RNase A）。
      4. 将酶切后的 DNA 片段进行 1% 琼脂糖凝胶电泳。
        注意：阳性克隆的酶切图谱应主要呈现 pAdEasy 质粒的酶切片段，表明 pAdEasy 与 pAdTrack 载体发生了正确重组。目的基因应可通过克隆所用的限制性内切酶消化得以验证。
    4. 制备用于腺病毒包装的质粒 DNA（转染级）。
      1. 从一个阳性克隆扩增 200 mL 细菌培养物，用于质粒 DNA 提取。
      2. 使用商业质粒 DNA 中量提取试剂盒（例如 Qiagen Plasmid Midi Kit），按照制造商说明提取质粒 DNA。

3. 腺病毒颗粒的包装

  1. 第1天。接种AD293细胞
    1. 用PBS洗涤AD293细胞，并在37 °C下用0.125%胰蛋白酶孵育2-5分钟。
    2. 用含血清的冷培养基收集细胞。
    3. 在4 °C下以400 × g离心5分钟。
    4. 将细胞重悬于含血清的培养基中，并以约2 × 106/T25培养瓶的密度接种细胞。建议使用带滤膜的培养瓶。
  2. 第1天。用Pac I消化重组DNA
    1. 配制以下混合液：
      6 µL 重组DNA（1 µg/µL）
      2 µL Pac I
      2.5 µL 10×无色缓冲液
      加H2O至终体积25 µL
    2. 在37 °C孵育3小时（或过夜），然后在65 °C灭活酶20分钟。
    3. 乙醇沉淀DNA：加入2.5 µL（1/10 v/v）3 M醋酸钠和2-3倍体积的100%乙醇。在-70 °C孵育30分钟或在-20 °C过夜。
    4. 在4 °C下以16,200 × g离心30分钟，将沉淀重悬于无菌水中。
  3. 第2天：使用K2试剂转染AD293细胞
    1. 转染前两小时，在细胞上加入40 µL K2增强剂。
    2. 配制A液和B液：
      A液：将6 µg Pac I线性化DNA加入260 µL Opti-MEM中。
      B液：将21.6 µL K2试剂加入248.4 µL Opti-MEM中。
    3. 将A液加入B液中，用移液器轻轻混匀。
    4. 室温孵育20分钟。将A和B的混合液逐滴加入细胞中。
  4. 第3-11天：通过荧光显微镜监测GFP表达
    注意：在荧光显微镜下细胞应呈现绿色，并逐渐脱落。
  5. 第11天：收获F1腺病毒颗粒
    1. 将脱落的细胞和培养基收集至50 mL离心管中，刮下贴壁细胞并加入同一管中。
    2. 以400 × g离心5分钟，将上清液转移至新管中，将细胞沉淀重悬于0.5 mL PBS中。
    3. 细胞裂解
      1. 将细胞悬液转移至微量离心管中。
      2. 进行三次冻融循环（在液氮或-80 °C冷冻/在37 °C融化，每次最长7分钟）。
      3. 用23 G针头将裂解细胞反复吹打三次。
    4. 以9,600 × g离心12分钟，去除细胞碎片。
    5. 将上清液转移至含有收集培养基的50 mL离心管中。

4. 腺病毒的扩增

注意：如果 AD293 细胞未达到所需的汇合度，可用于感染的腺病毒储存液分装样品（从产病毒细胞获得的裂解液）可保存在 -80 °C。

  1. 制备F2腺病毒颗粒。
    1. 在T75培养瓶中接种AD293细胞（5 x 10⁵）6 细胞/瓶
    2. 使用 F1 腺病毒颗粒感染约 90% 汇合度的 AD293 细胞：将 T25 培养瓶中的细胞匀浆液及培养基加入至 T75 培养瓶中培养的细胞上。
    3. 通过荧光显微镜监测GFP表达。
    4. 当约90%的转导AD293细胞脱落时（约第5天），收获产生病毒的细胞th 转导后一天）。将细胞培养基保持在 4 °C.
    5. 在1 mL PBS中裂解细胞（方法与F1相同）。
  2. 制备F3腺病毒颗粒。
    1. 在T175培养瓶中接种约90%汇合度的AD293细胞，用F2腺病毒颗粒及其病毒颗粒培养液感染细胞。
    2. 在转导后约 5 天收集细胞。
    3. 用2 mL PBS裂解细胞（方法与F1相同）。
  3. 制备F4腺病毒颗粒。
    1. 用 F3 腺病毒颗粒和细胞培养基感染 5 个含有约 90% 汇合度 AD293 细胞的 T175 培养瓶。
    2. 在转导后约 5 天收集细胞。
    3. 用3 mL PBS裂解细胞（方法与F1相同）。
  4. 制备F5腺病毒颗粒。
    1. 用 F4 腺病毒原液和细胞培养基感染 25 个含有约 90% 汇合度 AD293 细胞的 T175 培养瓶。

5. 从细胞裂解物和培养基中纯化腺病毒

  1. 收获产生病毒的细胞及培养基。
    1. 转导后第5天收获F5代AD293细胞。
    2. 将培养基保存在无菌瓶中，用于沉淀腺病毒颗粒。
      注意：在腺病毒纯化前，需将培养基保存在冰箱中。
    3. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟 oC.
    4. 将最终沉淀重悬于 5 mL 含 2 mM MgCl₂ 的 10 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8）中2.
    5. 将悬液分装至1.5 mL离心管中。
    6. 裂解细胞（方法与F1相同）：进行三个冻融循环。
      注意：如果无法立即进行超速离心，请将样品置于 -80 °C.
    7. 将细胞悬液通过23G注射器针头反复吹打三次。
    8. 将匀浆在 9 600 x g 离心 12 分钟。
    9. 将上清液保存用于通过CsCl梯度超速离心纯化腺病毒。
  2. 培养基中释放的腺病毒沉淀
    1. 将装有保存的细胞培养基的瓶子置于室温下。
    2. 向每 500 mL 细胞培养基中加入 121 g 硫酸铵（溶液饱和度应介于 40 - 42% 之间）。
    3. 轻轻混匀，直至硫酸铵完全溶解。
    4. 室温孵育至少2.5小时。
    5. 在 22℃ 下以 1600 × g 离心 15 分钟 oC，离心并保存沉淀。
    6. 将沉淀重悬于 4 mL 含 2 mM MgCl₂ 的 10 mM Tris-HCl（pH 8）缓冲液中2；该悬浮液应立即通过CsCl梯度超速离心进行纯化。
      注意：如果无法进行后续纯化步骤，需将重悬的沉淀物在含有 2 mM MgCl₂ 的 10 mM Tris HCl（pH 8）缓冲液中透析过夜2.
  3. 通过超速离心纯化腺病毒。
    1. 在聚丙烯管中为SW41Ti转子制备不连续CsCl梯度。在管底加入3 mL浓度为765 mg/mL的CsCl（高密度：1.4 g/L）。随后缓慢加入3 mL浓度为288.5 mg/mL的CsCl（低密度：1.2 g/L），覆盖在第一层CsCl溶液上方。
    2. 轻柔地将从细胞中释放或从细胞培养基中沉淀获得的 3 - 4 mL 腺病毒颗粒悬液（如前所述）覆盖于梯度液顶部。
    3. 用矿物油填充离心管，并将离心管放入预冷的SW41Ti离心桶中。
    4. 平衡离心管。确保装有样品的聚丙烯管对称地放入转子中。将转子放入超速离心机。
    5. 210,000 x g 离心 g 和 4 °C，持续18小时，无间断。
    6. 将超速离心管放置在支架上，背后衬以黑色纸张以观察条带。
    7. 将上清液、细胞碎片以及上层条带加入含漂白液的废液容器中弃去。
    8. 收获包含完整腺病毒的最低条带（约700 µL - 1 mL) 置于无菌的 1.5 mL 离心管中，冰上保存。
    9. 用透析缓冲液（10 mM Tris-Cl 缓冲液，pH 8，2 mM MgCl₂）预先润湿透析盒2).
    10. 使用2 mL注射器将纯化的腺病毒注入透析盒中。
    11. 在含有10 mM Tris-Cl缓冲液（pH 8）、2 mM MgCl的溶液中透析过夜2 （更换透析缓冲液 3 - 4 次）。
    12. 从透析盒中分装收获腺病毒储备液，每份 10 - 100 μL.
    13. 向病毒分装液中加入蔗糖，使其终浓度为4%（用于冷冻保护）。
    14. 将分装样品储存在 -80 °C.

6. 腺病毒滴度测定

  1. 第1天：接种细胞
    1. 在12孔培养板中，每孔加入1 mL完全生长培养基，按每孔2.5 × 105 个细胞的密度接种AD293细胞，如图2所示。确保每个孔中的细胞分布均匀，以准确测定滴度。

细胞计数表；稀释实验；使用溶液A-D的转导；浓度：10^4-10^7
图2：滴定板设计。 请点击此处查看本图的放大版本。

  1. 第2天：细胞转导
    1. 用胰酶消化从一个孔中脱离细胞并计数。记录此数值，因其将用于计算病毒滴度。
    2. 在1 mL完全培养基中对病毒原液进行系列稀释（1/104；1/105；1/106；1/107），步骤如下：
    3. 1/103：病毒原液稀释——将2 μL病毒原液加入1998 μL完全培养基中。
    4. 1/104：将1/103稀释液按1:10稀释，取120 μL加入1080 μL完全培养基中（A）。
    5. 1/105：将B按1:10稀释，取120 μL的A加入1080 μL完全培养基中（B）。
    6. 1/106：将C按1:10稀释，取120 μL的B加入1080 μL完全培养基中（C）。
    7. 1/107：将D按1:10稀释，取120 μL的C加入1080 μL完全培养基中（D）。
      注：每种稀释液（A、B、C、D）需准备3管，以进行三重复实验。
    8. 吸除孔内培养基，加入已准备好的病毒稀释液，如图2所示。
  2. 第3天：监测GFP表达
    1. 使用荧光显微镜观察各孔中绿色荧光细胞的存在情况。
  3. 第4天：GFP阳性细胞的流式细胞术分析
    1. 准备并标记十二个1.5 mL离心管。
    2. 收集细胞培养基（连同脱落的细胞）至1.5 mL离心管中，并置于冰上保存。
    3. 向每个孔中加入200 μL胰酶。
    4. 将培养板在CO2培养箱中37 °C孵育2–3分钟。
    5. 将细胞收集至含有培养基的同一离心管中。保持管子置于冰上。
    6. 在4 °C下以400 × g离心5分钟，沉淀细胞。
    7. 吸除上清液；保持管子置于冰上。
    8. 用250 μL PBS + 2% FBS重悬细胞沉淀；保持管子置于冰上。
    9. 将细胞悬液转移至流式细胞术专用管或板中。
    10. 在流式细胞仪上检测样品，记录GFP表达细胞的荧光信号。
      滴度计算：应选择亲代细胞群中GFP阳性细胞比例为5–20%的样品，用于按以下公式计算病毒滴度：
      滴度（TU/mL）= D × F/100 × C/V
      D = 稀释倍数
      F = 阳性细胞百分比 / 100
      C = 每孔细胞数
      V = 病毒接种液体积

7. 腺病毒转导靶细胞及诱导蛋白表达的检测

  1. 第1天：接种细胞
    1. 接种靶细胞，确保细胞在孔中分布均匀。
  2. 第2天：细胞转导
    1. 从一个孔中消化并收集靶细胞，进行细胞计数。
    2. 计算转导所需腺病毒悬液的适当体积，以实现每个细胞所需的感染性病毒颗粒数量。
    3. 向靶细胞中加入相应量的病毒悬液。
  3. 第3天：去除病毒悬液并检测GFP表达
    1. 将含有腺病毒颗粒的细胞培养基更换为新鲜培养基。
    2. 在荧光显微镜下观察GFP表达情况。

结果

我们对原始的Vogelstein方案进行了修改和优化，以实现更快速、更高效的腺病毒制备。首先，我们改进了方法以更简便地筛选重组子。在发生重组后，通过“阴性PCR”检测BJ5183细菌克隆，以评估pAdTrack-GFP的完整性，作为判断是否未发生重组的指标（图 3A），或通过“阳性PCR”鉴定目标基因（在本研究中将其等同于GFP）图3B）。在“阴性”和“阳性”PCR中，我们均使用pAdTrack-GFP作为对照模板，以检测pAdTrack的完整性，扩增出986 bp的条带图3A，第1泳道），以及GFP的264 bp条带（图3B，第3泳道）。用于“阴性PCR”的引物设计用于扩增pAdTrack-GFP中包含PmeI位点的986 bp片段。该DNA片段在发生重组后显著增大，因此在阳性重组克隆中无法被扩增。重组阴性克隆即pAdTrack-GFP保持完整的克隆，如图所示 图 3A，第3、4和6泳道。引物与重组位点相邻的DNA序列退火。潜在的阳性重组克隆（图3A，第2和第5泳道）表达GFP，如图所示 图3B，泳道1和2。提取这些克隆的质粒DNA，用于转化DH5α以获得更大量的DNA。在DH5α中扩增的这些预筛选重组质粒随后通过酶切鉴定。在 图3C-E 一个重组阳性克隆经 Hind III、PstI 和 BamHI 限制性内切酶消化后的酶切结果如图所示图3C，D，E 第2泳道）。重组克隆的HindIII和PstI酶切图谱与pAdEasy-1相似，因为HindIII和PstI分别在pAdEasy-1质粒上切割24次和25次，图3C 和 D，第3泳道）；HindIII 对 pAdTrack-GFP 载体进行一次切割，PstI 进行四次切割（图3C 和 D，第1泳道）。BamHI 对 pAdEasy-1 载体进行双酶切（图3C，第3泳道）以及一次pAdTrack-GFP（图3C，第1泳道）。

PacI 从重组质粒中切割出一个 4.5 kb 的片段图3F，第2泳道），来自pAdTrack-GFP的2863 bp片段（图 3F，第1道），并线性化pAdEasy-1载体（图3F，第3泳道）。DNA标记物用以下表示 图3C-F在第4泳道中。将重组质粒用Pac I酶切，以备后续用于AD293转染。

显示质粒分析的PCR筛选和酶切示意图；标注了条带大小的电泳凝胶图；使用了HindIII、PstI、BamHI、PacI酶。
图3：pAdTrack-GFP与pAdEasy-1质粒的重组。 pAdTrack-GFP与pAdEasy-1重组后获得的质粒通过“阴性”PCR检测pAdTrack-GFP的完整性（A）。非重组克隆因存在一条986 bp的条带而被确认，该条带对应于从pAdTrack-GFP质粒扩增出的序列（A，泳道3、4和6）。同时也获得了可能为重组阳性的克隆（A，泳道2和5）。当以pAdTrack-GFP载体作为模板时，得到一条986 bp的条带（A，泳道1）。对可能为阳性的重组克隆进一步通过“阳性”PCR检测GFP表达（B）；在两个可能重组的克隆（B，泳道1和2）以及pAdTrack-GFP质粒中均出现一条264 bp的条带。对一个可能重组克隆的DNA使用HindIII、PstI、BamHI和PacI限制性内切酶进行酶切分析（C–F，泳道2）。在对照组中，pAdEasy-1载体（C–F，泳道3）和pAdTrack-GFP质粒（C–F，泳道1）也用相同的酶进行消化处理。DNA标记物显示于C–F泳道4。 请点击此处查看该图的放大版本。

腺病毒的包装与扩增在AD293细胞中进行。腺病毒颗粒（AdV-GFP）从AD293细胞裂解液以及被感染细胞释放到的细胞培养基中进行纯化。为了浓缩细胞培养基中的腺病毒，采用硫酸铵沉淀病毒颗粒，随后将其重悬于含2 mM MgCl2的10 mM Tris HCl（pH 8）缓冲液中，该缓冲液与细胞裂解所用缓冲液相同。随后，来自细胞裂解液和培养基的腺病毒颗粒通过CsCl不连续梯度超速离心法进行纯化。超速离心后获得了明显的高纯度AdV-GFP条带，如图4所示。

细胞裂解液和培养基离心梯度，腺病毒条带分离，密度梯度
图 4：通过在不连续 CsCl 梯度上进行超速离心纯化腺病毒。将细胞匀浆液以及从培养基中沉淀的腺病毒置于由低密度和高密度 CsCl 溶液构成的不连续梯度中进行超速离心。在两种情况下均观察到清晰的 GFP-腺病毒条带。请点击此处查看该图的放大版本。

为了测定以每毫升转导单位（TU/mL）表示的病毒滴度，使用腺病毒-GFP（AdV-GFP）的不同梯度稀释液感染AD293细胞。感染48小时后，细胞表达GFP，其表达水平与病毒悬液的稀释倍数呈负相关。通过荧光显微镜观察该现象，并通过流式细胞术确定GFP阳性细胞的百分比（图5）。在计算滴度时，选择诱导5–20% GFP阳性细胞的病毒稀释度进行分析（图5C）。通常，GFP腺病毒的病毒滴度可达约~1010（TU/mL）。

以下，我们以特定批次的腺病毒为例，说明其病毒滴度的计算方法：将 1 mL 腺病毒溶液（V）以 106 倍稀释（D）后，转导 300000 个细胞（C），获得 6% 的 GFP 阳性细胞（F）：

滴度（TU/mL）= D × F/100 × C/V = 106 × 6/100 × 300000/1 = 1.8 × 1010 TU/mL

转导细胞中GFP表达分析的稀释系列显微镜图像和流式细胞术图。
图5：腺病毒滴度的评估。AD293细胞用不同稀释度的腺病毒感染。48小时后，通过荧光显微镜观察细胞，并通过流式细胞术分析以确定不同腺病毒稀释度所诱导的GFP阳性细胞百分比（A-D）。为建立流式细胞术的设门标准，同时分析了未转导的细胞（E）。当6%的细胞为GFP阳性时，对应稀释倍数106的滴度计算结果为1.8 × 1010 TU/mL。图A-E中，标尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

为了检测制备的腺病毒的转导潜能，使用了四种细胞系：人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）、小鼠肝细胞（Hepa 1-6）以及小鼠间充质基质细胞（MSC）。内皮细胞（EA.hy926 和 BAEC）以每细胞 25 TU 的剂量进行转导，肝细胞以每细胞 5 TU 的剂量转导，MSC 则以每细胞 250 TU 的剂量转导。

以下是计算使用滴度为 1.8 × 1010 TU/mL 的腺病毒悬液，以每细胞 25 TU 的感染复数感染 3 × 106 个细胞所需病毒悬液体积的示例。

对于 1 个细胞 .............. 25 TU
3 x 106 个细胞 .............. x TU 静态平衡示意图，ΣFx=0；杠杆与支点装置；力与力矩的分解。 x=75 x 106 TU
如果病毒原液含有
1.8 x 1010 TU .............. 1 mL
75 x 106 TU .............. y mL 静态平衡示意图，ΣFx=0；杠杆与支点装置；力与力矩的分解。 y= 4.2 x 10-3 mL = 4.2µL 病毒原液

转导48小时后，通过荧光显微镜分析细胞。如图所示 图6，人或牛的内皮细胞以每细胞25 TU的感染复数进行转导，效率良好（约50%）图6 EA.hy926 和 BAEC）。小鼠肝细胞（Hepa 1-6）在低剂量腺病毒颗粒（5 TU/细胞）条件下即可被高效转导，但这类细胞对腺病毒也较为敏感，与其他细胞类型相比，其死亡细胞比例（PI阳性细胞）较高（约16%）。间充质基质细胞最难被转导（图6），由于缺乏特异性的腺病毒受体（未发表数据）。

流式细胞术图谱和荧光图像显示腺病毒-GFP在不同细胞类型中的转导效率。
图6：腺病毒的感染能力及其在转导细胞中诱导GFP表达的效果。采用指定剂量的腺病毒对人内皮细胞（EA.hy926）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）、小鼠肝细胞（Hepa 1-6）以及小鼠间充质基质细胞（MSC）进行转导。通过荧光显微镜检测GFP表达，并利用流式细胞术分析GFP阳性细胞的百分比。通过流式细胞术测定的PI阳性细胞反映了病毒转导导致的细胞死亡率。EA.hy926细胞、牛主动脉内皮细胞和Hepa 1-6细胞对腺病毒的转导效率较高，转导率范围为41–52%。而对于MSC，即使使用较高剂量的病毒（250 TU/细胞），仅有27%的转导细胞呈GFP阳性。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

重组腺病毒是基因递送和表达的多功能工具12,13,14。为了通过腺病毒转导实现高效蛋白表达，需将目的基因的编码序列插入腺病毒基因组中。由Bert Vogelstein实验室开发的AdEasy腺病毒系统包含一个骨架质粒（pAdEasy-1），该质粒含有大部分野生型5型腺病毒基因组，以及一个用于基因克隆的穿梭载体（pAdTrack）2,10。通过删除腺病毒E1基因（负责感染性病毒颗粒的组装）和E3基因（编码参与逃避免疫宿主反应的蛋白），在腺病毒基因组中腾出空间，可插入大小为6.5–7.5 kb的目的基因2,3。该容量足以容纳许多基因，尤其适用于内含子较短的基因15,16,17。也有研究人员报道了携带转基因cDNA的腺病毒的制备18,19,20。然而，与携带完整基因或迷你基因的腺病毒相比，携带cDNA的腺病毒在转基因表达水平上产量较低（数据未显示）。

在改进和优化先前方法2,10,14,18,21的基础上，腺病毒制备技术所需时间更短、成本更低、操作更简便。全长腺病毒DNA通过穿梭载体与pAdEasy-1质粒在易于发生同源重组的E. coli菌株BJ5183中重组获得。该方案涉及对AdEasier-1细胞（含有pAdEasy-1质粒的BJ5183细菌）进行化学转化。该技术无需使用某些实验室可能不具备的电穿孔仪，操作极为简便，可提高重组效率，并缩短制备感受态细胞及完成转化所需的时间。通过PCR预先筛选重组克隆，进一步缩短了操作周期，简化了整体流程。Zhao及其同事曾采用过类似方法22，但在本方案中，我们对引物序列进行了优化。

在GFP-腺病毒的包装与扩增过程中，使用了一种HEK293衍生的细胞系，即AD293细胞，该细胞对培养皿的贴附性更强。其他常用于腺病毒生产的细胞系包括：911、293FT、pTG6559（A549衍生细胞系）、PER.C6（HER衍生细胞系）、GH329（HeLa衍生细胞系）、N52.E6以及HeLa-E123,24,25,26。据我们实验结果显示，使用911细胞并未提高腺病毒的产量（数据未显示）。采用K2试剂将重组质粒转染至AD293细胞，可显著提高病毒包装步骤的效率。腺病毒生产完成后，约有高达70%的腺病毒仍保留在细胞内，需通过三次冻融循环释放。增加冻融次数并不合适，因为这会破坏腺病毒的结构与活性。

在常规的腺病毒生产过程中，大量病毒颗粒会释放到细胞培养基中。在收获感染的AD293细胞时若丢弃该细胞培养基，将导致重要的病毒损失。我们优化了Schagen及其同事描述的方案，通过硫酸铵沉淀法从细胞培养基中纯化腺病毒颗粒27。与使用聚乙二醇的方法相比，该方法从细胞培养基中回收腺病毒的效率更高28。沉淀所得的腺病毒应立即通过超速离心进行纯化，或在透析去除过量盐分后于冰箱中保存数天。若未进行透析，沉淀物在数小时以上长时间存放会对病毒造成损害。

通过一步法超速离心纯化腺病毒颗粒，与采用多次超速离心步骤的方案相比，可减少对腺病毒原液的操作，使操作流程更为简便14,29。纯化后的腺病毒需进行透析，以去除可能影响转导效率的氯化铯。在本方案中，我们使用含MgCl2的Tris缓冲液进行透析，而非蔗糖，因为后者作为冷冻保护剂需使用大量且不合理的蔗糖用量。因此，我们在制备用于冷冻保存的腺病毒原液时，再直接加入蔗糖。为避免纯化后的腺病毒反复冻融，建议将腺病毒原液分装后于-80 °C保存。腺病毒滴度通过流式细胞术检测GFP报告基因及特定病毒稀释度下转导细胞的百分比来评估。该方法比经典的“空斑实验”更快，且相较于基于衣壳蛋白检测（如ELISA或流式细胞术等方法）的滴度测定更为可靠，因为后者无法反映腺病毒颗粒的感染能力。然而，基于ELISA的定量、Q-PCR或使用商业化试剂盒的空斑实验也是可选方法，尤其适用于不含荧光示踪标记的腺病毒滴定。

考虑到pAdTrack腺病毒来源于人腺病毒5型，而该型腺病毒可被柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）识别，我们证明了GFP-腺病毒不仅能够转导人源细胞（内皮细胞），还能转导其他物种来源的细胞，包括牛源（内皮细胞）和小鼠源细胞（间充质基质细胞和肝细胞）。实验结果表明，GFP-腺病毒可诱导外源基因高水平表达。

综上所述，我们优化了这一费力的技术，以减少获得腺病毒颗粒所需的时间、成本和工作量。所制备的腺病毒能够感染多种细胞类型，并诱导目的基因的表达。由于腺病毒介导的基因转移是开发现代基因治疗的主要工具之一，该方案可用于多种实验。

缩写： AdV-GFP，腺病毒颗粒；BAEC，牛主动脉内皮细胞；CsCl，氯化铯；GFP，绿色荧光蛋白；MSC，间充质基质细胞；TU，转导单位。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由欧洲区域发展基金通过2014-2020年竞争力运行计划（POC-A.1-A.1.1.4-E-2015，项目编号：P_37_668；项目简称：DIABETER）、罗马尼亚研究与创新部PCCDI-UEFISCDI资助项目（项目编号：PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697，属于PNCD III计划）以及罗马尼亚科学院共同资助。作者感谢希腊帕特雷大学的Kyriakos Kypreos提供的宝贵且富有建设性的建议，感谢罗马尼亚布加勒斯特美术大学的Ovidiu Croitoru在拍摄、视频剪辑和图形设计方面的贡献，以及Mihaela Bratu提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AD293 细胞Agilent Technologies240085
AdEasier-1 细胞Addgene16399
琼脂糖 I（用于电泳）Thermo Scientific17850
硫酸铵SigmaA4418
氨苄青霉素钠盐SigmaA0166
BamH IThermo ScientificFD0054
细胞培养板 100 mmEppendorf30702115
氯化铯SigmaL4036
DH5alpha 细菌Thermo Scientific18265017
DMEM（含 GlutaMAX，4.5 g/L D-葡萄糖）Gibco3240-027
EA.hy926 细胞ATCCCRL-2922
EDTASigmaE5134
乙醇（99.8%）Roth5054.2
胎牛血清SigmaF7524
培养瓶 T25、T75、T175Eppendorf30712129
葡萄糖SigmaG7021
Hepa 1-6 小鼠肝细胞ATCCCRL-1830
Hind IIIThermo ScientificFD0504
硫酸卡那霉素Thermo Scientific15160054
K2 转染系统BiontexT060-5.0
LB 培养基FormediumLBx0102
LB-琼脂FormediumLBx0202
Mix & Go E. coli 转化试剂盒Zymo ResearchT3001
Midori Green Advanced DNA 染色剂Nippon Genetics EuropeMG-04
NaOHSigmaS8045
Opti-MEMThermo Scientific31985070
Pac IThermo ScientificFD2204
pAdEasy-1Addgene16400
pAdTrack-CMVAddgene16405
苯酚:氯仿:异戊醇（24:24:1）Invitrogen15593-031
GoTaq DNA 聚合酶PromegaM3005
Pme I (Mss I)Thermo ScientificFD1344
乙酸钾VWR Chemicals43065P
Pst IThermo ScientificFD0614
Qiagen 大量质粒提取试剂盒Qiagen12125
细胞刮刀TPP99003
SDSThermo Scientific28365
Slide-A-Lyzer 透析夹Thermo Scientific66330
丙酮酸钠SIGMAP5280-100G
带 23G 针头的注射器B Braun464BR
Tris HClSigma1185-53-1
台盼蓝RothCN76.1
50 ml 离心管TPP91050
超透明离心管（14×89 mm）Beckman Coulter344059
离心机（带制冷功能）Sigma Sartorius3-19KS
Heraeus Fresco 17 微型离心机Thermo Scientific75002420
配备 SW41Ti 转子的超速离心机Beckman CoulterOptima L-80 XP
生物安全柜Thermo ScientificII 级
移液器（0–2µl、1–10µl、2–20µl、10–100µl、20–200µl、100–1000µl）Thermo Scientific
干式恒温金属浴BiosanTDB-120
PCR 仪SensoQuest012-103
水浴锅MemmertWNB 14

参考文献

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