方法文章

从高粱叶片组织中分离组蛋白用于潜在表观遗传标记的自上而下质谱分析

DOI：

10.3791/61707

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2021年3月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, 3Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, 4West Side Research and Extension Center, University of California, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

本文内容

摘要

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本方案旨在从高粱叶片材料中有效提取完整组蛋白，用于分析组蛋白翻译后修饰，这些修饰可作为潜在的表观遗传标记，有助于培育抗旱作物。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

组蛋白属于真核生物中高度保守的一类蛋白质，可将DNA包装成染色质的功能单位——核小体。组蛋白的翻译后修饰（PTMs）具有高度动态性，可由特定酶类进行添加或去除，在基因表达调控中发挥关键作用。在植物中，表观遗传因素（包括组蛋白PTMs）与其对环境的适应性响应密切相关。深入理解表观遗传调控的分子机制，将为创新性的生物工程解决方案带来前所未有的机遇。本文介绍一种从高粱叶片组织中分离细胞核并纯化组蛋白的实验方案。所提取的组蛋白可通过在线反相（RP）液相色谱（LC）耦合的自上而下质谱（MS）技术，以完整形式进行分析。该方法可有效鉴定同一组蛋白蛋白形式上多种PTMs的组合模式及化学计量关系。此外，利用自上而下的LC-MS工作流程还可检测组蛋白尾部的剪切现象，从而获得核心组蛋白（H4、H2A、H2B、H3）的全局PTM谱。我们此前已应用该方案对来自大规模田间试验的高粱叶片组织进行组蛋白PTM谱型分析，旨在鉴定与抗旱性相关的表观遗传标记。该方案还可进一步调整和优化，用于染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）或类似植物中组蛋白PTMs的研究。

引言

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干旱的严重程度和发生频率日益增加，预计将影响谷类作物的产量1,2。高粱是一种重要的谷类粮食和能源作物，以其在缺水条件下出色的耐受能力而著称3,4。我们正致力于深入理解干旱胁迫、植物发育与高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]表观遗传学之间相互作用的分子机制。我们先前的研究已证明，在干旱适应及分子水平响应过程中，植物与其根际微生物组之间存在密切关联5,6,7。该研究将为利用表观遗传工程使作物适应未来气候条件开辟道路。作为表观遗传学研究的一部分，我们的目标是探究影响植物体内基因表达的蛋白质标记物。

组蛋白属于真核生物中高度保守的一类蛋白质，能够将DNA包装成核小体，作为染色质的基本结构单位。组蛋白的翻译后修饰（PTMs）受到动态调控，以控制染色质结构并影响基因表达。与其他表观遗传因子（如DNA甲基化）类似，组蛋白PTMs在多种生物学过程中发挥重要作用8,9。基于抗体的检测方法（如蛋白质印迹）已被广泛用于鉴定和定量组蛋白PTMs。此外，染色质免疫沉淀-测序（ChIP-seq）可有效研究组蛋白PTMs与DNA之间的相互作用10。在ChIP-seq中，利用针对特定PTM的抗体富集含有该修饰的染色质，随后将DNA片段从富集的染色质中释放并进行测序，从而揭示与目标组蛋白PTM相互作用的基因区域。然而，这些实验高度依赖高质量的抗体。对于某些组蛋白变体/同源物或多种PTMs的组合，开发稳定可靠的抗体可能极具挑战性（尤其是针对多个PTMs的情况）。此外，只有在目标组蛋白PTM已知的前提下，才有可能开发出相应的抗体11。因此，亟需发展不依赖先验知识、可用于全局性组蛋白PTMs谱型分析的替代方法。

质谱法（MS）是一种用于表征组蛋白翻译后修饰（PTMs）的互补方法，尤其适用于尚无可用抗体的未知PTMs11,12。目前成熟的“自下而上”（bottom-up）质谱工作流程是在液相色谱（LC）分离和质谱检测之前，利用蛋白酶将蛋白质消化为小肽段。由于组蛋白含有大量碱性残基（赖氨酸和精氨酸），在标准的自下而上工作流程中，胰蛋白酶（特异性切割赖氨酸和精氨酸位点）会将组蛋白切割成非常短的肽段。这些短肽在技术上难以通过标准LC-MS进行分析，且无法保留多个PTMs之间的连接关系和化学计量信息。使用其他酶或通过化学标记封闭赖氨酸残基，可产生更长的肽段，更适合用于组蛋白PTMs的表征13,14。

或者，也可以完全省略消化步骤。在这种“自上而下"的方法中，经过在线液相色谱（LC）分离后，完整的蛋白质离子通过电喷雾电离（ESI）进入质谱仪，从而产生完整的组蛋白蛋白形式（proteoform）离子。此外，可选择性地在质谱仪中对目标离子（即蛋白形式）进行隔离并碎裂，以获得用于鉴定和翻译后修饰（PTM）定位的序列离子。因此，自上而下的质谱技术具有保留蛋白形式水平信息的优势，能够捕捉同一蛋白形式上多个翻译后修饰及末端截短之间的关联性15,16。自上而下的实验还可提供定量信息，并在完整蛋白质水平上揭示生物标志物的相关特征17。本文中，我们描述了一种从高粱叶片中提取组蛋白并利用自上而下的液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）分析完整组蛋白的实验方案。

图 1 和 2 所示示例数据来自播种后第 2 周采集的高粱叶片。尽管产量存在差异是预期之内的，但本方案通常不受特定样本条件的影响。该相同方案已成功用于播种后第 2、3、5、8、9 和 10 周采集的高粱植株叶片组织。

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方案

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1. 准备高粱叶片材料

注意：高粱植株于加利福尼亚州帕尔利耶的田间土壤中种植。

  1. 将高粱叶片采集到50 mL离心管中，并立即用液氮速冻离心管。采集主分蘖上第三和第四片完全展开的叶片组织。
    注意：有关田间条件、样品生长和采集的更多细节，请参见已发表的报告18。
  2. 用液氮研磨叶片，并立即转移至离心管中。
  3. 将研磨后的叶片粉末储存于-80 °C，待用。每个样品取约4 g冷冻研磨的叶片粉末用于组蛋白分析。

2. 缓冲液与材料的准备（3–4 小时）

注意：高浓度储存液可预先配制并保存至使用。但所有工作缓冲液必须在提取当天新鲜配制（通过将储存液稀释并与其他组分混合），并在操作过程中置于冰上。除非另有建议，整个实验应在 4 °C 下进行。

  1. 在玻璃容器中，将 42.8 g 蔗糖（342.30 g/mol）溶于 15 mL 无菌水中，置于加热板上持续搅拌并加热。待蔗糖完全溶解后，加水定容至 50 mL。将蔗糖溶液储存于 4 °C，待用。
  2. 在 15 mL 离心管中，将 1.576 g Tris HCl 溶于 10 mL H2O 中，配制 1 M Tris pH 8 溶液。用 NaOH 调节 pH 至 8，并用 pH 试纸检测。储存于 4 °C，待用。
  3. 称取 231 mg DTT（154.25 g/mol），溶于 1.5 mL 无菌水中，配制 1 M 二硫苏糖醇（DTT）溶液。DTT 需新鲜配制，或使用预先分装并冷冻保存的 aliquot。
  4. （可选）通过混合三种不同的盐类配制额外抑制剂。将 18.38 mg 正钒酸钠（183.91 g/mol）溶于 1 mL 无菌水中；另取 11.008 mg 丁酸钠（110.09 g/mol）溶于 1 mL 无菌水中，单独配制丁酸钠溶液；再将 4.199 mg 氟化钠（41.99 g/mol）溶于 1 mL 水中，配制第三种盐溶液。将三种盐溶液等体积混合，作为“额外抑制剂”储备液（每种化学物质浓度均为 33 mM）。
    注意：在中性 pH 条件下，正钒酸钠在浓度高于 0.1 mM 时会发生聚合。建议按照已发表的方案19活化正钒酸钠以使其去聚合，从而获得最大活性。或者，也可直接购买已活化的正钒酸钠。本实验中未对正钒酸钠进行刻意活化，因此其活性未受影响。目前尚未测试活化后的正钒酸钠在本方案中的效果。
  5. 在 15 mL 离心管中，将 0.952 g 无水氯化镁（95.2 g/mol）溶于 10 mL H2O 中，配制 1 M MgCl2 溶液。将 1 M MgCl2 储存于 4 °C，待用。
  6. 将 53.5 g Triton X-100 与 35 mL 无菌水混合，再加水定容至 50 mL，配制 10%（v/v）Triton X-100 溶液，并于室温保存。
  7. 配制 5% 盐酸胍缓冲液 pH 7（简称“Gdn 缓冲液”），用于树脂的预处理，至少浸泡过夜。称取 870 mg 磷酸氢二钾（K2HPO4），溶于 50 mL 无菌水中，配制成 0.1 M K2HPO4 溶液，并储存于 4 °C。
  8. 称取 0.7 g 盐酸胍，溶于 0.1 M K2HPO4 溶液中，定容至 14 mL。用 pH 试纸检测，调节 pH 至 7。
  9. 将干燥的弱阳离子交换（WCX）树脂在 5% 盐酸胍缓冲液 pH 7 中浸泡过夜。弃去上清液，加入新鲜的 5% Gdn 缓冲液，再次浸泡过夜，使树脂充分平衡（直至上清液 pH 与原始缓冲液一致）。
  10. 在开始下一节实验前，根据表 1混合试剂，配制 EB1、EB2A 和 EB2B 缓冲液。所有抑制剂和 DTT 均需在使用前新鲜加入。
试剂储存浓度EB1EB2AEB2B
体积 (mL)体积 (mL)体积 (mL)
蔗糖2.5 M4.41.250.5
Tris HCl pH81 M0.250.1250.05
DTT1 M0.1250.06250.025
H2O20.2259.68754.375
蛋白酶抑制剂（PI）片剂0.5 片0.5 片0.5 片
额外抑制剂（可选）33 mM0.250.1250.05
MgCl21 M0.1250.05
Triton X10010%1.25
总体积25 mL12.5 mL5 mL

表1：提取缓冲液（EBs）的组成成分。

  1. 根据表2配制细胞核裂解缓冲液（NLB）。提前配制NLB，并于4 °C保存至使用前。使用前新鲜加入PI片剂，终浓度为1×（每5 mL加入0.5片）。具体体积见表2。
NLB储存浓度体积（mL）
NaCl5M0.4
Tris HCl pH81M0.05
Triton X10010%0.5
EDTA0.5M0.2
H2O3.85
PI 片剂0.5 片
其他抑制剂（可选）33mM0.05
总体积5 mL

表2：细胞核裂解缓冲液（NLB）的组成。

3. 细胞核分离步骤

注意：建议在第一天完成步骤 3.1–3.3（2–3 小时），将细胞核保存在 NLB 缓冲液中，置于 -80 °C 冷冻，次日（或之后）继续进行蛋白质纯化（4 小时）。本方案中的细胞核分离步骤改编自美国联合基因组研究所正在使用的高粱 ChIP-seq 方案。对于 ChIP-seq 应用，可能需要额外的洗涤步骤以及蔗糖梯度分离，以确保细胞核的纯度。

  1. 去除碎片（约 0.5 小时）
    1. 称取约 4 g 冷冻的叶片粉末，使用前应将其置于干冰或液氮中保持冷冻状态。
    2. 向 EB1 中加入蛋白酶抑制剂片剂，使其终浓度为 0.2x（每 25 mL 样品加入 0.5 片）。在加入缓冲液前，使用微型塑料研杵或移液器吸头在微量离心管中预先压碎片剂，以促进其在缓冲液中的溶解。为防止样品损失，加入蛋白酶抑制剂片剂后对缓冲液进行超声处理以助溶解。
    3. 向冷冻的研磨叶片粉末中加入 20 mL EB1，轻轻涡旋并混合，直至粉末完全悬浮。继续轻柔混匀约 10 分钟。
    4. 用 100 目筛网过滤，每次用 2 mL EB1 冲洗滤渣两次。
      注：滤液和滤渣均应呈绿色。若使用显微镜观察，此时应在滤液中可见完整的细胞核和完整的叶绿体。大部分大颗粒碎片应已去除或显著减少。可将亚甲蓝等染料与样品混合。在 20x、40x 和/或 100x 物镜下观察时，细胞核表现为直径约 3–5 µm 的深蓝色/蓝绿色球形结构。叶绿体大小与细胞核相近，但呈绿色，常为椭圆形。液泡在大小和形状上也与细胞核相似，但不易被亚甲蓝染色。
    5. 将合并后的滤液在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 10 分钟（使用摆桶转子），以沉淀碎片及包括细胞核和叶绿体在内的大细胞器。
      注：建议在此离心过程中配制 EB2A（见步骤 3.2.1）。
    6. 小心倾去上清液，避免扰动沉淀。
      注：由于尚未加入去垢剂，沉淀应保持深绿色，上清液最多呈淡绿色或黄色。
  2. 裂解非目标细胞器（约 0.5 小时）
    1. 通过加入蛋白酶抑制剂，将 EB2A 配制成终浓度为 0.4x（每 12.5 mL EB2A 加入 0.5 片）。
    2. 将步骤 3.1.6 得到的沉淀用 5 mL EB2A 重悬，在冰上孵育 10 分钟，并轻柔混匀。
      注：需优化去垢剂浓度，以优先裂解完整细胞和叶绿体，但不裂解细胞核。所需浓度可能因生物体而异。建议在显微镜下检查叶绿体裂解情况及细胞核完整性。
    3. 在 4 °C 下以 2,100 x g 离心 15 分钟（使用摆桶转子），沉淀碎片和细胞核。
      注：此阶段上清液应呈深绿色，而沉淀的绿色应明显弱于前阶段，这是由于叶绿体裂解后叶绿素释放至胞质中所致。
    4. 小心倾去上清液，避免扰动沉淀。
  3. 从残留的胞质污染物中分离细胞核（约 0.5 小时）
    1. 通过加入蛋白酶抑制剂，将 EB2B 配制成终浓度为 1x（每 5 mL EB2B 加入 0.5 片）。
    2. 将步骤 3.2.3 得到的粗细胞核沉淀用 2 mL EB2B 重悬。
      注：EB2B 不含 Triton X-100，因此在此阶段不应发生额外裂解。
    3. 在 4 °C 下以 2,100 x g 离心 15 分钟（使用摆桶转子），沉淀碎片和细胞核。
      注：小细胞器和胞质成分不应沉淀，应保留在上清液中。
    4. 小心倾去上清液，避免扰动沉淀。
    5. 用 250 µL NLB 重悬沉淀（每 5 mL NLB 新鲜加入 0.5 片蛋白酶抑制剂）。
      注：目标是以尽可能少的 NLB 重悬细胞核，同时避免显著的样品损失。由于 NLB 黏度很高，且沉淀中含有大量不溶性碎片，移液操作困难，容易黏附在移液器吸头内壁。因此，建议尽可能重复使用同一吸头。若担心吸头内残留样品，可将移液器悬挂在架子上约 1 分钟，利用重力使样品聚集在吸头开口处。切勿剧烈吹打以重悬沉淀。建议将移液器吸头作为搅拌棒使用，直至沉淀材料可被吸入吸头内。即，只要能吸入移液器吸头，允许大块沉淀在此阶段保持存在。
    6. 最大速度涡旋 15 秒以均质并部分重悬样品，4 °C 下超声 5 分钟，随后于 -80 °C 保存。
      注：后续步骤中需注意，加入的 NLB 总量为 250 µL，但由于存在不溶性碎片，样品的表观体积可能高达两倍。样品经冻融处理有助于细胞核裂解。
  4. 细胞核裂解与组蛋白提取（约 4 小时）
    1. 向解冻样品中加入 750 µL 5% Gdn 缓冲液，4 °C 下超声 15 分钟。
    2. 将样品转移至一个 2 mL 离心管中，4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟。
      注：上清液可能呈绿色。后续层析步骤应可去除蛋白中的大部分色素。
    3. 在等待步骤 3.4.1 和 3.4.2 进行的同时，准备用于离子交换层析纯化的柱子。用 2 mL 乙腈和 4 mL 水冲洗层析柱，以最大限度减少表面污染。
    4. 将 200~300 µL WCX 树脂（预先用 5% Gdn 缓冲液预处理）装入层析柱中，待树脂沉降后，用 1 mL 5% Gdn 缓冲液洗涤四次。在后续纯化步骤中，保持管和柱子置于冰上。
    5. 将层析柱置于 2 mL 收集管上。缓慢将步骤 3.4.2 的上清液加至树脂床，避免扰动树脂（建议沿管壁缓慢滴加）。让溶液依靠重力流过柱子。在溶液流过过程中，将流出液重复上样至柱顶 6–8 次，以确保组蛋白与树脂充分结合。随后弃去流出液。
    6. 加入 2 mL 5% Gdn 缓冲液洗涤柱子，去除非组蛋白。弃去流出液。
    7. 用 1 mL 20% Gdn 缓冲液洗脱组蛋白。收集洗脱液，其中含有组蛋白。
    8. 使用 3 kDa 分子量截留（MWCO）离心滤膜（0.5 mL）对步骤 3.4.6 的洗脱液进行脱盐。使用前，加入 500 µL 洗涤液（含 0.2% 甲酸的 3% 乙腈溶液），离心两次以清洗滤膜。
      注：建议在进行树脂层析步骤的同时开始清洗 MWCO 滤膜以节省时间。后续离心滤膜步骤耗时约 3–4 小时。
    9. 首先加入 500 µL 组蛋白样品，以 14,000 x g 离心约 25 分钟，将体积浓缩至约 100 µL。然后加入另外 400 µL 样品，再次以 14,000 x g 离心约 25 分钟。最后加入剩余 100 µL 样品，用 300 µL 洗涤液冲洗样品管，并将洗涤液加入滤膜中，再次以 14,000 x g 离心约 25 分钟。
    10. 加入 400 µL 洗涤液，以 14,000 x g 离心约 25 分钟，将体积进一步减少至约 100 µL 或更少。每轮循环可将盐浓度降低五分之一。重复此过程三个循环，使胍盐浓度降至约 0.01%。将滤膜倒置放入干净的收集管中，以 1,000 x g 离心 2 分钟。将纯化的组蛋白样品保存于 -20 °C 或 -80 °C 以备分析。
      注：建议在最后一步延长离心时间（30–40 分钟），以最小化样品体积，获得更高浓度。最终体积可降至 50–70 µL。

4. 纯化组蛋白的质谱分析

  1. 液相色谱-质谱联用（LC-MS）数据采集
    1. 按照制造商提供的方案，使用双辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。
      注：BCA法仅能提供总蛋白浓度的估计值，无法评估组蛋白纯化的质量。若无现成的质谱仪器用于检测组蛋白纯化质量，可采用蛋白质印迹法（western blot）。如我们先前报道所述，也可使用反相液相色谱（RP-LC）结合210 nm紫外吸收检测进行检测20。可通过将色谱图与已知标准品进行比较来评估样品质量。然而，不同生物体可能具有不同的洗脱谱型。因此，强烈建议使用来自相近生物体的组蛋白标准品。
    2. 将一根C18反相（RP）分析柱（例如：3 µm，300 Å，内径75 µm，外径360 µm，长度70 cm）和一根C18捕获柱（例如：3.6 µm，内径150 µm，外径360 µm，长度5 cm）连接至双泵纳米流液相色谱系统（例如Waters NanoAcquity）。二元流动相为A：含0.1%甲酸的水溶液；B：含0.1%甲酸的乙腈溶液。
      注：双泵液相系统包括一个清洗泵和一个梯度泵。每次分析中，两个泵均经历两个阶段——捕获阶段和分析阶段。在捕获阶段，清洗泵流经捕获柱，梯度泵流经分析柱。在分析阶段，捕获柱与分析柱串联，梯度泵同时流经两根色谱柱，而清洗泵则流向废液。
    3. 捕获阶段：设置液相色谱方法，首先将1–2 µg组蛋白样品加载至捕获柱。使用清洗泵以3 µL/min流速、5%流动相B冲洗10分钟以脱盐。同时将分析泵设置为0.3 µL/min流速、5%流动相B进行平衡。
    4. 分析阶段：设置梯度泵（0.3 µL/min）从5% B开始，在15分钟内线性升至30% B，随后在100分钟内升至41% B，最后以高有机相冲洗至95% B结束。
      注：梯度程序可根据不同色谱柱的保留特性进行优化。通常情况下，在指定的液相条件下，全长组蛋白在30%–40% B范围内洗脱。使用更长的梯度可增加MS2谱图数量，从而捕获更多的组蛋白蛋白异构体（proteoform）。
    5. 在高分辨率质谱仪（例如Thermo Orbitrap Fusion Lumos或类似仪器）上设置依赖数据采集（data-dependent acquisition）方法，并具备电子转移解离（ETD）功能。使用完整蛋白质模式，并按照制造商建议完成所有必要的校准。关键参数如下，具体参数需根据所用仪器调整。
      1. MS1：扫描范围600–2,000 m/z，分辨率120k（在m/z 200处），4次微扫描，自动增益控制（AGC）目标值1E6，最大注入时间50 ms。
      2. MS2：分辨率120k；1次微扫描；AGC目标值1E6；依赖数据的MS/MS：交替使用ETD（反应时间25 ms，最大注入时间500 ms）和高能碰撞解离（HCD，归一化碰撞能量28%，±5%阶梯能量，最大注入时间100 ms）；隔离窗口0.6 Da；优先选择最高电荷态。
      3. 动态排除：时间窗口120 s，质量窗口±0.7 Da。排除电荷态低于5以及电荷态未确定的离子。
    6. 在运行实际样品前，先在新色谱柱上进样几次肽段或组蛋白标准品，以平衡系统并检查性能。当运行大量样品时，样品之间应插入短暂的空白或清洗步骤，以最小化残留效应。每次进样前，让色谱柱在起始条件（5%流动相B）下平衡15–20分钟。
      注：更长的液相梯度和更高的MS2最大注入时间可提高谱图质量，有助于识别更多的组蛋白蛋白异构体。
  2. LC-MS数据处理与蛋白异构体鉴定
    1. 从JGI（https://genome.jgi.doe.gov）或UniProt（https://www.uniprot.org/）获取（高粱）蛋白质序列的FASTA格式文件。
    2. 使用MSConvert21（http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml）将仪器原始数据文件（*.raw）转换为mzML格式。
    3. 下载TopPIC套件22（http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/）用于数据处理。该程序可通过命令行或图形界面运行。
    4. 在TopPIC套件中使用TopFD对步骤4.2.2生成的mzML文件进行谱图去卷积。可使用默认参数，但需将“precursor window”（-w）参数减小至1 m/z，因为使用了较窄的隔离窗口。
    5. 在TopPIC套件中使用TopPIC进行蛋白异构体鉴定。大多数默认参数均可使用。将谱图和蛋白异构体的截断类型设为FDR（错误发现率），截断值设为0.01（1% FDR）或按需设定。将“proteoform error tolerance”（蛋白异构体误差容限）设为5（道尔顿）。加载步骤4.2.1中的FASTA文件和步骤4.2.4生成的“*_ms2.msalign”文件，然后开始搜索。
      注：“proteoform error tolerance”设置会将质量相近（±5 Da）的蛋白异构体合并为一个，有助于减少蛋白异构体计数中的冗余。但应谨慎使用，因为较大的容差可能导致质量差异很小或无差异的蛋白异构体被错误合并。该参数仅在TopPIC 1.3版本或更高版本中可用。
    6. 鉴定出的蛋白异构体可在“*_proteoform.csv”文件中查看，或通过输出结果中“*_html”文件夹下的Topview模块进行可视化。
    7. 通过TopPIC上述步骤生成的蛋白异构体列表以质量偏移形式标注组蛋白翻译后修饰（PTMs）。为实现单个PTM的定位，必须包含修饰列表。详细说明可参见TopPIC用户手册。或者，可进入下一步，使用Informed-Proteomics软件包23（https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics）进行补充数据分析。
    8. 按照说明使用PbfGen模块将仪器原始数据转换为PBF文件，然后使用ProMex模块对MS1数据进行去卷积，输出ms1ft文件（特征列表，每个特征代表唯一的质量和保留时间组合）。
    9. 利用步骤4.2.6中TopPIC鉴定出的蛋白质列表，为Informed-Proteomics创建一个聚焦的FASTA文件。
      注：在Informed-Proteomics中使用大量可变PTMs搜索整个基因组可能极其缓慢，并可能导致程序崩溃。因此，建议仅包含目标蛋白以减小FASTA文件的大小。
    10. 根据示例文件的格式创建一个靶向修饰列表，用于搜索组蛋白PTMs。应包含的常见修饰包括：赖氨酸乙酰化、赖氨酸单甲基化、赖氨酸二甲基化、赖氨酸三甲基化、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化、蛋白质N端乙酰化、甲硫氨酸/半胱氨酸氧化。对于高粱，还应添加蛋白质N端单甲基化、二甲基化和三甲基化。
      注：Informed-Proteomics仅搜索修饰列表中指定的PTMs。若存在未指定的PTMs，可能导致蛋白异构体未被识别或被错误识别为其他蛋白异构体。然而，为最小化搜索时间，修饰列表应尽可能简短。
    11. 执行MSPathFinder模块，使用步骤4.2.8的文件、步骤4.2.9的聚焦FASTA文件以及步骤4.2.10的修饰列表进行蛋白异构体鉴定。可使用默认参数。
    12. 可通过加载所有结果文件，在LcMsSpectator中对结果进行可视化。
      注：目前已有多种生物信息学工具可用于处理和可视化自上而下（top-down）质谱数据，各具优势24,25,26,27,28。高粱及许多其他生物体在数据库中关于组蛋白PTMs的已知信息有限。建议首先使用TopPIC识别来自PTMs的质量偏移，该分析可有效发现已知和未知的PTMs。随后，可通过在TopPIC中指定PTM列表，或使用其他互补工具，对检测到的PTMs进行靶向搜索。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

按照本方案，可通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析提取并鉴定组蛋白。原始数据和处理后的结果可通过登录号 MSV000085770 在 MassIVE（https://massive.ucsd.edu/）获取。基于代表性样本的 TopPIC 分析结果（也可从 MassIVE 获取），我们共鉴定出 303 种组蛋白蛋白形式（包括 106 种 H2A、72 种 H2B、103 种 H3 和 22 种 H4 蛋白形式）。同时检测到共纯化的核糖体蛋白形式，通常在液相色谱早期洗脱。它们通常占已鉴定蛋白形式的约 20%，但不与液相梯度后期洗脱的组蛋白蛋白形式重叠。结果可使用最新的 TopPIC 或 Informed-Proteomics 软件包轻松可视化。为便于演示，我们将重点介绍使用 Informed-Proteomics 软件包进行数据可视化，该软件可直接加载原始质谱文件，并支持手动检查蛋白形式的鉴定结果。请注意，这两个软件包采用不同的算法和参数，因此报告的蛋白形式数量不会完全一致。我们建议报告来自 TopPIC 的蛋白形式数量，因其更为保守，且能够考虑未知的翻译后修饰。Informed-Proteomics 软件包集成了数据处理与可视化功能，便...

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讨论

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本方案描述了如何从高粱叶片（或更广泛地说，植物叶片）样品中提取组蛋白。每4–5 g高粱叶片材料预计可获得2–20 µg的组蛋白。所得材料纯度足以用于后续的LC-MS组蛋白分析（主要为组蛋白，约含20%核糖体蛋白污染）。由于样品差异或操作过程中可能的失误或失败，产量可能较低。在细胞核裂解步骤之前维持细胞核的完整性至关重要；因此，在加入NLB之前应避免剧烈涡旋和移液。此外，在从沉淀中去除上清液时可能发生细胞核损失。移液时必须小心，避免破坏沉淀。1% Triton X-100的浓度经过优化，可选择性裂解非靶向细胞器而保持细胞核完整（步骤3.2）。其他组织或生物体的最适去垢剂浓度可能不同，需通过实验确定。过滤过程中上清液颜色变化可能提示存在问题，例如叶绿体释放不充分或叶片研磨不充分。如有可能，建议使用显微镜在每一步骤后检查叶绿体是否裂解以及完整细胞核是否保留，以进一步优化该方案（特别是在将方案修改用于其他组织或植物时）。本方案仅在高粱叶片组织中进行过测试。由于土壤干扰，该方法不适用于高粱根组织。该方案尚未在其他植物叶片组织中测试，应用于不同植物时可能需要额外优化。若要将细胞核分离方案用于ChIP-seq应用，建议在步骤3.3.4之后（使用NLB...

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致谢

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感谢 Ronald Moore 和 Thomas Fillmore 在质谱实验方面的协助，以及 Matthew Monroe 在数据提交方面的工作。本研究由美国能源部（DOE）生物与环境研究项目通过“高粱干旱响应的表观遗传调控”（EPICON）项目（资助号 DE-SC0014081）、美国农业部（USDA；CRIS 2030-21430-008-00D）以及联合生物能源研究所（JBEI）提供资助。JBEI 是由美国能源部资助（合同号 DE-AC02-05CH11231）的劳伦斯伯克利国家实验室与美国能源部之间的合作机构。本研究在环境分子科学实验室（EMSL）（grid.436923.9）开展，EMSL 是美国能源部科学办公室下属的用户设施，由生物与环境研究办公室资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈Fisher ChemicalA955-4L
二硫苏糖醇（DTT）Sigma43815-5G
EDTA，500 mM 溶液，pH 8.0EMD Millipore Corp324504-500mL
甲酸Thermo Scientific28905
盐酸胍SigmaG3272-100G
MgCl2SigmaM8266-100G
磷酸氢二钾SigmaP3786-100G
蛋白酶抑制剂混合物，cOmplete 片剂Roche5892791001
丁酸钠Sigma303410-5G用作组蛋白去乙酰化酶抑制剂
氯化钠（NaCl）SigmaS1888
氟化钠SigmaS7020-100G用作磷酸酶抑制剂
正钒酸钠Sigma450243-10G用作磷酸酶抑制剂
蔗糖SigmaS7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
Triton X-100SigmaT9284-100ML
弱阳离子交换树脂，100–200 目分析级（BioRex70）Bio-Rad142-5842
一次性耗材
层析柱（Bio-Spin）BIO-RAD732-6008
100 目滤布Millipore SigmaNY1H09000此为 Sigma 植物细胞核提取试剂盒（目录号 CELLYTPN1）的组成部分。可使用相同孔径的类似滤膜。
微量移液器吸头（P20、P200、P1000）Sigma
离心管，50 mL / 15 mL，锥形Genesee Scientific28-103
微量离心管，1.5 / 2 mLSigma
仪器设备
分析天平Fisher Scientific01-912-401
烧杯（50 mL – 2 L）
带冷却功能的微量离心机Fisher Scientific13-690-006
微量移液器
带冷却功能的摆动转子离心机Fisher Scientific
涡旋振荡器Fisher Scientific50-728-002
水浴超声仪Fisher Scientific15-336-120

参考文献

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