本方案提供了用于评估人乳腺细胞转化的体外实验工具。文中详细描述了检测细胞增殖速率、非贴壁依赖性生长能力，以及在含有基底膜基质的三维培养中细胞谱系分布的实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
肿瘤发生是一个多步骤的过程，在此过程中，细胞获得一系列能力 ，使其能够在不利条件下持续生长、存活并扩散。不同的实验方法旨在识别和量化癌细胞的这些特征；然而，这些方法通常仅关注细胞转化的某一特定方面，实际上需要多种检测手段才能对细胞转化进行准确表征。本研究的目的是为研究人员提供一套工具，以更全面的视角在体外评估细胞转化，从而得出可靠的结论。
持续的增殖信号激活是肿瘤组织的主要特征，可通过计算随时间推移所达到的群体倍增次数，在体外条件下轻松监测。此外，细胞在三维培养中的生长可使其与周围细胞相互作用，更接近体内真实情况。这使得研究人员能够评估细胞聚集行为，并结合特异性细胞标志物的免疫荧光标记，获取有关肿瘤转化另一重要特征的信息：正常组织结构的丧失。转化细胞的另一个显著特征是其无需依附于其他细胞或细胞外基质即可生长的能力，该特性可通过锚定依赖性实验进行评估。
本文提供了评估细胞生长速率、在三维培养中对细胞谱系标志物进行免疫荧光标记以及在软琼脂中检测细胞锚定非依赖性生长的详细实验步骤。这些方法针对乳腺原代上皮细胞（BPEC）进行了优化，因其在乳腺癌研究中的重要性；但经过适当调整后，也可应用于其他类型的细胞。
引言
肿瘤的发生需要多个连续事件的积累。2011年，Hanahan 和 Weinberg 提出了使转化细胞能够生长、存活和扩散的10种能力，即所谓的“癌症标志性特征”1。本文所述的方法整合了三种不同的工具，通过聚焦肿瘤细胞的一些特有特征，用于评估体外细胞转化。这些技术可评估细胞增殖速率、细胞在三维培养中的行为，以及细胞在非贴壁依赖条件下形成克隆的能力。
细胞模型对于体外验证假设至关重要。为研究癌症，已开发出多种方法以建立细胞转化的实验模型。2,3,4由于乳腺癌是全球女性中最常见的癌症，约占癌症死亡病例的15% 在女性中5，为深入研究提供合适的乳腺上皮细胞模型至关重要。本文展示了三种技术在评估细胞转化方面的潜力，所用实验模型为乳腺原代上皮细胞（BPECs）的转化，该模型最初由Ince及其同事于2007年描述。6 并在我们实验室中后续实施7。该实验模型基于对三个靶向基因的依次修饰（SV40 Large T 和 small t 抗原，下文中简称为 Ttag, hTERT....
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方案
以下实验所用的人体样本来自巴塞罗那的Clínica Pilar Sant Jordi诊所按照标准程序签署知情同意书后开展的乳房缩小成形术。除非另有说明，所有操作均在II级生物安全柜中进行。
1. 人乳腺上皮细胞的体外培养及生长曲线绘制
- 乳腺原代上皮细胞（BPECs）的体外培养：细胞传代
注意：BPEC的分离与细胞培养请参照Ince等（2007）6所述方法。- 培养基制备。
- 根据培养的是原代或转化的BPEC，向WIT基础培养基中添加制造商提供的P或T补充剂。
- 向补充后的WIT培养基中加入霍乱毒素，终浓度为原代BPEC 100 ng/mL，转化BPEC 25 ng/mL。
警告：霍乱毒素若吞食可致死。使用时需佩戴个人防护装备，避免其释放至环境中。
- 细胞培养的维持与传代。
注意：以下步骤以T25培养瓶中的细胞为例。然而，可根据培养容器的表面积按比例调整体积。- 每日观察细胞汇合度。当培养物达到90%汇合时，进行细胞传代。
- 为每个培养瓶准备1×PBS、3×胰蛋白酶、培养基，以及一个含有2 mL胎牛血清（FBS）的15 mL离心管。
- 培养基制备。
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结果
选择在BPECs中引入三种遗传元件的细胞转化实验模型，以产生具有代表性的肿瘤发生转化结果6,7（图3）。非转化的BPECs（N）来源于无疾病的乳腺组织，其获取方法由Ince及其同事所述6，并按照本文所述方案进行培养。在克服STASIS（即应激或异常信号诱导的衰老，这是体外培养乳腺上皮细胞时通常观察到的现象，一般在细胞培养建立后约4周被克服）后，细胞依次转导慢病毒颗粒pRRL-CMV-Ttag-IRES-eGFP和pRRL-CMV-TERT-IRES-CherryFP，获得部分转化细胞（双次转导；D）。病毒Ttag的表达可抑制p53和视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma）功能，而外源性表达hTERT基因可补偿增殖依赖性的端粒长度缩短。经流式细胞分选进行荧光筛选后，细胞.......
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讨论
本文所述的实验方案为评估体外培养细胞的癌变转化提供了有用的工具。每种技术仅评价转化过程的特定方面，因此在根据单一分析得出结论时必须特别谨慎。生长曲线的建立是一种方法，其所需信息在为其他目的培养细胞时通常已经具备，这使得该技术相较于其他细胞增殖检测方法更为经济且易于实施。然而，为了获得有效的结果，在每次传代培养时对细胞进行计数和接种都必须格外注意。生长速率的增加提示细胞可能发生转化1，但不应单独依赖此指标，因为其他外源性因素，如抗生素和抗真菌物质的添加或去除，或培养条件（例如温度、CO2浓度）的变化，也可能影响细胞分裂。还应注意到，细胞转导或药物处理可能在随后数天或数周内影响其生长速率，从而导致对长期增殖能力的误判。因此，必须设置适当的对照实验。
在基底膜基质中进行三维培养，可评估细胞在一个完整功能单位——腺泡内的分布情况。结构排列异常提示细胞间通讯受损，可能导致功能丧失，这是肿瘤组织的特征之一。某些腺泡呈现非极性排列，表明部分细胞已启动转化过程。在技术层面，准确确定接种细胞的最.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
AG 实验室由西班牙核安全委员会资助。T.A. 和 A.G. 是一个获认可的研究团队的成员 加泰罗尼亚自治区政府 （2017-SGR-503）。MT 的合同由科学基金会资助 西班牙抗癌协会 [AECC-INVES19022TERR]。G.F. 的合同由Cellex基金会的资助提供资金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 血清学移液管 | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml 离心管 | 赛默飞世尔科技 | 3451 | 长期储存 MTT 时，建议使用避光离心管 |
| 10 μ无滤芯移液器吸头 | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml 玻璃瓶 | 带盖，可高压灭菌 | ||
| 1000 μ带滤芯的移液器吸头 | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μ无滤芯移液器吸头 | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml 离心管 | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml 血清学移液管 | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μ带滤芯的移液器吸头 | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml 血清移液管 | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml 离心管 | VWR | 525-0304 | |
| 丙酮 | PanReac AppliChem | 211007 | 用于免疫荧光标记前的三维结构固定 |
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | A1296 | 用于锚定实验 |
| 抗Claudin 4抗体 | Abcam | 15104，RRID:AB_301650 | 工作浓度 1:100，宿主：兔 |
| 抗细胞角蛋白14 [RCK107] 抗体 | Abcam | 9220，RRID:AB_307087 | 工作浓度 1:100，宿主：小鼠 |
| 抗小鼠花青素Cy3抗体 | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146，RRID:AB_2338690 | 工作浓度 1:500，宿主：山羊 |
| 抗兔 Alexa Fluor 488 抗体 | 赛默飞世尔科技 | A-11034，RRID:AB_2576217 | 工作浓度 1:500，宿主：山羊 |
| 高压灭菌 | |||
| BioVoxxel 工具箱 | RRID:SCR_015825 | ||
| 细胞培养24孔板 | Labclinics | PLC30024 | 用于 Matrigel 中的三维培养。平底 |
| 细胞培养6孔板 | Labclinics | PLC30006 | 用于锚定实验 |
| 细胞培养箱（37 ºC 和 5% CO2） | |||
| 细胞筛 | Fisherbrand | 11587522 | 网孔尺寸：40 μm |
| CellSense 软件 | 奥林巴斯 | 用于图像采集 | |
| 离心 | |||
| 霍乱弧菌霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | C8052 | 用于补充细胞培养基 |
| II级生物安全柜 | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| 共聚焦倒置显微镜 | Leica | TCS SP5 | |
| 盖玻片 | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 × 22 mm，厚度 0.13 - 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-脒 | ||
| 胎牛血清 | Biowest | S1810 | 用于灭活胰蛋白酶活性 |
| Fiji 软件（ImageJ） | 美国国立卫生研究院 | RRID:SCR_002285 | 免费下载，无需许可证 |
| 玻璃巴斯德吸管 | |||
| 载玻片 | Fisherbrand | 11844782 | |
| 山羊血清 | Biowest | S2000 | 用于三维结构的免疫荧光染色 |
| 耐热手套 | 用于高压灭菌后琼脂的操作 | ||
| 加热浴（37 ºC) | 用于细胞传代前对溶液进行温度平衡 | ||
| 加热浴（42 ºC) | 用于保持琼脂的温度 | ||
| 加热板 | 用于 Matrigel 脱水 | ||
| 湿盒 | 用于免疫荧光实验中抗体的孵育 | ||
| 冰 | 用于 Matrigel 操作过程中 | ||
| 冰盒 | |||
| 倒置光学显微镜 | Olympus | IX71 | |
| Matrigel基质 | Becton Dickinson | 354234 | -20℃保存 ºC，使用时保持低温。称为基底膜基质 |
| 甲醇 | PanReac AppliChem | 131091 | 用于免疫荧光标记前的三维结构固定 |
| 微量移液器 | p1000、p200 和 p10 | ||
| Microsoft Office Excel | 微软 | RRID:SCR_016137 | 用于计算群体倍增时间并获得生长速率方程 |
| MilliQ 水 | 被称为超纯水 | ||
| 指甲油 | 用于封片后密封样本 | ||
| Parafilm M | 贝米斯 | PM-999 | 用于孵育期间覆盖抗体溶液 |
| PBS pH 7.4（不含钙） &和镁） | Gibco | 10010-056 | 无菌。用于细胞传代培养 |
| PBS片剂 | Sigma-Aldrich | P4417 | 用超纯水稀释。无需无菌。用于免疫荧光 |
| 移液器辅助器 | |||
| Primaria T25 培养瓶 | 康宁 | 353808 | 用于BPEC培养 |
| Scepter 自动细胞计数器 | Millipore | PHCC20060 | 或者，使用血细胞计数板 |
| 剪刀 | 用于切割移液器吸头和封口膜 | ||
| 0.22 微米无菌滤器 μm | Millipore | SLGP033RS | 用于过滤 MTT 溶液 |
| 噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT） | Sigma-Aldrich | M2128 | -20℃保存 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 用于三维结构的免疫荧光染色 |
| 胰蛋白酶-EDTA 10倍浓缩液 | Biowest | X0930 | 用 PBS 稀释，得到 3X 溶液 |
| Vectashield 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC 培养基 | Stemgent | 00-0051 | 用于原代BPEC培养 |
| WIT-T 培养基 | Stemgent | 00-0047 | 用于转化的BPEC培养 |
参考文献
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 ....
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