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放射源校准与剂量学：用于评估LQ α和β参数、辐射给药方案及体内剂量沉积

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DOI：

10.3791/61692

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2021年3月11日

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1Department of Basic Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, West Virginia University, 2Radiation Oncology, West Virginia University, 3School of Medicine, West Virginia University, 4Department of Neuroscience, West Virginia University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

辐射剂量测定提供了一种提高临床前实验准确性的技术，可确保所施加的辐射剂量与临床参数密切相关。本方案描述了在临床前辐射实验各阶段应采取的步骤，以确保实验设计的正确性。

摘要

辐射剂量测定对于在临床前模型中准确递送和重复辐射方案至关重要，以确保高度的转化相关性。在进行任何体外或体内实验之前，必须评估辐照仪的特定剂量输出以及各个实验设计的参数。使用电离室、静电计和固体水模体装置，可以确定等中心处大照射野的剂量输出。采用类似的装置，将电离室替换为放射变色胶片，还可以测定不同深度下小照射野的剂量率。针对癌细胞在辐射处理下的体外克隆形成存活实验是一种成本较低的实验方法，通过将实验数据拟合传统的线性二次模型，可评估细胞系固有的放射敏感性。从这些实验中估计出的模型参数，结合生物有效剂量原理，可用于设计不同的分次照射方案，从而在荷瘤动物实验中实现等效的生物有效剂量。在比较体内放射治疗方案时，这是一个需要重点考虑并校正的因素，以避免因递送的有效剂量差异而导致结果出现潜在的混杂效应。综上所述，本文提供了一种通用方法，用于临床前动物和柜式辐照仪的剂量输出验证、体外放射敏感性评估，以及对小型活体生物中辐射递送的验证。

引言

癌症总体上是美国及全球许多国家的第二大死亡原因1。放射治疗是多种肿瘤亚型治疗的核心手段，约一半的癌症患者接受过放疗2,3。随着放射治疗设备的持续进步以及一些有效的多模式治疗方案的开发，几乎所有类型癌症患者的治疗效果均随时间推移而有所改善4,5,6，但对于某些类型肿瘤的患者，复发率和死亡率仍然较高7,8,9。因此，癌症放射治疗仍是基础与临床研究的活跃领域。许多临床前放射治疗研究采用小型辐照仪对体外模型或动物癌症模型进行辐射照射。在开展大量探索放射生物学机制细节或新型治疗方法的潜在实验过程中，可能会遇到一些常见陷阱，导致得出错误结论、结果重复性差以及资源浪费。这些陷阱主要涉及三个关键方面：辐照仪的剂量测定、体外模型细胞系的表征，以及体内辐照的剂量方案与实验设置。若不事先关注放射治疗研究中的这些基本要素，更高级实验的准确性和可重复性结果将难以实现。

本文所述方案介绍了一种避免或减轻上述问题的通用策略，并借鉴了多种先前开发的、原本独立使用的实验方法。这些不同的方法已被整合，以便有意开展或改进临床前放射治疗实验的研究人员可将其作为可靠的实验框架。该建议框架包括小型动物辐照仪的调试方法、模型癌细胞系基本放射生物学特性的测定方法，以及针对体内肿瘤模型合理设计和实施剂量与分次照射方案的方法。

方案

本方案中涉及实验动物使用的所有步骤，包括动物操作和实验程序，均已获得西弗吉尼亚州摩根敦市西弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号：1604001894）。

1. 剂量输出的测定

  1. 采用本方案，该方案基于美国医学物理学家协会任务组（AAPM TG）61 的“模体中方法”（In-phantom Method）方案10 类似于Xstrahl的调试方案，用于在以下设置条件下，根据特定几何参数确定小动物辐照仪的射束输出。
    1. 将辐照仪设置为以220 kVp和13 mA输出辐射，照射野为开放野（17 cm × 17 cm），位于等中心处，即距离射线源35 cm。此外，使用0.15 mm铜滤片对射线束进行过滤，并采用广焦点模式。某些细胞辐照仪仅含有放射性源，本方案仅适用于X射线辐照仪。
    2. 将固体水模体按以下顺序排列：1 cm 平板、带电离室插槽的 2 cm 平板、2 cm 平板、1 cm 平板。以此顺序堆叠固体水模体可使电离室位于 2 cm 深度处，并预留 4 cm 用于背向散射。参见 图1 用于剂量测定设置的图示说明。
      注意：为了容纳较大且较重的固体水堆叠，作者建议使用定制的3D打印床板，该床板具有可调节支撑，以确保模体堆叠在整个材料表面而非仅中心位置保持水平，并与辐射源保持正确距离。
  2. 使用测量设备（即经ADCL校准的电离室、静电计），以及所用校正因子的说明，可参见 材料表 和 表1 分别。
    注意：ADCL 提供 N 的值k 在不同半值层（HVL，射线束质量的度量）的若干点处，N 的值k 用于该方案的剂量校准应基于该设备实测半值层（HVL）对应的ADCL值插值确定。制造商测量了本设备的HVL，我们据此确定了剂量率输出。
  3. 按照步骤1.1.2中的规定，安装模体堆栈并将电离室插入模体中。
    1. 调整模体堆栈，使其在适当调平后，辐射源到表面的距离（SSD）即辐射源到第一表面的距离为33 cm。
      注意：作者建议制作一个定制的3D打印床板，尺寸需足够支撑固体水模板块。此外，本方案中所使用的床板具有可调节部件，用于调平模体堆叠。
  4. 取三次独立的X射线曝光测量值的平均值，每次曝光时间为一分钟，静电计偏置电压设为300 V。该结果记为M+.
    注意：照射使用仪器设定为 220 kVp 和 13 mA 的条件进行。此设定同样适用于接下来的两个步骤（步骤 1.5–1.6）。为确保使用者安全，在处理过程中请保持仪器门关闭。
  5. 执行另一组三次独立的X射线曝光，每次读数1分钟，电离室静电计偏压设置为-150 V。该结果记为ML.
  6. 执行另一组三次独立的X射线曝光，每次读数1分钟，电离室静电计偏压设置为-300 V。该结果记为MH，或也称为 M-.
  7. 计算 Ppol 和 P离子 使用 公式 1 和 公式 2 如下所述：
    偏振度计算公式 \( P_{\text{pol}} = (|M^+| + |M^-|)/2|M^-|\)，偏振度分析方程。 (公式 1)
    质谱中电离概率的方程，展示质量与速度的变量。 (公式 2)
  8. 使用经校准的数字温度计和气压计测量辐照器内部的温度（摄氏度）和压力（kPa）。然后计算 PTP 如下所述 公式 3.
    注意：此计算假设ADCL使用了标准温度和压力值 22 °C 以及在陈述空气比释动能校准因子的数值时使用101.33 kPa。
    物理图示中的蒸气压方程，P_TP = (273.2+T)/295.2 * 101.33/P (公式 3)
  9. 通过将原始电离室读数 M 乘以相应校正因子来计算校正后的电离室读数 MH，由 P电生理学，Ppol，P离子，以及 PTP。该方程如下所示 公式 4.
    注意：此计算假设ADCL在进行校准时将偏置电压设置为-300 V，这是一种较为常见的做法。
    静态平衡方程，显示分子偶极矩。 (方程 4).
  10. 将校正后的计数室读数再乘以 Nk, [(µen/ p)w空气]水，PQ, cham，以及 P鞘. P鞘 仅在水中测得的数据需要此步骤。因此，对于本方案 P­鞘 仅为1。
    注意：使用本方案中的条件时，后三项的乘积结果为1.0731。该值取决于射线束质量，因此必须已知半值层（HVL）才能确定该数值。1.0731这一数值针对我们所使用的设备具有特异性，仅作为示例提供。为确定P的各项数值Q,cham 以及 [（µen/p)w空气]水 根据您所在单位的具体情况，使用测得的半值层（HVL）并进行插值计算 表 VII，以及 表 VIII，并根据参考射野大小进行校正 图3 和 图4 来自美国医学物理学家协会TG61协议10在本例中，将 N 乘以k 由1.0731提供水的剂量Dw，以ADCL N为假设条件，名义时间为1分钟时，单位为Gyk 单位为 Gy/Coulombs。
  11. 确定所用辐照器的终末效应。X射线最初产生时，其输出在一定时间内逐渐上升至最大值；同样，当X射线源关闭时，其输出也在一定时间内逐渐下降至零。
    1. 考虑此过渡过程的时间或末端效应。可通过将静电计偏置电压设为 -300 V，针对多种时间设置取三次读数的平均值来实现。时间设置分别为 6、12、18、24、30 和 60 秒。
    2. 将静电计读数对时间作图，并拟合最佳直线。1分钟处理的总时间t可通过以下公式计算： 方程 5:
      静力平衡方程 t = 1 + δt/60；时间校正公式；教学资源 (公式 5).
  12. 通过给定的辐照器计算剂量率 方程 6:
    静态平衡公式：Ḋ = D_w/(1+δt/60)，用于说明时间校正方法。 (公式 6)

2. 创建放射变色胶片校准曲线

  1. 所需材料清单见材料表。
  2. 采用与先前方案几乎相同的设置，将胶片置于固体水模体堆叠中2 cm深度处。只要上方有2 cm厚的固体水，下方有4 cm厚的固体水以实现建成和反向散射效应，固体水模体的排列顺序无关紧要。
  3. 使用方案1中已确定的校准剂量，根据公式7计算表2中各剂量对应的照射时间：
    时间计算公式，T=(Dx/D̅)*(60s/min)，数学公式表示。 (公式7)
  4. 准备多片胶片，确保每片胶片尺寸相同，并在整个处理至扫描获取过程中保持相同的方向。可通过在左下角做一小斜切口来标记方向。此后使用的每片胶片必须来自同一批次。
    注：每个待评估的剂量点需准备3个独立重复样本。
  5. 使用48位彩色照片扫描仪对裁剪好的胶片进行扫描，所有校正功能均关闭。确保每张胶片精确放置于扫描床中央。所获得的数据为照射前扫描值，用于确定未曝光时的光学密度11,12。将所有图像保存为.Tiff格式，以避免关键数据被压缩。
    注：作者建议对每张胶片扫描三次，并取三次结果的平均值作为该胶片的单一数值。
  6. 开始对胶片进行辐照：将一片胶片放置于4 cm厚的固体水上，并在其上方再放置剩余的2 cm厚固体水，具体设置如本节前述描述。
  7. 调整模体位置，使胶片到辐射源的距离与之前测定剂量输出时电离室所在位置相同，即辐照仪的等中心点。
  8. 按照上述步骤2.3中计算出的治疗时间，设定某一规定剂量的照射程序。
  9. 对表2中列出的每个剂量重复上述照射过程。
  10. 让胶片在避光条件下静置24小时。
  11. 以与上述相同的方式获取照射后的胶片扫描图像。
  12. 将图像导入ImageJ分析软件，并在红色通道上进行所有测量。
    1. 将.Tiff格式的图像拖入ImageJ。
    2. 点击图像下拉菜单，选择图像菜单中的颜色选项，再从颜色选项中选择“拆分通道”。
    3. 仅使用红色图像通道，利用矩形工具绘制感兴趣区域。按下Ctrl+M，从结果窗口中记录平均值。
    4. 对所有扫描得到的胶片重复步骤2.12.1–2.12.4。
  13. 分别在未曝光和已曝光胶片的中心区域选取一个1 cm × 1 cm的正方形区域，获取其像素值。这些值分别记为PVU(D)和PV(D)，可用于根据公式8计算净光学密度：
    光学密度公式 log(PV_U(D)/PV_(D))，符号，光度分析背景。 (公式8)13
  14. 对每一对胶片图像（包括照射前和照射后）重复步骤2.13。
  15. 绘制剂量与净光学密度的关系图，并将曲线拟合为三次多项式形式 y = ax3 + bx2 + cx + d。示例见图2B。

3. 通过克隆形成实验测定特定癌细胞系的α/β值

注意：以下方案是Franken等人14所述方法的修改版本，见图3。

  1. 将细胞培养至约80%汇合度。本实验应避免使用过度汇合的细胞，因为实验要求细胞处于对数生长期。对于图中所示代表性克隆形成实验结果， 图3C，嗜脑性 MDA-MB-231 乳腺癌细胞在添加了 10% 胎牛血清和青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，并于 37 °C 在加湿培养箱中，含5%二氧化碳。
  2. 以集落形成实验所需的密度接种细胞。接种过程中准确的稀释对于确定实验的铺板效率至关重要。务必设置多个重复孔。
  3. 如果辐射处理需在细胞接种之前进行，请执行此步骤（图3A或者，如果细胞铺板将先于辐射处理，则继续进行步骤 3.4。
    1. 对培养瓶进行所需的辐射处理。其他任何处理（如药物处理）可在该步骤之前或之后的任意时间点进行。对于代表性结果中的 图3C辐射处理在细胞接种后进行，详见步骤 3.4。
    2. 使用首选的胰蛋白酶消化法收集细胞，并制备单细胞悬液。移除培养基后，加入重组酶（例如 TrypLE Express）以使细胞从培养瓶表面脱落。将细胞与酶在37℃孵育约3分钟，直至在光学显微镜下观察到细胞完全脱落。加入等体积的细胞培养基以中和酶活性。将细胞以300 × g离心 g 孵育10分钟，然后用培养基重悬至所需浓度。
    3. 以所需的密度将细胞接种于多个重复孔中。
    4. 首次培养24小时后更换新鲜培养基。
    5. 每2-3天更换一次培养基。
    6. 继续培养细胞，直至对照组菌落的细胞数量超过每菌落50个细胞，约需9–14天。对照组指未接受辐射处理的实验分组。若实验同时使用药物处理，则还需设立另一对照组，该组给予药物处理但不进行辐射处理。
  4. 在接种细胞时进行此步骤 放疗前 (图3B).
    1. 采用偏好的胰蛋白酶消化法收集细胞，并制备单细胞悬液。
    2. 将细胞以所需的密度接种于多个重复孔中。
    3. 让细胞在培养板上贴壁过夜。
    4. 进行所需的辐射剂量处理。在细胞已贴壁于处理培养板的前提下，可在该步骤之前或之后的任意时间点进行其他处理，例如药物给药。对于代表性结果中的 图3C在处理前（步骤3.4），接种1250个嗜脑性MDA-MB-231细胞。随后，在用3 Gy X射线照射前3小时，用15 nM阿霉素处理细胞。
    5. 在最初的24小时后更换培养基。
    6. 每2-3天更换一次培养基。
    7. 将处理后的细胞培养至对照组克隆超过50个细胞，约9–14天。对照组克隆指未接受辐射剂量的处理组。若实验同时使用药物处理，则还需设置另一组对照组，该组给予药物处理但不进行辐射处理。
  5. 从孔板或培养皿中移除培养基，并用 PBS 洗涤。
  6. 用冰醋酸与甲醇按1:7（v:v）配制的溶液固定细胞15分钟。
  7. 去除固定液。
  8. 固定后，在室温下用结晶紫溶液对细胞染色30分钟，若时间允许可延长至2小时，结晶紫溶液浓度为2.5–5.0 mg/mL，溶剂为蒸馏水与甲醇按4:1（v:v）配制的混合液。
  9. 去除染色液，并在大量室温水浴中清洗细胞。
    注意：请勿在流水下冲洗。
  10. 统计各处理组中形成的菌落数量，并计算每块平板的存活分数。
  11. 将存活分数与相应的照射剂量作图，并用指数拟合曲线进行拟合。
  12. 为估算α/β值，利用上述曲线图的指数拟合来估计下方线性二次方程中各可调参数的数值：
    静态平衡方程 SF=e^-α*D-β*D²；指数衰减；数学公式 (方程 9)
    注意：只要照射野足够大，能够容纳培养板或培养皿，细胞照射通常可在等中心处进行，无需准直。本实验方案可能存在的问题包括无克隆形成、细胞迁移明显（虽有清晰的细胞生长但无真正克隆）以及由于在非无菌照射室中处理导致的污染等。

4. 不同实验设计下特异性剂量输出的确定

  1. 确定所需的照射野尺寸及与射线源的距离。
    注意：无论准直器尺寸或其与X射线源的距离如何，准直均会影响剂量率。
  2. 使用固态水模体提供建成效应和背向散射，将胶片以正确方向放置，以最真实地反映实验设计。
    注意：对于任何实验设置，固态水模体可能无法最准确地模拟特定设计。我们建议使用实际实验所用的容器（例如培养皿、多孔板、小型动物模体等）。
  3. 分别对胶片照射1分钟（N=3）和2分钟（N=3）。
  4. 将胶片避光静置24小时。
  5. 按照第2节中的步骤测定每张胶片的净光密度，并利用胶片校准曲线将净光密度转换为剂量。
  6. 根据公式10，将1分钟时的剂量D1确定为该实验设置下的输出剂量率Ḋ，如下所示：
    动态比值方程 \(D_{\text{exp1}} = D_1/1\,\text{min}\)，时间-率分析符号。 (公式10)
  7. 类似地，根据公式11计算2分钟时的剂量：
    化学反应速率计算方程，\(D_{exp2} = D_2/2 \text{ min}\)。 (公式11)
  8. 由于末端效应，上述计算的剂量率可能存在轻微差异。因此，为计算特定实验设计下的Dexp，应采用各个Dexp值的平均值，如公式12所示：
    平均扩散方程，\(D_{\text{avg}}^{\text{exp}}\)，实验扩散测量公式。 (公式12)
  9. 利用该平均值，根据公式13定义此特定设置下达到任意目标剂量所需的照射时间：
    扩散方程：T = D_avg exp / D，用于计算扩散时间。 (公式13)

5. 对荷瘤小鼠在特定解剖部位进行治疗

  1. 使用机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的安全且人道的麻醉技术对小鼠进行麻醉。
  2. 根据实验设计要求，将麻醉后的小鼠固定于适当装置中。
  3. 此步骤为可选步骤，若无法实施，请直接进入步骤 5.6。 使用设备内置的透视摄像机，在不使用准直器且配备铝滤片的条件下获取小鼠的X线片。
  4. 在启用准直器的条件下获取第二张X线片。
  5. 在ImageJ软件中叠加两张X线片，以显示射线束的定位情况。
  6. 根据预先确定的α/β值，确定最合理的给药方案以回答研究问题（例如，若希望模拟总剂量30 Gy、分10次给予、每次3 Gy的照射效应，但仅希望进行4次照射）。使用公式14，假设α/β值为10（该值可在方案3中针对特定癌细胞系确定），并使生物有效剂量（BED）与30 Gy/10 F方案相近，采用总剂量24 Gy、分4次给予、每次6 Gy的照射方案。
  7. 按照预定剂量方案规定的时间对动物进行处理。

6. 体内剂量沉积的组织学验证

  1. 按照方案 5，在处理后1小时内收集目标组织15,16。组织收获后，按照首选的免疫组织化学方案进行操作。以下提供一个示例。
  2. 用冰冻的4%多聚甲醛（PFA）灌注动物。
  3. 在4 °C条件下用PFA进行后固定。
  4. 固定后，在室温下依次用10%、20%和30%蔗糖溶液各固定24小时。
  5. 将组织包埋于明胶中，并在室温下依次用4% PFA和10-30%蔗糖溶液各固定24小时。
  6. 修整组织块，并置于-80 °C环境中30分钟。
  7. 将组织切成20-30 µm的切片。
  8. 在六孔板中以游离切片形式对载玻片进行免疫染色17,18。
    1. 在摇床上用含1.83%赖氨酸、1% Triton和4%热灭活山羊血清的溶液洗涤三次，并透化处理30分钟。
    2. 将切片与抗-γH2AX抗体在4°C孵育24小时，随后与合适的二抗在室温孵育2小时。
    3. 使用合适的封片介质，用玻璃盖玻片封片。
  9. 在荧光显微镜下观察成像。

结果

按照方案1操作将获得以 Gy/min 为单位的剂量率，该数值特定于所使用的照射设备。然而，无论照射设备的类型如何，只要已知剂量率，即可通过方案2生成校准曲线，得到与图2A-B中相似的胶片结果和类似的校准曲线。成功执行方案3将产生界限清晰、染色均匀呈紫色的细胞克隆。所估算的α/β值可与文献报道值或其他处理组进行比较，以评估该细胞系的放射敏感性。利用按照方案2建立并在图2B中显示的校准曲线，方案4将产生两个类似于图2A的胶片样本，可用于估算实验所需的照射时间。如果所用照射设备配备有内置的门控成像相机，则可获取小动物在有无准直条件下的放射影像。将这些图像叠加后，可明确显示准直辐射束相对于被处理小动物的精确位置，如图4A所示。方案5中成功的剂量沉积可通过方案6进行验证。体内或体外系统中发生辐射沉积的一个指标是检测到双链DNA断裂。如图4B所示，同一只小鼠仅右侧半脑接受照射（如图4A所示），结果仅在受照半脑中观察到γH2AX阳性染色。在该图中，细胞核经DAPI染色以显示两点：1）组织学分析过程中抗γH2AX抗体作用的整个脑区范围；2）未受照射的脑半球保持无染色信号。

辐射测量示意图；电离室装置、静电计、温度计、压力表。
图1：用于测定剂量输出的电离室与水等效模体的粗略装置示意图。该图示说明了在辐照仪机箱内使用电离室和固体水等效模体进行剂量测量所需各组件的基本装置。 请点击此处查看此图的放大版本。

光密度分析；(A) 颜色变化，(B) 剂量-反应曲线，放射治疗效应。
图2：使用放射变色胶片生成校准曲线。（A）放射变色胶片随剂量增加而发生颜色变化的代表性示例。左上角（0 cGy）；右下角（2000 cGy）。（B）比较净光密度与剂量的放射变色胶片可能的校准曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

集落形成实验示意图及结果；用于增殖分析的细胞培养。
图3：癌细胞的克隆形成实验。细胞的辐射处理可在接种至六孔板/培养皿之前（A）或之后（B）进行。在图（C）中，展示了按照第3节实验方案操作后，MDA-MB-231乳腺癌细胞成功完成克隆形成实验的代表性图像。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠脑光学成像；X射线与荧光显微镜，脑结构分析。
图4：使用双重叠加放射自显影图像进行定位（如可用）以及通过γH2AX免疫组织化学阳性染色确认剂量沉积。（A）代表性叠加放射自显影图像，显示辐射束的放置位置。（B）代表性结果，显示通过γH2AX信号强度增加证实右侧半球的剂量沉积。请点击此处查看该图的放大版本。

修正因子说明
Nκ空气比释动能校准因子
[(µen/ρ)Wair]water水与空气的质量能量吸收系数比值；约为 1.05
Pq,Cham考虑电离室杆部对光子注量扰动影响的修正；约为 1.022
Psheath考虑保护电离室的护套影响的修正；由于电离室防水，该值为 1
Ppol考虑极性效应的修正因子；在方案 1 中测定
Pion考虑离子复合效应的修正因子；在方案 1 中测定
PTp考虑实验当天温度和压力影响的修正因子；在方案 1 中测定

表1：方案1中测定剂量率所需的校正因子。

剂量N
0.53
13
23
33
43
63
83
103
12*3
15*3
20*3
*仅在单个实验的剂量超过10时才需要。

表2：生成放射变色胶片校准曲线时应使用的剂量。

讨论

上述方案描述了一种简便的辐射剂量测定方法、肿瘤细胞系中α/β值的确定方法，以及乳腺癌脑转移临床前模型中照射实验的简要示例。这些方法可用于研究任何类型的癌症模型，不仅限于乳腺癌脑转移。在本节中，我们将讨论临床前放射治疗实验中涉及的相关复杂因素。

剂量测定包含两个部分：1）使用 Farmer 型电离室校准输出，以确定 X 射线装置的剂量率；2）利用放射变色薄膜建立实用的剂量测量系统。关于输出校准，TG-61 提供了在水中可重复的方法。本方案采用 XStrahl 公司（辐照仪制造商）推荐的 Gammex RMI 457 固态水模体。尽管使用固态水进行相对剂量测定（如归一化至最大剂量的剂量分布曲线或深度剂量曲线）的结果与水中的结果差异优于 1%，但由于固态水的质量能量吸收系数高于水，其绝对剂量存在约 3% 至 4% 的差异。然而，由于所有 XStrahl 系统的安装均采用固态水协议进行输出校准，因此我们未对这些差异进行修正。已知输出剂量后，即可计算出递送目标剂量所需的照射时间。将薄膜置于与 Farmer 型电离室相同的设置中，可使薄膜接受已知剂量的照射。扫描薄膜后可获得光密度值。随后可将薄膜所受剂量与其相应的净光密度（照射前后光密度的差值）作图，从而得到薄膜校准曲线。当实验设置发生变化时，由于剂量率受照射野大小、深度及被照材料的影响，该条件下的剂量率可能发生变化。使用实验设置对薄膜进行照射，可获得其净光密度，再结合薄膜校准曲线即可确定对应的剂量。将该剂量除以薄膜的照射时间，即可得到剂量率。此剂量率可用于计算在特定实验设置下递送目标剂量所需的照射时间。上述方案处理了薄膜剂量测定中的若干细节问题。例如，照射后，薄膜活性层内的化学反应需要约 24 小时才能基本完成。若未等待足够时间，将导致测得的光密度偏低。

任何研究若要实现可重复的剂量测定，了解并理解特定辐照仪的若干关键要素至关重要。尤其需要明确并详细告知其他研究人员所用辐照仪的制造商和型号、辐射源类型（如X射线、放射性源等）、能量、半值层、照射野大小、源到表面距离以及源到等中心距离、被辐照材料的尺寸、辐照材料前的衰减以及辐照后产生的背向散射、实验特定的剂量率、分次照射方案、所使用的精确剂量测定设备以及所采用的剂量测定协议。所有这些信息共同完整地描述了在对任何动物或细胞施加辐射剂量之前，该辐照仪射束的质量特征19。本方案及其他相关方案中另一个重要的信息点是，方案1中获得的剂量率仅仅是所用辐照仪的输出值。对于任何特定实验而言，通过与生成的放射变色薄膜校准曲线（方案2）进行比较，来定义该实验设置下的具体剂量率（方案4），是十分重要的。

体外实验可提供有关癌细胞系放射生物学行为的重要信息。体外克隆形成细胞存活实验能够准确估算并量化细胞系固有的放射敏感性20，有助于设计后续细胞或小型动物实验中的分次照射方案21。具体而言，这些实验可估算线性-二次模型中用于预测放射治疗所致细胞死亡的参数α和β的数值，该模型的方程如下：

静力平衡方程 SF=e^-α*D-β*D²；指数衰减；数学公式。 （公式 9）

其中，SF 是克隆源性存活细胞的存活分数，D 是以 Gy 为单位的辐射剂量，α 和 β 为拟合参数22。α/β 比值可作为细胞放射敏感性的内在度量指标，其值越高，表明细胞系的敏感性越强22。由于该函数关系在剂量上呈非线性，放射治疗分次方案的生物学效应不仅与总照射剂量有关，还取决于分次次数和每次剂量的大小23。生物有效剂量（BED）用于衡量实际递送到组织的生物学剂量，可实现不同分次方案之间的直接比较24,25。BED 的计算仅需提供 α/β 的估计值，其公式如下所示：

生物有效剂量公式，BED=n*D*[1+D/(α/β)]，放射治疗计算。 （公式 14）

其中 n 为剂量 D 的分次次数。克隆源性细胞存活实验可估算 α/β 值，并通过 BED 公式实现放射治疗分次方案的直接比较。如果在实验组内或实验组间，BED 不相等，则可能对组织或器官对放射治疗（或放射治疗与其他治疗方式的联合方案）的反应得出错误结论。例如，2 次 10 Gy 的照射与 4 次 5 Gy 的照射所产生的 BED 并不相同，因此这些给药方案在生物学效应方面无法直接比较。尽管 BED 公式因线性二次模型本身存在局限性而并不完美，但对于广泛的实验治疗条件，其仍能可靠地估算等效效应24,25。

克隆形成细胞存活实验在研究癌症模型中放射治疗效应方面具有重要作用，但体外实验还提供了多种其他选择，可进一步深入探讨癌细胞放射生物学的机制细节。通过对克隆形成细胞存活实验进行简单改进，可用于确定某些放疗增敏化疗药物的作用机制，例如紫杉醇或依托泊苷26,27。进一步的体外实验选择包括免疫细胞化学研究，以检测特定的细胞修复通路，例如双链DNA断裂修复相关的γ-H2AX焦点形成和/或53BP1染色28。在比较单一放疗与联合治疗方案时，尤其是针对特定细胞系探究其作用机制时，这类实验可能尤为有意义。其他实验方法还包括细胞因子检测，以评估细胞对辐射引发的炎症反应的固有作用，或在不同治疗条件下分析细胞死亡方式（如凋亡、坏死、有丝分裂灾难等）29,30,31。此类实验可补充甚至替代动物实验，从而更全面地理解特定癌细胞系的放射生物学特性。无论选择何种附加实验，如方案3所述的标准克隆形成细胞存活实验，始终是细胞系放射生物学特性评估的重要初始步骤。

克隆形成实验与辐射剂量测定为研究者提供了精确规划实验的方法，使其更直接地模拟临床情况。结合临床前癌症小型啮齿类动物模型，可以在体内研究单独辐射或在治疗方案背景下的辐射反应。在使用动物之前，如果实验装置与用于确定剂量输出的装置不同，则确定该特定装置的相对剂量输出至关重要。32,33. 当确定非标准照射野尺寸的剂量率时 <10 mm时，由于小野内的准直问题以及部分容积平均效应，电离室的测量准确性会降低33使用放射变色膜结合体内免疫组织化学实验，过去已被用于确定输出量和剂量沉积。16,34,35,36,37,38.

披露

作者无任何披露事项。

致谢

作者感谢西弗吉尼亚大学显微镜与动物模型成像设施提供设备支持，该设施由资助号 P20GM103434 支持。此外，本研究 得到了 美国国立卫生研究院普通 医学科学研究所资助号 P20GM121322、国家癌症研究所资助号 F99CA25376801 以及 Mylan 讲席捐赠基金的支持 。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
冰醋酸Sigma-AldrichA6283本品或性能相当的冰醋酸产品均可使用。
结晶紫Sigma-AldrichC6158本品或性能相当的结晶紫产品均可使用。
数字气压计Fisher Scientific14-650-118用于压力和温度测量。
静电计Standard ImagingCDX 2000B需由ADCL校准；需要修正因子，Pelec
胶片GafchromicEBT3 Film每包25张；校准用胶片与实验用胶片必须来自同一批次
电离室FarmerPTW TN30013由ADCL在两个校准点进行校准
甲醇Sigma-Aldrich34860本品或性能相当的甲醇产品均可使用。
光扫描仪EpsonPerfection V700同等型号包括V800、V10000、V11000、V12000
XenXXstrahlNA所使用的辐照装置。

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放射源校准与剂量学：用于评估LQ α和β参数、辐射给药方案及体内剂量沉积
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