本文介绍一种快速、直接的体内CRISPR/Cas9筛选方法，该方法通过超声引导下的子宫内胚胎慢病毒注射，同时评估多个基因在免疫功能健全小鼠皮肤和口腔中的功能。
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本文内容
摘要
摘要
基因修饰小鼠模型（GEMM）在评估基因功能、模拟人类疾病以及作为临床前模型用于探索治疗策略方面发挥了重要作用。然而，这类模型在时间、人力和成本上的高投入限制了其在系统性基因功能分析中的应用。近年来，基因组编辑技术的进步克服了这些局限，使得能够在小鼠特定器官内以多重化和快速的方式直接产生特定的基因扰动。本文介绍了一种基于CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列）的方法，可在小鼠皮肤和口腔黏膜上皮中生成数千个基因敲除克隆，并提供详细的操作步骤方案，以实现直接在体基因编辑 体内 CRISPR 筛选肿瘤抑制基因。该方法可应用于其他器官或其他CRISPR/Cas9技术，例如CRISPR激活或CRISPR失活，以研究基因在组织稳态或多种疾病状态下的生物学功能。
引言
在后基因组时代，癌症研究面临的挑战之一是从海量的基因组数据中挖掘出导致癌症的基因突变，并识别出基因网络中可作为治疗靶点的关键节点。尽管生物信息学分析在实现这些目标方面提供了巨大帮助，但建立高效的体外和体内模型仍是解析生物系统与疾病状态复杂性以及推动药物研发的前提条件。虽然传统的转基因小鼠模型已被广泛用于体内癌症遗传学研究，但其高昂的成本、耗时长以及劳动强度大等特点，严重限制了对现代基因组学所揭示的数百个潜在癌症基因进行系统性分析。为克服这一瓶颈，我们将一种先前建立的超声引导下子宫内注射技术1,2与CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列）基因编辑技术3相结合，能够在单只小鼠的皮肤和口腔中同时诱导并研究数百个基因的功能缺失突变。
本文所述方法利用超声引导，将经过改造的慢病毒注射到胚胎发育第9.5天（E9.5）活体小鼠胚胎的羊膜腔内。携带CRISPR/Cas9组分的慢病毒载体可转导单层的外胚层表面外胚层，该结构随后发育为皮肤和口腔的上皮组织。皮肤由外层的表皮、基底膜及真皮层组成。表皮是一种复层上皮，其最内层为基底层，该层与基底膜保持接触，并具有增殖能力和干细胞潜能。基底层进一步分化产生上方的棘层、颗粒层和角质层2,4。谱系追踪研究表明，这种直接体内CRISPR/Cas9方法可对基底层中持续存在于成年期的组织驻留干细胞进行遗传操作。由于慢病毒滴度可调节至在E9.5时期以克隆密度转导表面外胚层，因此该方法可用于构建嵌合小鼠，其体内可携带数千个独立的基因敲除克隆。随后可通过高通量测序以多重方式分析CRISPR/Cas9介导的基因失活在这些克隆中的效应5。
我们最近采用该方法评估了在人类头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中呈现反复突变的484个基因的功能5. 头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种破坏性极强的癌症，死亡率高达40–50%，是全球第六大常见恶性肿瘤th 全球最常见的癌症6头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）起源于上呼吸道或口腔黏膜，与吸烟、饮酒或人乳头瘤病毒（HPV）感染相关。皮肤鳞状细胞癌（SCC）为皮肤肿瘤，是人类中第二常见的癌症7皮肤鳞状细胞癌和头颈部鳞状细胞癌在组织学和分子特征上非常相似，大多数病例表现出 TP53、PIK3CA、NOTCH1 和 HRAS 的改变8尽管仅有少数基因以较高频率发生突变，但已发现有数百个基因以较低频率发生突变（< 5%），这一现象通常被称为长尾分布。由于大多数长尾基因缺乏生物学或临床验证，我们利用体内CRISPR筛选技术，在具有致瘤倾向且携带致敏突变的小鼠中对这些基因的功能缺失进行建模 p53, Pik3ca 或 Hras 并鉴定出多个与之协同作用的新型肿瘤抑制基因 p53, Pik3ca 或 Hras 诱导肿瘤发生5.
本文介绍了一种详细的实验方案，用于构建多重sgRNA慢病毒CRISPR文库，并在小鼠表层外胚层中进行CRISPR/Cas9基因敲除筛选。值得注意的是，该方法可进行调整，以整合其他基因操控技术，如CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR干扰（CRISPRi），或经修改后靶向小鼠其他器官系统，以研究基因功能。
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方案
本方案已获多伦多大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照其规定执行。
1. 混合CRISPR文库的设计与克隆
- 从 Broad Institute sgRNA 设计工具（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）或 CHOPCHOP 服务器（https://chopchop.cbu.uib.no）等资源中，选择 4-5 个靶向小鼠目标基因的 sgRNA。同时从例如 Sanjana 等人9 提供的序列中选择相同数量的非靶向 sgRNA，以构建规模相当的非靶向对照 gRNA 文库。
- 在构建 sgRNA 文库时，需确保每个 sgRNA 在目标器官系统中有足够的覆盖度。以小鼠皮肤为例，E9.5 时期的表皮为单层结构，包含约 150,000 个细胞，其中大多数具有干细胞潜能4。若慢病毒转导的感染效率为 15–20%，则在 E9.5 时期仅有 18,000–24,000 个细胞被转导。应据此合理设计实验规模。
- 为克隆和扩增这些 sgRNA 文库，需在 sgRNA 的 5’ 和 3’ 末端添加 BsmBI 酶切位点以及引物结合的 DNA 序列，并将最终全长寡核苷酸序列作为混合寡核苷酸芯片进行合成订购（图 1A）。
- 若需在单个芯片上多重整合不同文库，请添加文库特异性的引物序列。
- 使用相应的引物对，从混合寡核苷酸芯片中分别扩增各个文库。在 PCR 管中混合 25 µL 的 2x 聚合酶预混液、20 µL 无 DNase/RNase 水、5 ng 寡核苷酸芯片 DNA、2.5 µL 相应的正向引物和 2.5 µL 相应的反向引物。进行 12–15 个循环，PCR 条件为：每个循环 98 °C 变性，63–67 °C 退火，72 °C 延伸。
- 将 PCR 产物在 2.5% 琼脂糖凝胶上电泳，并使用凝胶 DNA 纯化试剂盒纯化约 100 bp 的 PCR 产物。
- 准备载体质粒。
- 在 50 µL 反应体系中，用 2 µL BsmBI 酶在 55 °C 下消化 5 µg 含 Cre 重组酶的 pLKO-Cre stuffer v3 质粒 1 小时，随后根据制造商说明加入 1 µL 碱性磷酸酶，在 37 °C 孵育 45 分钟。
注：含 Cre 重组酶的 pLKO-Cre stuffer v3 质粒是一种基于慢病毒的质粒，含有 Cre 重组酶，可在小鼠细胞中切除 Lox-Stop-Lox 盒子，同时具有 U6 启动子以驱动 sgRNA 和 tracrRNA 的表达。该质粒有含 Cas9 和不含 Cas9 的版本，可从 Addgene 获取，编号分别为 #158030 和 #158031。 - 将消化后的 DNA 在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，并使用凝胶 DNA 纯化试剂盒纯化 7 kb 的线性化载体条带。注意，应同时可见一条 2 kb 的填充片段条带，表明酶切成功。
- 在 50 µL 反应体系中，用 2 µL BsmBI 酶在 55 °C 下消化 5 µg 含 Cre 重组酶的 pLKO-Cre stuffer v3 质粒 1 小时，随后根据制造商说明加入 1 µL 碱性磷酸酶，在 37 °C 孵育 45 分钟。
- 设置连接反应以构建 sgRNA 质粒文库。
- 将 1 µg 纯化的载体与 30 ng 纯化的 PCR 插入片段混合，加入 2 µL BsmBI、5 µL T4 DNA 连接酶、10 µM ATP 及 BsmBI 特异的 1x 缓冲液。将连接反应混合物在 37 °C 下孵育过夜。另设一个对照管，包含上述所有组分但不加 PCR 插入片段，作为阴性对照。
- 次日早晨，使用寡核苷酸纯化试剂盒纯化连接产物，并用 7 µL 无 RNase/DNase 水洗脱。
- 将文库电转化至感受态细胞。
- 在预冷的电转杯（1.0 mm）中，将 2 µL 洗脱的 sgRNA 文库或阴性对照连接产物加入 25 µL 已解冻的感受态细胞中，置于冰上。按照制造商协议进行电转化（10 µF，600 欧姆，1800 伏）。电击后 10 秒内向电转杯中加入 975 μL 恢复培养基（或 SOC 培养基）。
- 将电转化后的细胞转移至培养管中，在 37 °C 细菌摇床中以 300 rpm 振荡培养 1 小时。
- 估算转化效率及每个 sgRNA 的文库覆盖度。
- 取 10 μL 含有经 sgRNA 文库或阴性对照连接产物电转化的细胞反应液，加入 990 μL 恢复培养基中，充分混匀，制备 100 倍稀释液。
- 取 10 μL 稀释后的转化混合液，涂布于预热的 10 cm LB + 氨苄青霉素（100 µg/L）琼脂平板上。此操作相当于对转化子进行 10,000 倍稀释，可用于计算转化效率。将平板在 30 °C 下孵育 14–16 小时。
- 将剩余的转化反应液涂布于平板：将复苏后的细胞每 100 μL 均匀涂布于共 10 个预热的 15 cm LB + 氨苄青霉素琼脂平板上。在 30 °C 下孵育 14–16 小时。注意：在 30 °C 培养可最大限度减少病毒质粒中两个长末端重复序列之间的重组。
- 为评估克隆成功率，计算转化效率。计数来自 sgRNA 文库或阴性对照连接产物的稀释平板（10 cm 平板，步骤 1.8.2）上的菌落数。阴性对照组应无菌落或仅有极少数菌落。将菌落数乘以 10,000，得到转化子总数。
注：所计数的总菌落数代表文库覆盖度，应至少达到每个 sgRNA 200 倍以上的菌落。- 确保一个包含 2000 个 sgRNA 的文库至少有 400,000 个菌落。若菌落数不足，需重复实验并增加电转化次数。
- 质量控制：从稀释平板中挑取 20 个菌落，每个菌落分别接种至含 3 mL LB 培养基 + 氨苄青霉素的独立培养管中。在 30 °C 下以 250 rpm 振荡培养过夜。按照制造商说明使用质粒小提试剂盒纯化质粒 DNA，并使用 U6 引物（5’-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3’）对全部 20 个质粒 DNA 样本进行 Sanger 测序，以确认每个样本含有不同的 sgRNA 序列。
- 收集每个 15 cm 平板上的菌落。
- 加入 7 mL LB 培养基，用细胞刮刀将菌落从 LB 琼脂平板上刮下。使用 10 mL 移液管将细胞转移至 2 L 无菌锥形瓶中。对所有平板重复此操作，并将细菌汇集至 2 L 锥形瓶中。在 30 °C 下振荡培养 2–3 小时。离心培养物并收集沉淀。
- 使用大提质粒纯化试剂盒纯化质粒 DNA。
- 附加质量控制：取 1 ng 大提质粒的 sgRNA 文库 DNA，根据制造商说明使用下一代测序引物进行 PCR 反应。可通过深度测序平台验证文库中所有 sgRNA 的代表性。
2. 适用于体内转导的高滴度慢病毒的制备
注意：本方案的此部分所有步骤均须在BSL2+级设施中的II级A2型生物安全柜内进行。293FT细胞，尤其是293NT包装细胞，可实现更高的病毒产量。转染时应使用低代次（
- 制备病毒包装细胞。
- 第1天，将HEK293T细胞以35%汇合度接种于6个经多聚-L-赖氨酸包被的15 cm培养皿中，培养基为DMEM + 10% FBS + 1%青霉素-链霉素溶液（w/v）。将细胞在37°C、5% CO₂培养箱中过夜培养 37 °C，5% CO₂2.
- 当培养的细胞融合度达到70–80%且分布均匀时，将生长培养基更换为25 mL不含血清和抗生素的DMEM培养基。
- 换液时应缓慢沿瓶壁加入培养基，因为 HEK293T 和 293NT 细胞容易从组织培养塑料表面脱落
- 制备转染混合物。
- 添加 65 µg psPAX2 慢病毒包装质粒， 43 µg 表达VSV-G的包膜质粒pMD2.G， 65 µg sgRNA文库质粒和 240 µL 将1 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）加入6 mL DMEM中，涡旋混匀。
注意：转染时务必使用未开封或刚刚开封的 DMEM 培养基，因为此步骤的 pH 值至关重要，而 DMEM 开封后会随时间推移逐渐变碱。 - 室温孵育15分钟。该转染混合物足以用于接种于6个15 cm培养皿（表面积870 cm²）的细胞2 表面积。根据实验需求按比例调整转染混合物的用量。
- 添加 65 µg psPAX2 慢病毒包装质粒， 43 µg 表达VSV-G的包膜质粒pMD2.G， 65 µg sgRNA文库质粒和 240 µL 将1 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）加入6 mL DMEM中，涡旋混匀。
- 病毒包装细胞的转染
- 孵育15分钟后，将1 mL转染混合物逐滴加入每块15 cm培养皿中，确保覆盖整个培养皿表面。继续孵育于 37 °C，5% CO₂2 8 小时。
- 孵育后，移除含有转染混合物的无血清培养基，向15 cm培养皿中加入30 mL常规培养基，在37°C、5% CO₂条件下继续培养48 h 37 °C，5% CO₂2.
- 48小时后，收集病毒上清液，并通过滤器过滤 0.45 μm PVDF滤膜。保留1 mL病毒上清液，于-80 °C 用于质量控制和病毒滴度测定。
- 使用SW28转子头，在高速离心机中通过蔗糖梯度离心浓缩病毒上清液。
- 用70%乙醇清洗超速离心管，随后用PBS冲洗3次。将约30 mL病毒上清液均匀分配至6根超速离心管中。
- 轻轻将4 mL 20%蔗糖溶液（20 g蔗糖溶于100 mL PBS中）用移液器加至每根试管底部。将六根超速离心管放入SW28摆动桶的六个位置中，并通过添加或移除病毒上清液，精确平衡每一对相对的摆动桶。
- 离心病毒上清液于 4 °C 至少 2 小时，最长 4 小时，于 80,000 x g 和 4 °C离心完成后，小心弃去上清液。
- 将超速离心管倒置在无菌软纸巾上，排干剩余上清液至少2分钟，并用软纸巾擦去管内壁残留的上清液液滴，以去除任何残余培养基。管底可能出现少量灰白色沉淀。
- 加入20-25 μL 向每管中加入冰冷的新鲜PBS。用石蜡膜密封各管，置于冰上，于轨道摇床中轻轻振荡孵育约2小时。
- 使用一种 20 μL 移液器小心吹打并重悬第一管中的沉淀，注意避免产生气泡。将上清转移至下一管，重复此操作，直至所有病毒沉淀均被重悬并合并至一管中，总体积约为120-150 μL 体积。将该高滴度病毒悬液在冰上轻轻振荡孵育约2小时。
- 将病毒悬液转移至1.5 mL微量离心管中，离心该管 4 °C 在预冷的台式冷冻离心机中以12,000离心 x g 2 分钟。小心分装澄清的病毒上清液 10 μL 分装至多个独立的0.2 mL离心管中，于-80 °C弃去管底的沉淀物，因其会在胚胎注射过程中堵塞针头。
- CRISPR 慢病毒文库混合物的滴定
注意：所得病毒悬液应实现约 2,000 倍的浓缩，最终病毒溶液的病毒滴度应达到 107-109，足以满足下文所述的100多例E9.5手术的需求。- 将 Seed R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato 原代角质形成细胞或任何其他 Cre 报告细胞系接种至 2 × 6 孔板中。
- 当细胞融合度达到约40%时，即可进行转导。此时，测定一个孔内细胞数量，以便后续计算病毒滴度。将Cre报告细胞的培养基更换为添加了补充成分的生长培养基 10 µg/mL 聚凝胺（=六亚甲基溴化铵）
- 稀释 1 μL 浓缩病毒液与2 mL培养基混合，分别加入0、10、50 200 µL 稀释后的病毒悬液及50, 200 µL 来自步骤2.4的未浓缩病毒，混匀后过夜培养于 37 °C，5% CO₂2.
- 第二天移除含有病毒的培养基，用 PBS 洗涤细胞，然后更换为正常的生长培养基。此时的上清液仍被视为病毒废弃物，必须按照机构的 BSL2 规定进行处理。
- 转导后约 36–48 小时，通过流式细胞术（FACS）评估 Cre 介导的 Lox-STOP-Lox 盒重组及 tdTomato 的表达。计算病毒滴度。使用以下公式计算每毫升菌落形成单位（cfu/mL）：
注意：通过比较浓缩后的病毒悬液与其未浓缩的病毒上清液，可评估（1）病毒的产生效果以及（2）病毒的浓缩效果。 Alternatively，可采用qRT-PCR方法测定病毒滴度。10大规模生产与浓缩慢病毒也可采用两步浓缩法，即先使用浓缩柱进行浓缩，再进行超速离心，具体步骤如前所述。2.
3. 超声引导下的手术与注射
注意：该技术改编自文献4,11。针对表面上皮转导的显微注射必须在胚胎发育第9.5天（E9.5）进行，此时表面外胚层仍为单层结构，而在E10开始形成表层上皮（periderm）后，将阻碍对该基底层的转导。建议在周五安排小鼠交配，以便最早在下周一获得E9.5的胚胎。为获得最佳的CRISPR/Cas9效率，建议使用Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP小鼠（Jackson Laboratory #024857）12。
- 在预定手术日期前10天，安排合适的雄性和雌性小鼠进行定时交配以获得孕鼠。
- 在接下来的几天内检查阴栓以识别可能怀孕的小鼠。在计划手术前一天（即E8.5）使用超声波确认妊娠状态。
- 准备改良的培养皿。
- 使用双面胶带将硅胶膜粘贴在培养皿底部，覆盖圆形开口。用锋利的剪刀在硅胶膜上剪出一个2 × 10 mm的椭圆形开口。
- 微注射系统的准备
- 使用厚壁玻璃毛细管，通过微移液器拉制仪制备注射针，设置参数如下：气压 = 200；加热 = 769；拉力 = 0；速度 = 140；时间 = 100。
- 使用精细剪刀剪去针尖，使其直径约为30 μm。使用针头磨削器在细粒度磨砂板上以定期润湿的方式磨出20°斜面，持续约20分钟。
- 使用10 mL注射器连接26 G1/2针头，推动70%乙醇对微注射针进行灭菌。再使用装有矿物油的10 mL注射器和26 G1/2针头反向填充微注射针，确保针内无气泡。
- 根据制造商说明，将微注射针安装到显微操作器上。
- 用病毒sgRNA文库装载注射针。
- 将10 μL病毒悬液滴加至固定在平坦表面的Parafilm膜上。
- 使用显微操作器排出矿物油。针内保留少量油可防止慢病毒接触活塞。缓慢吸取约4–5 μL病毒悬液，避免引入气泡。
- 使用异氟烷诱导室对怀孕小鼠进行麻醉。将氧气调节器设为1 L/min，异氟烷蒸发器设为2%。约3–5分钟后通过脚趾夹捏测试判断动物是否已麻醉。
- 将麻醉后的小鼠仰卧于加热手术台（40 °C）上，用手术胶带固定四肢，并连接鼻罩麻醉管，持续供给异氟烷和氧气直至手术完成。
- 若未在E8.5确认妊娠，则在此步骤确认E9.5妊娠状态。
- 取少量脱毛膏（约半茶匙）涂抹于腹部，用棉签将其均匀涂抹在3 × 3 cm区域。
- 2–3分钟后，用纱布或纸巾轻轻擦去脱毛膏，并用PBS和70%乙醇清洁该区域。
- 使用超声探头和耦合剂检查小鼠胚胎发育至E9.5。注意：此步骤也可在前一天（E8.5）完成，以节省实际手术日的时间。
- 去除超声耦合剂，并依次使用PBS和70%乙醇擦拭消毒。
- 皮下注射0.02 cc的布托啡诺镇痛剂给孕鼠。
- 外科暴露子宫
- 使用无菌镊子和剪刀，在小鼠皮肤上做一条长约2 cm的纵向切口。
- 使用钝头镊子将切口周围的皮肤与腹膜分离。
- 使用无菌镊子和剪刀剪开腹膜。
- 使用钝头镊子轻轻拉出左右两侧子宫角，并计数胚胎数量。
- 将大部分子宫角重新送回腹腔，仅保留含有3个胚胎的一侧子宫角远端暴露在外。
- 使用钝头镊子，将含3个胚胎的子宫部分轻柔地推拉通过改良培养皿中硅胶膜上的开口。
- 使用橡皮泥块固定培养皿。
- 使用硅胶模具在培养皿内稳定含三个胚胎的子宫。用锋利刀片压平胚胎侧的硅胶塞。
- 向培养皿中加入无菌PBS。通过按压孕鼠腹部使硅胶膜紧贴培养皿底部，防止液体泄漏。
- 将超声探头移入培养皿，置于最上方胚胎上方约0.5 cm处，调整平台位置，使羊膜腔在超声图像中清晰可见。
- 小心将注射针对准改良培养皿。使用显微操作器将针尖置于距离最上方胚胎约5 mm的位置。然后前后微调针头，移动至其尖端在超声图像中最亮的平面上。
- 使用显微操作器将针头穿过子宫壁进入羊膜腔。
- 注射含有sgRNA文库的慢病毒。
- 预先将注射器设定为62 nL注射体积和慢速注射模式。微注射器可编程控制以慢速或快速注入特定体积。
- 按压注射按钮8次，每只胚胎共注射496 nL。根据实际需要和病毒滴度调整注射体积。当病毒滴度为1 × 108 pfu/mL、注射体积为496 nL时，感染率约为30%。
- 对另外两个胚胎重复相同操作。
- 抬起超声探头并移除硅胶塞。
- 使用无菌棉签轻轻将3个胚胎推回小鼠腹腔。
- 轻柔拉出下一组3个胚胎，重复注射过程，直至完成所需数量的胚胎注射。
注意：麻醉时间不得超过30分钟，因为孕鼠超过该时间后胚胎流产风险显著增加。经验丰富的外科医生可在30分钟内完成最多12个胚胎的注射。
- 抬起超声探头，移除带针头的显微操作器，吸出PBS并取出培养皿。使用无菌擦拭纸吸干腹腔内可能积聚的PBS。
- 使用可吸收缝线关闭腹膜切口。使用两枚皮肤钉合器关闭腹部皮肤切口。
注意：在进行超声引导下的宫内手术时，必须格外注意维持清洁环境，尽可能保持无菌状态，避免任何可能的污染物。若同一天需进行多台手术，应使用 bead sterilizer 对解剖器械进行灭菌，并用乙醇清洁所有接触小鼠组织的设备。这将显著提高术后胚胎的存活率。本方法的手术胚胎存活率稳定在80–100%之间。 - 术后护理。
- 让怀孕雌鼠在加热笼中恢复，并观察15–30分钟。
- 检查阴道是否有出血，这是流产和并发症的早期征兆。为缓解术后疼痛，手术后两天内每天给予两次镇痛药。
- 使用荧光解剖显微镜、荧光蛋白手电筒配合滤光眼镜，或通过耳组织或尾尖样本的基因分型检测整合的病毒颗粒，来鉴定被转导的胚胎或新生Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP小鼠。
注意：在出生后第3天前（毛发开始生长前）使用荧光显微镜鉴定小鼠效果最佳。 - 为确保CRISPR文库具有足够的覆盖度，需根据以下参数计算覆盖度：E9.5小鼠表层外胚层约含150,000个细胞；约20%的转导率可导致最低的双重感染率（约每10个被感染细胞中有1个双重感染）4,5,11；在20%感染率下，每只胚胎有30,000个被感染细胞。应确保每个sgRNA至少转导100个独立细胞。例如，包含2000个sgRNA的文库需要2 × 105个细胞，即6–7只动物。
4. 深度测序流程
- 当达到实验终点（如肿瘤形成或其他表型）时，处死小鼠并收获目标组织。使用血液和组织DNA提取试剂盒，按照制造商提供的说明书纯化基因组DNA。在开始肿瘤组织DNA提取前，需用DNA Erase清洁工作台面，并远离质粒操作区域进行实验。
注意：为便于计算随时间变化的sgRNA倍数变化，需制备参考样本。感染后3天的转导胚胎或转导细胞（见步骤2.6）可作为参考样本，用于确定原始文库中sgRNA的代表性。 - 以100 ng – 1.5 μg基因组DNA为模板，在50 μL预扩增PCR1反应体系中使用表1所列的外侧引物，并按照表2所述PCR程序进行扩增。设置足够数量的反应以获得所需的测序覆盖度。
注意：条形码PCR反应应在实验室独立专用区域或经DNA Erase彻底清洁的细胞培养超净台内进行，以防污染。每块PCR板均应设置以水为模板的阴性对照，以确认无污染发生。 - 将所有PCR1反应产物混合后，取20 μL在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，验证是否成功扩增出600 bp条带。
- 以5 μL混合后的PCR1产物为模板，在50 μL PCR2反应体系中使用表3所列的特异性条形码引物组合，并按照表4所述PCR程序进行扩增。将50 μL PCR2产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶回收试剂盒按照制造商说明书纯化200 bp条带。
注意：预扩增步骤仅适用于复杂转导组织的扩增。若扩增单个肿瘤（推测由单克隆细胞发展而来，因此仅含单一sgRNA），可跳过预扩增PCR1步骤，直接进行PCR2。 - 采用荧光定量法测定DNA浓度，并送至测序平台进行深度测序（例如每个肿瘤100万条读长）。
- 使用仅允许无间隔比对的Bowtie v1.2.3将测序读段比对至sgRNA文库13。通过bowtie-build命令输入fasta格式的sgRNA序列构建bowtie索引。使用bowtie命令并设置参数-m 2 -v 1进行读段比对，该参数允许比对过程中最多出现两个错配，并剔除能比对到多个文库sgRNA序列的读段。通常情况下，超过80%的读段可在上述参数下成功比对。
- 使用MAGeCK count命令，以比对后的文件为输入生成读段计数表14。sgRNA计数表可用于后续分析，例如鉴定差异表达的sgRNA（MAGeCK）及筛选必需基因（BAGEL）。
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结果
图1A展示了在单个12k或92k寡核苷酸芯片中以经济高效的方式多重化多个定制CRISPR文库的寡核苷酸设计。在选定sgRNA（以蓝色标注）后，寡核苷酸设计需包含限制性酶切位点（橙色标注的BsmBI）以及文库特异性的PCR引物对（以绿色标注）。通过为不同文库使用独特的引物对组合，可在同一寡核苷酸芯片中设计多个文库。在使用特定PCR引物对扩增文库时，务必设置仅含水的阴性对照，并将所有反应产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测。阴性对照泳道在100 bp处不应出现任何条带，而文库扩增的泳道应仅出现一条100 bp的单一条带。若无条带出现，需确认所选PCR引物对是否合适。图1B展示了克隆文库的质量控制步骤，以及慢病毒的制备与浓缩流程。从克隆到转导的整个过程中，应确保sgRNA的均等代表性。对质粒DNA以及经慢病毒文库转导的细胞中PCR扩增后的DNA进行高通量测序时，其测序读数应呈现高度相关性。任何偏差均需仔细分析，以确定sgRNA代表性的丢失发生在慢病毒制备之前还是之后。若质粒DNA中的sgRNA测序读数已显示代表性不均，则必须谨慎重...
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讨论
CRISPR/Cas9 基因组编辑技术已广泛应用于体外和体内研究，以探究基因功能和细胞过程。大多数体内研究采用将经过 CRISPR/Cas9 基因编辑的细胞移植到动物模型中（同种移植或异种移植）的方法。尽管这是一种研究癌症遗传学和细胞功能的有力工具，但它仍然缺乏天然的组织微环境，并可能引发损伤和/或免疫反应。
为克服这些挑战，近年来多个研究团队开创了直接在体 CRISPR 技术，建立了多种可同时发生的自发性小鼠模型15,16,17,18。这些研究通常依赖腺相关病毒（AAV）将 sgRNA 递送至靶器官。AAV 可产生极高的滴度，从而便于制备体内操作所需的高滴度病毒。然而，由于 AAV 与慢病毒不同，无法稳定整合至基因组 DNA 中，因此严重限制了可分析基因的数量，通常仅能分析约 40–50 个基因，使得 sgRNA 文库的检测变...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了加拿大卫生研究院项目资助（CIHR 365252）、克伦比尔基金会以及安大略研究基金研究卓越计划第八轮（RE08-065）的支持。Sampath Kumar Loganathan 获得了加拿大癌症协会博士后奖学金（BC-F-16#31919）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 微米滤膜 | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k 或 92k 寡核苷酸芯片 | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm 细胞培养板 | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| 碱性磷酸酶 | NEB | M0290L | |
| 氨苄青霉素 | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| 铬制肠线缝合线 | Covidien | ||
| 深度测序（Next-Seq 或 Hi-Seq） | Illumina | ||
| DNA 纯化试剂盒 | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy 血液与组织 DNA 提取试剂盒 | Qiagen | 69506 | |
| Endura 电转感受态细胞 | Lucigen | 60242-1 | |
| 玻璃毛细管 | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T 细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| 高速离心机 | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB 琼脂 | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P97 | |
| 矿物油 | Sigma | M5904 | |
| 质粒小提试剂盒 | Frogga Bio | PDH300 | |
| 小鼠氧气麻醉系统 | Visual Sonics | ||
| Nanoject II 微操作仪 | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1（BsmBI 缓冲液） | NEB | R0580L | |
| 针头研磨器 | Sutter Instrument | BV-10 | |
| 寡核苷酸纯化试剂盒 | Zymo research | D4060 | |
| PAGE 纯化的 Illumina 测序引物 | IDT DNA | ||
| PEI（聚乙烯亚胺） | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast 建模黏土 | |||
| 带中央开口的培养皿 | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 聚合酶 2x 预混液 | NEB | M0494L | |
| Qubit 荧光定量系统 | Invitrogen | Q33327 | |
| 半圆形硅胶塞 | Corning | ||
| 硅胶膜 | Visual Sonics | ||
| T4 DNA 连接酶 | NEB | M0202L | |
| 超速离心管 | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 超声成像系统 | Visual Sonics |
参考文献
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