我们介绍一种构建三维细胞培养环境的方法，可用于研究细胞/基质相互作用在癌症进展中的重要性。通过使用一种简单的自组装八肽，可调控包裹细胞周围的基质，并独立调节其力学和生化信号。
本文内容
摘要
摘要
人们日益认识到，与二维培养相比，三维培养的细胞更能模拟体内行为。在本方案中，我们描述了一种简单且可调节的三维水凝胶，适用于在接近细胞天然环境的条件下培养细胞和组织。这对于研究癌症发生、发展及治疗的研究人员尤为重要，因为在这些研究中，细胞与其局部细胞外基质之间的相互作用是模型的基本组成部分。转向三维培养可能具有挑战性，常因动物来源的三维培养基质批次间差异较大而导致可重复性差。同样，合成水凝胶的操作困难也可能限制其应用价值。为满足这一需求，我们优化了一种简单的自组装肽凝胶，可用于培养相关的癌症与疾病细胞系模型，以及患者来源的组织/细胞。该凝胶本身不含任何基质成分，除非在包封过程中额外添加，或由包封的细胞自身沉积产生。此外，水凝胶的机械性能也可在不依赖基质添加的情况下独立调控。因此，该系统可作为“空白模板”，使研究人员能够构建反映目标组织特性的三维培养环境，并独立解析机械力和/或生化因素对细胞行为的调控作用。
引言
细胞外环境在癌症发生和发展过程中所起的多种作用正变得越来越清晰1。最近，基于蛋白质组学的详细分析进一步充实了已有证据，表明来源于癌症相关基质细胞或癌细胞自身的基质成分，在促进上皮-间质转化及转移扩散等过程中发挥着关键作用2,3,4。鉴于细胞外基质（ECM）的这一公认重要性，开发能够控制细胞所处三维环境的细胞培养平台正变得至关重要。为满足这一需求，本实验方案介绍了一种将细胞包封并在三维水凝胶中进行培养的方法，该水凝胶具有用户自定义的ECM成分和力学特性5。
目前，二维体外培养中癌症治疗效果、现有体内模型（患者来源异种移植，PDX）中这些治疗手段的影响以及其在临床试验中的最终疗效之间存在较差的相关性6,7这已导致药物研发管线出现重大失败，迫切需要改进体外模型，以便使待测治疗药物能够“尽早失败，低成本失败”。许多研究人员使用小鼠肥大细胞瘤来源的产品（例如 Matrigel 或类似产品）来构建富含三维基质的环境，以在体外培养并观察细胞行为, 包括PDX来源的及其他接近患者的细胞8,9,10然而，这种“一刀切”的方法忽视了基质蛋白/聚糖在癌症发生和进展中的复杂作用。
认识到细胞外基质（ECM）在调控细胞行为中的作用，也推动了在由特定基质成分组成的水凝胶中或其上进行三维培养的应用11。尽管这种方法有助于研究特定的相互作用，但这些系统难以将细胞与基质之间的力学信号和生化信号分离开来。此外，它们可能操作困难，并导致对细胞行为的观测结果不明确。胶原凝胶就是这一问题的典型例子，因为细胞介导的凝胶收缩会显著影响对凝胶内细胞的成像效果5。此外，还有一些非常精巧的多组分凝胶系统，专家已将其成功应用于研究12,13,14。这些系统可引入酶敏感性连接子和生物活性基序，但在配方和应用上远比本文所述系统复杂。
本方案描述了一种构建完全定义的三维培养模型的方法，可在体外模拟细胞外基质（ECM）在发育和疾病中的作用。该三维模型的基础是一种肽凝胶，我们此前已将其描述为一种简单自组装八肽水凝胶的优化形式5,15,16。该系统摒弃了复杂的动物来源基质，因而具有显著优势，包括批次间一致性更好以及操作更简便。在基础状态下，该肽不含任何基质来源的基序，实质上为用户提供了一个“空白模板”，可在其上构建所需功能。
我们展示了如何在同时整合基质蛋白/聚糖的情况下，独立调控多肽凝胶的机械性能。该系统具有高度可调性，能够以多种形式包载多种类型的细胞。对于构建癌症模型而言，重要的是还可以引入间质细胞：既可进行直接的共培养，也可将其分隔开，以特异性分析癌细胞与间质间的间接相互作用。最关键的是，本文所述方案无需复杂的化学知识，可在任何细胞培养实验室中重复实现，而无需专门的化学知识或设备。
我们已优化了在多肽凝胶中研究细胞行为的方法，包括成像、流变学分析、提取材料用于PCR5，以及用于组织学评估的包埋技术。这种简单的水凝胶系统的一个显著优势在于能够可视化并研究被包裹细胞所沉积的基质。近期研究强调了细胞来源基质的重要性，以及深入理解细胞如何重建其局部微环境所带来的益处17，这反映出人们日益认识到捕获细胞分泌的基质成分具有重要意义，类似于体内发生的自然过程。利用该系统模拟此类生物学过程的能力，可能是提升基于水凝胶的疾病模型对患者病理更具相关性的关键驱动因素之一。
方案
1. 肽的溶解
- 在组织培养罩内，使用 P1000 移液器将 800 μL 无菌水加入 15 mL 离心管中。
- 使用精密天平将肽粉称量至无静电的称量舟中。称取的质量（单位为 mg）应为所需最终肽凝胶浓度（单位为 mg/mL，表 1）的 1.25 倍。
注意：此处所述方法在最终凝胶化时每管可制备约 1.25 mL 肽凝胶。可同时制备多管样品，或者当操作者对该方法熟练后，也可增加每管的体积。
| 肽浓度（终末凝胶化后） | 肽质量 | 初始 NaOH 加入量 |
| 6 mg/mL | 7.5 mg | 30 µL |
| 10 mg/mL | 12.5 mg | 60 µL |
| 15 mg/mL | 18.75 mg | 100 µL |
表1：典型终浓度凝胶的多肽质量及建议的初始NaOH添加量。 表中所列多肽浓度范围可在两个方向上进一步扩展，但浓度过低时可能无法形成稳定的凝胶，而浓度过高时所得凝胶可能过于致密，导致营养物质交换不足，影响细胞活力。不同细胞类型和不同批次的多肽需进行优化以确定合适的浓度。
- 将称量好的肽加入15 mL离心管中。轻弹称量舟，确保无粉末残留。
注意：肽粉末可能带有较强静电，请小心操作以尽量减少粉末损失。在步骤1.2和1.3（或任何pH测量步骤）中无需维持无菌条件，因为后续在80 °C孵育过程中会进行灭菌。 - 涡旋振荡3分钟，然后在200 x g条件下离心3分钟。
- 将肽溶液置于设定为80 °C的烘箱中孵育至少2小时。若孵育后仍有未溶解的肽存在，请重复步骤1.4。
注意：由于需要均匀加热，本步骤不宜使用加热块。然而，我们发现杂交炉或水浴均可良好适用，前提是肽溶液完全浸没于水中。
2. 凝胶前体的形成
- 使用无菌水配制无菌的 0.5 M 氢氧化钠（NaOH）溶液。
注意：为获得最一致的结果，建议使用新鲜稀释的 NaOH 溶液。 - 在组织培养超净台中，将 0.5 M NaOH 加入已溶解的多肽中心部位，并用移液器枪头缓慢搅拌混合（表 1）。
- 涡旋振荡管子 10 秒，然后在 200 x g 下离心 10 秒以去除气泡。
- 如果凝胶前体溶液浑浊，请重复步骤 2.2 和 2.3，每次增加 5 µL NaOH。
注意：pH 测量有助于判断是否已加入足够的 NaOH：最佳 pH 范围为 9–10.5，应避免超过此范围，因为使用酸回调 pH 可能导致凝胶不均一。所需 NaOH 的精确体积可能因多肽来源不同而有所变化。 - 当凝胶前体在 15 mL 管倒置后光学透明且能自支撑（或仅轻微流动）时，在组织培养超净台中加入 100 μL 无菌 10x PBS。涡旋振荡 10 秒，并在 200 x g 下离心 10 秒。
注意：如果凝胶前体仍浑浊，请重复步骤 2.4 直至其变得透明且呈半固态。如果凝胶前体为液态（pH 高于约 10.5），则无法形成稳定的凝胶，应予以弃用。 - 在 80 °C 的烘箱中孵育过夜。
- 目视检查凝胶前体，确保其在 80 °C 下完全呈液态。
- 如果凝胶前体在 80 °C 下未完全液化，说明中和不充分，应按照步骤 2.4 补加 NaOH。
- 如果凝胶前体为液态，但存在气泡或少量沉淀，可用力弹击管壁以分散。若弹击后气泡或沉淀仍存在，则对凝胶前体进行涡旋振荡，并在 200 x g 下每次离心 10 秒。
- 完成步骤 2.7.1 或 2.7.2 中任一操作后，将前体凝胶在 80 °C 下继续孵育 2 小时，再进行最终凝胶化。
- 将凝胶前体保持在 80 °C 下直至使用（最长不超过 48 小时）。
注意：本方案可在此处暂停，将凝胶前体储存于 4 °C 最多 4 周。若从此暂停点恢复实验，需先将凝胶前体在 80 °C 下孵育至少 2 小时，然后从步骤 2.7 重新开始。强烈建议提前充分准备凝胶前体，以确保在需要进行最终凝胶化前有足够时间完成上述调整。
3. 接种用基质组分的制备
注意：步骤 3–5 的示例计算见图 1。可省略步骤 3 和步骤 4，分别制备无基质和/或无细胞的凝胶。
- 计算接种所需的细胞、基质和培养基的总体积，每1 mL前体凝胶需额外加入250 µL。将该体积乘以1.1以补偿移液误差。此即为接种体积VS。
- 对于每种基质组分，使用公式1计算需加入接种体积中的储存液体积：
(1)
注意：VS对应于接种所有凝胶所需的接种培养基总体积（步骤3.1）。确保所有基质组分体积之和不超过VS。 - 将所有基质组分彻底解冻（参考生产商说明书），并在使用前置于冰上保存。
注意：某些基质组分极易发生凝胶化。请参考生产商说明书以避免此情况发生。 - 若需加入需中和的酸性胶原蛋白储存液（参考生产商说明书），则按以下步骤配制中和溶液：
- 使用公式1计算所需胶原蛋白储存液体积VC。
- 确定合适的中和溶液体积VN。应选择该体积，使得所有基质添加物的总体积不超过接种体积VS。
注意：通常VN = 2 × VC为合理取值，但可根据其他待加基质组分的数量和体积进行调整。 - 使用公式2计算中和所需1 M NaOH的体积。
(2) - 使用公式3计算中和溶液中所需的10x PBS体积。
(3) - 将计算所得体积的1 M NaOH和10x PBS混合，再用无菌水定容至VN。充分混匀后置于冰上保存备用。
注意：此时切勿加入酸性胶原蛋白。胶原蛋白与中和溶液过早混合将引发胶原纤维形成，可能导致最终肽凝胶性质不一致。
4. 接种细胞的准备
- 如果尚未完成，请根据步骤 3.1 计算接种体积 VS。
- 通过将最终肽凝胶中所需的细胞密度乘以 5，计算本细胞悬液中所需的细胞浓度。
注意：细胞悬液的浓度应为最终目标浓度的 5 倍，以补偿与凝胶前体混合时的稀释效应。每种新考虑的细胞系均应优化其细胞密度。根据细胞类型的不同，最终肽凝胶中的细胞密度在 1 × 104 至 1 × 106 个细胞/mL 之间可能是合适的。 - 计算接种所需的细胞总数（将细胞密度乘以步骤 4.1 中计算出的接种体积 VS）。
- 采用所用细胞的标准培养/传代方法，制备含有步骤 4.3 中计算出的所需数量细胞的细胞沉淀。
5. 最终凝胶化/细胞包封
- 准备进行最终凝胶化时，将凝胶前体从 80 °C 烤箱转移至 37 °C 水浴中。
注意：凝胶前体在 37 °C 下应具有自支撑性。若仍为液态，则很可能无法完全凝胶化，应弃用该凝胶前体。 - 准备一个 96 孔板，或 alternatively 使用带有细胞培养插件的 24 孔板（或类似规格）。
注意：在 24 孔插件中接种肽凝胶时，应确保插件底部与孔板之间留有间隙。这可保证凝胶与培养基接触。 - 若需添加基质，将所有基质组分与中和溶液（步骤 3）混合，并用细胞培养基补至体积 VS（步骤 3.1），充分混匀。若需加入细胞，使用接种体积 VS 重悬步骤 4 中制备的细胞沉淀。
注意：若步骤 3 中未制备任何基质组分，则使用细胞培养基作为接种体积。通常使用所用细胞类型的常规培养基，但如果使用多种细胞混合体系，则可能需要验证其适用性。 - 使用 P1000 移液器，将 250 μL 细胞/基质混合物轻柔地加至凝胶前体表面。
注意：基质组分（尤其是基底膜提取物）一旦加入凝胶前体后可能开始聚合。因此，应尽快进行下一步操作。 - 通过移液和搅拌结合的方式轻柔混匀。该凝胶具有剪切稀化特性，因此轻柔移液或搅拌会使其更易混合。充分混匀后，向 96 孔板的每孔加入 100 μL，或向每个细胞培养插件中加入 200 μL。
注意：混匀过程中，使用 P1000 移液器以 200 μL 设定进行反向移液有助于避免引入气泡。凝胶初始可能较难混匀，但持续操作后会逐渐变易——这表明混匀效率良好。 - 在 37 °C、5% CO2 及湿润环境中孵育 10 分钟。
注意：若肽凝胶未添加任何基质成分，则此步骤非必需。 - 向 96 孔板的每孔加入 200 μL 培养基，或向细胞培养插件外侧加入 1 mL 培养基，并在凝胶表面滴加数滴。在 37 °C、5% CO2 及湿润环境中孵育。
- 在接下来的一小时内更换培养基两次，数小时后（或次日）再更换一次。
注意：此阶段需格外小心，因凝胶在数小时内仍不稳定。 - 每 2–3 天更换一次培养基（或根据所用细胞的标准培养方案进行更换）。
6. 间接共培养
注意：该方法仅适用于将肽凝胶接种至24孔板插件或类似格式的情况，即凝胶可被支撑在细胞单层上方。在此情况下，可通过在孔板底部制备一层二维饲养细胞层来实现间接共培养。
- 准备一个24孔板用于接种细胞。该孔板应与肽凝胶所用的孔板分开，但需为同一品牌，以确保与后续使用的插入式培养小室兼容（参见步骤5.2）。
- 根据所用细胞类型，计算间接共培养所需的细胞密度。
注意：每种新细胞系的接种密度均需优化。细胞接种后应达到约30–50%的融合度。例如，人乳腺成纤维细胞系HMFU19通常以1–5 × 104 个细胞/孔的密度接种。 - 采用所用细胞的标准培养/传代方法，用其常规生长培养基制备细胞悬液，调整至每孔1 mL的接种体积。
- 将细胞悬液接种至24孔板中，每孔1 mL。
- 在37 °C、5% CO2及湿润环境中孵育数小时或过夜，使细胞贴壁，随后吸去各孔中的培养基。
- 使用无菌镊子，将含有肽凝胶的24孔板插入式培养小室转移至已预先接种了二维培养细胞的新孔中。沿插入式小室外周缓慢加入1 mL培养基，并在凝胶表面滴加数滴。
注意：通常在此阶段使用适合凝胶内包封细胞的培养基，但需验证或优化该培养基是否适用于二维培养的细胞，具体取决于实验设计。 - 定期制备新鲜的饲养层，以避免细胞过度融合，并按照上述方法将肽凝胶转移至这些新孔中。
注意：通常在接种肽凝胶的同时准备用于间接共培养的细胞。数小时或过夜孵育后的换液时，即可将肽凝胶转移至共培养体系，参见步骤5.8。
7. 肽凝胶的整体振荡流变学
注意：标准情况下，流变学表征应在凝胶接种后24小时进行，凝胶接种应于24孔板插入物中进行。
- 根据制造商的说明设置并校准流变仪。使用平行板几何结构，其板直径应尽可能接近细胞培养插件的直径。
注意：如需模拟培养过程中的环境，测试可在 37 °C 下进行。 - 通过翻转插件并用手术刀切割出塑料膜，将首个待测肽凝胶样品从细胞培养插件中取出。
注意：在测试前，应尽可能缩短含有肽凝胶的培养板暴露于细胞培养孵育箱外的时间。含有碳酸氢盐缓冲系统的培养基依赖 CO2 维持 pH 值。若凝胶在孵育箱外放置过久，pH 值可能发生偏移，从而影响流变学评估。可在培养基中添加 10 mM HEPES 以维持凝胶稳定性，防止此效应发生。 - 小心地将凝胶转移至流变仪的测量板上。然后使用手术刀将凝胶高度修整至约 1 mm，以减少加载至流变仪板下时凝胶的形变。
注意：使用手术刀时需小心，避免触碰或损坏流变仪的测量板。 - 将平行板间距设定为 1 mm，并切除未被流变仪板覆盖的多余凝胶部分。
- 根据制造商的说明，在流变仪上运行所需的测试参数。
注意：对于每种新的样品条件，建议进行 0.1–100% 应变范围的振幅扫描，以确保所有测试均在样品的线性粘弹性区域内进行。
8. 包封细胞的活/死染色
- 从孔中移除培养基，并使用与更换培养基相同的操作方法（步骤 5.7）用 1× PBS 将肽凝胶清洗两次。
- 在完成步骤 7.2 后，取出在 24 孔板插件中培养的肽凝胶。将凝胶保留在原孔板的 1× PBS 中，直至准备染色。
注意：操作时需格外小心，因为此时凝胶可能较为脆弱，尤其是在长时间培养后。 - 配制活/死细胞染色液，每 24 孔板插件需 500 μL 染色液，或每 96 孔板孔位需 50 μL。典型的染色液包含 4 μM 碘化丙啶同型双聚体（ethidium homodimer）和 2 μM 钙黄绿素 AM（calcein AM），溶于 1× PBS 中。配制后的溶液需避光保存。
注意：活/死细胞试剂的浓度可能需要根据所用细胞类型及试剂供应商进行进一步优化。 - 小心移除每个凝胶上的 PBS，加入数滴染色液，确保每个凝胶均被充分覆盖。
- 将凝胶在染色液中避光孵育 10–15 分钟，随后使用共聚焦/荧光显微镜观察。
注意：为获得更高质量的图像，可将凝胶转移至具有玻璃底且盖玻片厚度适宜的培养皿中进行观察。
9. 用于终点成像的多肽凝胶固定
- 按照步骤 8.1 清洗多肽凝胶。
- 在 1× PBS 中加入 4% 多聚甲醛（PFA）：96 孔板每孔 100 μL，24 孔板插入式培养皿中每个凝胶 1 mL（应在插入皿内的凝胶表面滴加几滴）。
注意：多聚甲醛（PFA）具有高毒性，可经皮肤迅速吸收，对皮肤、眼睛、黏膜和上呼吸道具有强烈破坏性。PFA 应在通风橱中操作，操作者需穿戴防护服和手套。根据最终应用，也可使用其他化学固定剂，操作方式相同。 - 将多肽凝胶在 PFA 固定液中室温孵育 1 小时。
- 移除 PFA 固定液，并用 1× PBS 将多肽凝胶清洗两次。
注意：本方案可在此处暂停，将固定后的多肽凝胶置于 1× PBS 中，在 4 °C 下保存最多 4 周，确保用封口膜将培养板密封良好。
10. 包埋肽凝胶以进行切片
注意：在进行免疫组织化学的石蜡包埋前，将肽凝胶包埋于4%琼脂中是一个关键步骤。或者，也可将凝胶包埋于2%琼脂中，并使用振动切片机进行切片（通常500 μm的切片可获得良好结果）。此为可选步骤，可产生水合凝胶切片，结合第11节中的方法，有助于对凝胶中细胞外基质定位的染色。
- 通过微波炉加热制备熔融的2%或4%琼脂溶液（溶于1x PBS中，见上述注释），使用前静置冷却数分钟。
注意：熔融琼脂具有高温烫伤风险——操作时需佩戴手部和面部防护装备，小心处理。琼脂溶液配制完成后可于4 °C保存，待需要时使用。 - 在完成步骤7.2后，从细胞培养插入物中取出肽凝胶。
- 使用塑料巴斯德吸管，将少量琼脂溶液均匀铺在组织学包埋模具底部，形成一层薄层。于20 °C静置数秒钟使其冷却。
- 用刮铲将肽凝胶置于琼脂中央，随后用琼脂完全覆盖肽凝胶。
注意：凝胶不应沉入琼脂中。若发生下沉，应取出凝胶，再等待数秒使琼脂进一步凝固后重试。注意避免过度凝固，否则两层之间将形成较弱的结合界面。 - 将包埋好的凝胶于4 °C冷却1小时，然后从组织学包埋模具中取出。
注意：本方案可在此处暂停；包埋后的凝胶可在1x PBS中于4 °C保存，最长可达4周。 - 若需进行免疫组织化学染色，将包埋好的凝胶放入组织处理仪中，并按照实验室常规方法继续操作。
注意： alternatively，也可使用振动切片机将包埋凝胶切成水合切片。水合切片应置于密封板中，于4 °C保存在1x PBS中，最长可保存4周。
11. 使用免疫细胞化学法对凝胶中的细胞进行染色
- 移除覆盖在肽凝胶/凝胶切片上的1x PBS。按照步骤7.2，移除仍位于24孔板插入物中的任何凝胶。
- 用封闭缓冲液覆盖凝胶/凝胶切片，并在20 °C下孵育30分钟。
注意：典型的封闭缓冲液由含0.1% Triton X-100的1x PBS中的0.5%牛血清白蛋白（BSA）组成。Triton X-100具有毒性，可导致严重的眼损伤、皮肤刺激，并对水生生物具有极高毒性。使用者应穿戴防护服、眼部保护装置和手套。 - 在封闭缓冲液中按优化的工作浓度配制一抗。每24孔板凝胶使用200 μL，每凝胶切片使用100 μL，每96孔板孔使用50 μL。
注意：通常，凝胶中进行三维染色所用的一抗浓度应为二维染色时的两倍。 - 移除封闭缓冲液，并将抗体溶液逐滴加入凝胶中。
- 用石蜡膜密封板，并在4 °C下孵育过夜。
- 移除抗体溶液，并用封闭缓冲液洗涤两次。
- 按照步骤11.3和11.4所述相同程序加入二抗。
- 在避光条件下于4 °C孵育过夜，或在20 °C孵育3小时。
- 移除抗体溶液，并用1x PBS洗涤两次。
- 用1:1,000的DAPI溶液覆盖样品，在避光条件下于4 °C孵育1小时。
- 将凝胶转移至玻璃盖玻片上，通过荧光/共聚焦显微镜成像。
12. RNA 提取
注意：本方法中使用的体积适用于将肽凝胶接种至24孔板插入式培养小室的情况。也可使用其他凝胶规格，并相应调整体积。
- 从孔中移除培养基，并使用与更换培养基相同的操作方法（步骤 5.7）用 1x PBS 洗涤肽凝胶两次。
- 在完成步骤 7.2 后，取出在 24 孔板插入式培养皿中培养的肽凝胶，将每块凝胶分别放入一个独立的 15 mL 离心管中。
注意：操作时需小心，因为此时凝胶可能较为脆弱，尤其是在长时间培养后。 - 使用 P1000 移液器，向每根离心管中加入 500 μL 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），上下吹打混匀，以破坏凝胶结构。
- 将凝胶在 37 °C 条件下孵育 3–5 分钟，使其与胰蛋白酶-EDTA反应。
注意：孵育时间可能需要根据所使用的细胞类型进行优化。 - 加入 5 mL 的 1x PBS 以稀释胰蛋白酶-EDTA。
- 在 200 x g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。
- 小心移除上清液。
注意：操作时需谨慎，因为在细胞沉淀与上清液之间可能已形成一层凝胶状物质。 - 根据试剂生产商的说明，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，并按照标准 RNA 提取流程继续操作。
结果
本文所述的多肽凝胶制备方法允许使用者设计并构建定制的三维培养环境。虽然机械环境主要由多肽浓度决定，但也可按受控密度添加感兴趣的基质组分，如图1中的示例计算所示。然而，最简单形式下的多肽凝胶方案提供了一种在无基质的三维环境中包封细胞的方法。图2展示了该方法可与多种癌症模型联合使用，包括荧光标记的癌细胞系（图2A）以及患者来源的异种移植（PDX）材料（图2B,C）。重要的是，细胞系和PDX材料均可在无血清条件下于凝胶中培养（图2C,D），从而提供一种成分完全明确的三维培养系统。
由于该肽本身不含任何细胞结合基序，因此在未修饰的肽凝胶中，包埋的细胞通常呈现圆形形态。 图3A 在6 mg/mL肽凝胶中，人乳腺成纤维细胞表现出此种形态，与在纯Matrigel和纯胶原凝胶中观察到的经典细长形态形成对比。然而重要的是，该肽凝胶方案允许掺入感兴趣的基质组分。 图3A 演示了添加 200 μg/mL I 型胶原可恢复肽凝胶中成纤维细胞的伸长形态。
基质添加物也可支持其他细胞类型的生长和组织，例如MCF10A细胞，如图3B所示。在此情况下，在6 mg/mL的肽凝胶中添加100 μg/mL I型胶原蛋白，可在第7天形成腺泡结构。通过引入支持性细胞层进行间接共培养，还可进一步增加复杂性。图3C展示了将基质添加与人乳腺成纤维细胞间接共培养相结合的方法，可增强MCF10A细胞的生长和组织化。
另一个重要参数是用于肽凝胶制备的肽的浓度。 图4A 展示了通过控制肽浓度（本例中为4至10 mg/mL）可获得弹性模量在数百至数千帕斯卡（Pa）范围内的水凝胶。这些凝胶可制备为无基质形式，也可添加基质成分，从而实现对刚度和组成的同步调控。含有基质添加物的肽凝胶可进行切片和染色，以观察这些添加物的分布情况。 图4B, C 展示两种实现此目的的方法：将样本包埋于4%琼脂中，随后进行常规组织处理及石蜡包埋，用于免疫组织化学图4B) 或包埋于2%琼脂中，随后进行振动切片及荧光染色（图4C).
在调整多肽凝胶的组成时，至关重要的是确保这些改变不会影响细胞最初所接触的力学环境。图4D 展示了如何通过调节多肽浓度来抵消因基质掺入引起的多肽凝胶刚度变化。通过整体振荡流变学测量凝胶刚度（储能模量，G’），可进一步区分凝胶组成与刚度对细胞形态的影响。如明场图像所示，MDA MB 231 细胞在添加胶原蛋白的 10 mg/mL 或 15 mg/mL 多肽凝胶中均呈现出伸长的形态。图4E 显示这些伸长的细胞对 pFAK 呈阳性染色，表明其与周围基质发生了相互作用。多肽凝胶初始无基质的环境也使其成为研究细胞合成并沉积特定基质成分的理想平台。图4F 展示了包埋于 10 mg/mL 多肽凝胶中的 MCF7 细胞局部沉积 I 型胶原蛋白的情况。
多肽凝胶的一个关键优势在于，可轻松应用标准实验室方法对其进行分析。可提取材料进行定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），以确定基因表达谱（如我们近期发表的文章5所示）。此外，通过明场显微镜成像可实现细胞生长的实时观察。图5展示了一些在制备失败的多肽凝胶中可能遇到的典型问题：凝胶前体混合不充分（图5A,B）；多肽浓度（图5C,D）或接种密度（图5E,F）未优化；以及在将酸性胶原整合入多肽凝胶前中和不充分（图5G,H）。特别是多肽浓度和接种密度，必须针对每种细胞系和多肽来源进行优化，以确保培养环境定义明确，并能真实反映目标应用场景。
图1：基质成分与接种密度的示例计算。 本示例流程描述了如何在两种肽凝胶前体中添加100 µg/mL胶原蛋白，并以终浓度为1 × 105 个细胞/mL的细胞密度进行接种的操作步骤。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：无基质肽凝胶为细胞系及患者来源的癌症模型提供了适宜的三维培养平台。（A）稳定表达荧光标记mCherry和tdTomato的HCT116结肠直肠癌细胞系和MCF7乳腺癌细胞系在6 mg/mL凝胶中培养至第9天时形成细胞簇（左图），并可使用荧光显微镜进行活细胞成像（右图，比例尺50 µm）；（B）来自三阴性乳腺癌患者（BR8）的患者来源异种移植（PDX）细胞在10 mg/mL肽凝胶中培养至第7天时形成细胞簇；（C）来自雌激素受体阳性乳腺肿瘤（BB3RC31）的PDX细胞可在无血清条件下培养18，图中显示了在相同传代次数下与基底膜基质（如Matrigel）对照组的比较；（D）MCF7乳腺癌细胞在无基质且无血清的6 mg/mL肽凝胶中培养至第7天时仍保持活性，通过活/死细胞检测进行评估。KSR = 敲除血清替代物，MS培养基 = 乳腺球培养基19。除非特别注明，比例尺均为100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：通过添加基质成分和共培养可提高肽凝胶的复杂性。（A）人乳腺成纤维细胞系HMFU19在6 mg/mL肽凝胶中需要添加胶原才能恢复伸长形态，图中同时展示了纯基底膜基质（如Matrigel）和1.5 mg/mL大鼠尾部胶原I凝胶作为对照，比例尺为50 µm；（B）在6 mg/mL肽凝胶中加入100 µg/mL人I型胶原后，MCF10A正常乳腺细胞在第7天形成腺泡样结构，比例尺为100 µm；（C）在10 mg/mL肽凝胶中，通过间接共培养方式联合添加基质成分纤连蛋白/透明质酸（hyaluronic acid，分子量804 kDa）和HMFU19细胞，可增加MCF10A腺泡的大小和组织化程度，通过cleaved caspase 3染色进行评估，比例尺为50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：多肽凝胶可独立调控刚度与成分，并用于评估细胞分泌的基质。（A）体相流变学测量结果显示，通过调节多肽浓度可实现典型的刚度范围（储能模量 G’），* 表示 p < 0.05；（B）免疫组织化学染色显示，在包裹 MCF7 细胞的 10 mg/mL 多肽凝胶中添加 150 µg/mL 胶原蛋白 I 的情况（第 7 天，比例尺 100 µm）；（C）通过琼脂包埋和振动切片法对含 200 µg/mL 人源胶原蛋白 I 的 6 mg/mL 多肽凝胶进行免疫荧光染色，显示胶原蛋白 I 的分布（比例尺 25 µm）；（D）在 10 mg/mL 多肽凝胶中添加 200 µg/mL 胶原蛋白 I 会导致储能模量 G’ 轻微下降（体相振荡流变学），但通过将多肽浓度提高至 15 mg/mL 可抵消该效应。各条件下均显示 MDA MB 231 三阴性乳腺癌细胞（第 7 天，比例尺 50 µm）；（E）在含 200 µg/mL 人源胶原蛋白 I 的 15 mg/mL 多肽凝胶中，MDA MB 231 细胞表现出伸长形态，并通过 pFAK 染色显示其与基质的相互作用（第 14 天，比例尺 50 µm）；（F）在初始无基质的 10 mg/mL 多肽凝胶中，原位染色显示 MCF7 细胞分泌的胶原蛋白 I（第 10 天，比例尺 100 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：常见的多肽凝胶问题可通过明场显微镜观察进行排查。 所示细胞为 MCF10A 正常乳腺上皮细胞，培养时间均为第 7 天，除非另有说明。(A) 正确混合的凝胶前体应光学透明且无异常，而 (B) 混合或中和不充分可能导致多肽凝胶中出现可见的不均一性或条纹（白色箭头）；(C) 在添加 HMFU19 间接共培养条件下，MCF10A 细胞可在 6 mg/mL 多肽凝胶中形成腺泡样结构，然而 (D) 在 15 mg/mL 时多肽浓度过高，抑制了腺泡结构的形成；(E) 当接种密度为 5 × 105 个细胞/mL 时，MCF10A 细胞在添加 100 μg/mL I 型胶原蛋白的 6 mg/mL 凝胶中可形成腺泡结构，然而 (F) 在 2 × 105 个细胞/mL 时细胞密度过低，无法支持腺泡形成；(G) 添加胶原蛋白可在第 14 天形成较大的细胞簇，然而 (H) 操作不当（胶原蛋白中和过早）会抑制细胞簇的生长。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们发现，此处所述的肽凝胶是一种支持多种细胞三维培养的简单、经济且灵活的解决方案。通过精确控制所用肽的浓度以及添加的蛋白质或聚糖成分，该方法可对肽凝胶进行精细定制，以满足特定应用需求。
与现有方法相比，多肽凝胶的关键优势在于，可以使用一种简单的方法独立控制基质的组成和机械性能，而无需任何复杂的化学操作。多肽凝胶的机械性能主要由初始凝胶前体中的多肽浓度决定。随后加入细胞和/或基质组分，即可构建完全由用户自定义的体外环境。尽管添加基质成分可能会改变凝胶的初始机械性能，但这一影响可通过独立调节多肽浓度轻松补偿5。这相较于现有系统（例如胶原凝胶）具有明显优势，在后者中，调控刚度的参数通常也会导致整合素结合基序发生改变20,21。
我们已展示了多肽凝胶在体外培养癌细胞系及患者来源组织中的应用5。该多肽凝胶可实现的刚度范围（数百至数千帕斯卡）非常适用于模拟乳腺等软组织中正常及肿瘤基质的微环境。然而，我们也认识到其他应用可能需要更坚硬的环境，例如骨组织再生所需的10–20 kPa范围。若要将本方案所制备凝胶的刚度扩展至该范围，则需对本方案进行进一步优化，而这一刚度范围更常见于海藻酸盐凝胶等其他替代方法22。同样，本文介绍了一种通过物理包埋方式将基质蛋白或多糖整合入多肽凝胶的简单功能化方法。对于本文所述的应用，该方法效果良好，且易于非专业研究团队采用，适用于构建疾病的三维体外模型。与许多其他水凝胶11类似，本文所用多肽亦可进一步改造，以引入细胞结合序列或其他生物学功能基序，在某些应用中，这种改造策略可能更具优势。
我们已确定了一些需要特别注意的关键点，以确保实验成功。凝胶前体的形成是一个关键的中间步骤，可使操作者在加入细胞前验证所用条件是否正确。该前体可在4°C下保存数周，但在使用前必须先在80°C孵育，随后在37°C孵育。合格的前体在80°C时应完全呈液态，在37°C时应具有自支撑性。这些检查对于确保凝胶能够正确形成至关重要。随后可在生理条件下加入细胞和/或基质。
已使用三维基质的实验室将熟悉在多肽凝胶中包埋细胞所需的谨慎操作。在包埋过程之前和期间，必须注意尽量减少对细胞的机械扰动。我们发现，特定类型的细胞在此过程中对损伤的敏感性存在差异，用户必须对此进行仔细评估。本文所述多肽凝胶的浓度可在一定时间内完成凝胶化，对于上述细胞而言，这一时间足以使细胞在沉降到包埋孔底部之前完成包埋，同时又足够缓慢，以避免细胞在此过程中受损。然而需要注意的是，某些敏感细胞类型可能需要更快地中和，以避免长时间暴露于升高的pH环境。在此情况下，向多肽凝胶周围的培养基中添加10 mM HEPES可能有益。
采用本方案所述方法时，必须仔细考虑肽来源的质量。此处的肽并非用作功能基序或包被材料，而是水凝胶中非溶解部分的全部组成。因此，任何杂质或肽结构的变异都可能对最终水凝胶的完整性或支持细胞存活的能力产生显著影响。当更换新批次的肽时，必须确保供应商提供的肽在批间具有一致性，同时需检测该肽在形成凝胶前体时的行为表现。
综上所述，本实验方案描述了一种三维培养系统，其关键在于能够独立调控机械性能和生物学特性。该方法简单且具有良好的适应性，适用于任何细胞培养实验室，并可用于多种应用5。未来，该方案可进一步拓展，以实现对肽序列的共价修饰。这可与先进的显微成像技术相结合，用于研究细胞对其周围基质施加的张力。然而，尤为重要的是能够区分人工引入的基质与被包埋细胞自身合成的基质。这种随时间推移对基质变化进行控制和监测的能力，将有助于前所未有地深入理解细胞-基质相互作用在癌症及其他疾病发展中的作用。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢以下资助：英国国家研究动物替代、优化与减少中心（NC3Rs）授予JCA、GF和CLRM的NC/N0015831/1项目，授予RBC、CLRM、JCA、KL-S和KS的NC/T001267/1项目，授予JCA、KL-S和CLRM的NC/T001259/1项目，以及授予AMG、SJ和CLRM的NC/P002285/1项目。同时感谢工程与物理科学研究理事会（EPSRC）对KL-S和CLRM的EP/R035563/1项目，以及对JLT和CLRM的EP/N006615/1项目的资助。图1使用了Servier医学艺术图库中的改编图形。Servier医学艺术图库由Servier提供，遵循知识共享署名3.0未本地化许可协议（Creative Commons Attribution 3.0 Unported License）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 凝胶制备 - 试剂 | |||
| FEFEFKFK | Pepceuticals | n/a | 多肽；可从多家供应商处获得。Pepceuticals 是我们推荐的供应商，因其产品质量优异。 |
| PBS 10X | Gibco | 70011-036 | |
| 氢氧化钠 (1 M) | Sigma-Aldrich | S2770 | NaOH；使用前稀释至 0.5 M |
| 水 | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| 凝胶制备 - 仪器与耗材 | |||
| 15 mL 圆底离心管 | Greiner | 188261 | 若使用其他品牌，请确保材料能耐受高达 90°C 的温度 |
| 24 孔板 | Corning Costar | 3524 | 可使用其他品牌/供应商，只要插入物底部与孔板表面之间存在间隙即可 |
| 离心机 | 任意 | 200 × g，离心 3 分钟 | |
| II 级微生物安全柜 | 任意 | ||
| 精密天平 | 任意 | 读数精度 0.1 mg | |
| 24 孔板用悬挂式插入物 | Millipore | MCRP24H48 | 可使用其他品牌/供应商，只要插入物底部与孔板表面之间存在间隙即可 |
| 培养箱 | 任意 | 37°C、5% CO₂、加湿环境 | |
| 烘箱 | 任意 | 设定为 80°C | |
| P1000/200/20/10 移液器 | 任意 | 用于该操作的移液器必须经过校准 | |
| P1000/200/20/10 吸头 | 任意 | ||
| 带微电极的 pH 计 | 任意 | ||
| 刮刀 | 任意 | ||
| 涡旋振荡器 | 任意 | ||
| 基质添加 | |||
| 胶原蛋白 I（人源） | Stem Cell Technologies | 07005 | |
| 胶原蛋白 I（大鼠尾部） | Gibco | A10483 | |
| 纤连蛋白 | Stem Cell Technologies | 07159 | |
| 透明质酸 | Iduron | HA804 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 细胞包埋/培养 | |||
| B27 补充剂（不含视黄酸） | Gibco | 12587010 | 无血清培养基添加物（图 2D） |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | C-8052 | MCF10A 细胞培养基添加物（图 3、5） |
| DMEM | Gibco | 21969-035 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | MCF10A 细胞培养基添加物（图 3、5） |
| 无酚红 DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | 无血清培养基添加物（图 2D） |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| EGF | SourceBiosciences | ABC016 | MCF10A 细胞培养基添加物（图 3、5） |
| 胎牛血清 | Gibco | 10500-064 | |
| 马血清 | Gibco | 26050-070 | MCF10A 细胞培养基添加物（图 3、5） |
| 人癌/上皮细胞系 | 例如 MCF7/tdTomato、MCF7/MCF10a/HCT116-mCherry | ||
| 人乳腺成纤维细胞 | 例如 HMFU19 | ||
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H-0888 | MCF10A 细胞培养基添加物（图 3、5） |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I9278 | MCF10A 细胞培养基添加物（图 3、5） |
| 无血清替代物（Knockout Serum Replacement） | Gibco | 10828-028 | 无血清培养基添加物（图 2D） |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-024 | |
| RPMI | Gibco | 21875-034 | |
| 无酚红 RPMI | Sigma-Aldrich | R7509 | |
| 成像及其他检测 | |||
| 4% 多聚甲醛 | Polysciences | 18814 | |
| 琼脂 | SLS | CHE1070 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | 5482 | |
| 共聚焦和/或荧光显微镜 | 任意 | 例如 Leica TCS SPE 共聚焦激光扫描显微镜（图 2-4） | |
| DAPI 溶液 | Invitrogen | D3571 | 工作液浓度为 300 µM |
| DPX 封片剂 | ThermoFisher Scientific | ||
| 玻璃盖玻片 | 任意 | 1 号盖玻片，厚度 0.13 - 0.17 mm | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | ||
| 山羊抗兔 IgG H&L（HRP 聚合物） | Abcam | ab214880 | |
| 苏木精和伊红 | 任意 | ||
| 组织学模具（一次性塑料） | 任意 | ||
| 图像分析软件 | ImageJ | ||
| 活/死细胞检测试剂盒 | Invitrogen | L3224 | |
| 切片机 | 任意 | ||
| 鬼笔环肽 | Life Technologies | F432/R415 | |
| Pierce 过氧化物酶 IHC 检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 36000 | |
| 一抗 Caspase 3 | Abcam | ab34710 | 见于图 3C |
| 一抗 胶原蛋白 I | Cell Signalling Technology | 9661 | 见于图 4B、C、F |
| 一抗 pFAK Tyr 397 | ThermoFisher Scientific | 44-624G | 见于 图 4E |
| 含 DAPI 的 Prolong Gold/Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | Molecular Probes | S36939 | |
| 流变仪 Physica MCR 301 | Anton Paar | ||
| 手术刀 | 任意 | ||
| 二抗 山羊抗兔 AF488 | Invitrogen | a11034 | |
| 二抗 山羊抗兔 AF546 | Invitrogen | a11010 | |
| SuperFrost 载玻片 | ThermoFisher Scientific | 涂层（如 APES）有助于将切片牢固附着于载玻片上。 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Gibco | 25300054 | |
| 振动切片机 | Leica |
参考文献
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