MS2亲和纯化联合RNA测序在革兰氏阳性菌中的应用

摘要

MAPS 技术已开发用于在体内深入分析特定调控 RNA 的靶标组。感兴趣的 sRNA 被标记上 MS2 适体，从而实现其 RNA 相互作用伙伴的共纯化，并通过 RNA 测序对其进行鉴定。该改进后的实验方案特别适用于革兰氏阳性细菌。 

摘要

尽管小调控RNA（sRNA）在细菌生命域中广泛存在，但由于难以鉴定其mRNA靶标，许多sRNA的功能仍表征不足。本文介绍了一种改良的MS2亲和纯化结合RNA测序（MAPS）技术方案，旨在体内揭示特定sRNA的所有RNA互作伙伴。总体而言，将MS2适配体融合至目标sRNA的5'末端，构建该融合表达系统并在体内表达，使MS2-sRNA能够与其细胞内互作分子结合。细菌收获后，通过机械裂解细胞获得裂解液。将粗提物加载至预先包被MS2蛋白（与麦芽糖结合蛋白融合）的淀粉样亲和层析柱中，从而特异性捕获MS2-sRNA及其相互作用的RNAs。洗脱后，通过高通量RNA测序及后续生物信息学分析鉴定共纯化的RNA。该方案已在革兰氏阳性人类病原体Staphylococcus aureus中成功实施，原则上可推广至其他任何革兰氏阳性细菌。综上所述，MAPS技术是一种深入探索特定sRNA调控网络的有效方法，可提供其完整靶标组（targetome）的快照。然而需注意的是，MAPS鉴定出的潜在靶标仍需通过其他互补的实验手段加以验证。

引言

在大多数细菌基因组中已鉴定出数百个甚至数千个小调控RNA（sRNA），但其中绝大多数的功能尚未明确。总体而言，sRNA是一类短的非编码分子，在细菌生理功能及适应不断变化的环境过程中发挥着重要作用^1,2,3。事实上，这些大分子处于众多复杂调控网络的核心，影响着代谢通路、应激反应，以及毒力和抗生素耐药性。逻辑上，它们的合成由特定的环境刺激触发（例如营养缺乏、氧化应激或膜应激）。大多数sRNA通过短而间断的碱基配对，在转录后水平调控多个靶标mRNA。它们通常通过与核糖体竞争翻译起始区来抑制翻译起始⁴。sRNA与mRNA形成双链结构后，还常常通过招募特定的核糖核酸酶，导致靶标mRNA被主动降解。

对sRNA靶标组（即其全部靶标RNA的集合）进行表征，有助于识别其参与的代谢通路及其可能响应的信号分子，从而通常可依据靶标组推断特定sRNA的功能。为此，已开发出多种基于计算机的预测工具，例如IntaRNA和CopraRNA^5,6,7。这些工具主要依赖序列互补性、配对能量以及潜在相互作用位点的可及性，以确定可能的sRNA靶标。然而，预测算法并未整合所有影响体内碱基配对的因素，例如RNA伴侣蛋白⁸可能促进非最优相互作用，或两个分子是否共表达。由于存在固有局限性，预测工具的假阳性率仍然较高。大多数实验性的高通量方法依赖于使用带标签的RNA结合蛋白（RBP）共纯化相互作用的sRNA:mRNA复合物^6,9。例如，RNA相互作用连接测序法（RIL-seq）鉴定了与大肠杆菌（Escherichia coli）中的RNA伴侣蛋白Hfq和ProQ共纯化的RNA双链体^10,11。一种类似的技术称为杂交体紫外线交联、连接与测序法（CLASH），已被应用于纯化与大肠杆菌（E. coli）中RNase E和Hfq相关的sRNA^12,13。尽管Hfq和ProQ在多种细菌中介导sRNA调控的作用已被广泛报道^8,14,15，但在金黄色葡萄球菌（S. aureus）等若干生物体中，sRNA介导的调控似乎不依赖RNA伴侣蛋白^16,17,18。尽管Waters及其同事已证明与RNase共同纯化RNA双链体是可行的¹³，但该方法仍具挑战性，因为RNase会迅速降解RNA。因此，在此类生物体中，MS2亲和纯化联合RNA测序（MAPS）方法^19,20提供了一种可靠的替代方案。

与上述方法不同，MAPS 利用特定的小RNA（sRNA）作为诱饵来捕获所有与其相互作用的RNA，因此不依赖于RNA结合蛋白（RBP）的参与。整个流程如图1所示。简而言之，sRNA在其5’端标记有MS2 RNA适配体，该适配体可被MS2外壳蛋白特异性识别。该蛋白与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合，从而能够固定在淀粉样树脂上。因此，MS2-sRNA及其RNA互作伙伴将保留在亲和层析柱中。经麦芽糖洗脱后，通过高通量RNA测序结合生物信息学分析鉴定共纯化的RNA（图2）。MAPS技术最终可绘制出体内所有潜在RNA相互作用的互作图谱。

MAPS 技术最初在非致病性革兰氏阴性细菌 E. coli²¹ 中得以实现。值得注意的是，MAPS 帮助鉴定出一种源自 tRNA 的片段，该片段可特异性地与 RyhB 和 RybB 两种 sRNA 相互作用，并在非诱导条件下阻止任何 sRNA 的转录噪声对 mRNA 靶标的调控。此后，MAPS 已成功应用于其他 E. coli sRNA，如 DsrA²²、RprA²³、CyaR²³ 和 GcvB²⁴（表 1）。除了验证先前已知的靶标外，MAPS 还扩展了这些著名 sRNA 的靶标组。最近，MAPS 在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）中也得以应用，揭示了 SraL sRNA 可结合编码转录终止因子的 rho mRNA²⁵。通过这种配对，SraL 可保护 rho mRNA 免受 Rho 蛋白自身引发的过早转录终止。有趣的是，该技术不仅限于 sRNA，还可应用于其他类型的细胞 RNA，例如 tRNA 衍生片段²⁶ 和 mRNA 的 5’-非翻译区²²（表 1）。

MAPS 方法也已适用于致病性革兰氏阳性菌 S. aureus¹⁹。 具体而言，由于革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌更厚，为有效裂解细胞并保持 RNA 完整性，裂解方案已进行了大幅修改。该优化后的方案已成功解析了 RsaA²⁷、RsaI²⁸ 和 RsaC²⁹ 的相互作用组。该方法揭示了这些小 RNA（sRNAs）在调控细胞表面特性、葡萄糖摄取以及氧化应激反应等机制中的关键作用。

2015年在E. coli中开发并实施的实验方案最近已有详细描述³⁰。本文提供了经过修改的MAPS实验方案，该方案特别适用于研究革兰氏阳性菌（细胞壁较厚）中的小RNA调控网络，无论其为非致病性或致病性细菌（需采取安全防护措施）。

方案

1. 缓冲液与培养基

1. 进行 MAPS 实验时，配制以下缓冲液和培养基：
   - 缓冲液 A（150 mM KCl，20 mM Tris-HCl pH 8，1 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT）
   - 缓冲液 E（250 mM KCl，20 mM Tris-HCl pH 8，12 mM 麦芽糖，0.1% Triton，1 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT）
   - RNA 上样缓冲液（8 M 尿素中含 0.025% 洋红腈和 0.025% 溴酚蓝）
   - 脑心浸出液（BHI）培养基（每升含小牛脑 12.5 g、蛋白胨 10 g、牛心 5 g、NaCl 5 g、Na₂HPO₄ 2.5 g 和葡萄糖 2 g）
   - 营养肉汤（LB）培养基（每升含蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g 和 NaCl 10 g）
2. 进行 Northern 印迹分析时，配制以下缓冲液：
   - 封闭液（1× 马来酸缓冲液和 1% 封闭试剂）
   - 杂交液（50% 甲酰胺，5× SSC，7% SDS，1% 封闭液，0.2% N-月桂酰肌氨酸钠，50 mM 磷酸钠）。加热并振荡至完全溶解。
   注意：请严格遵守每种产品的安全操作规程。
   - 1 M 磷酸钠（58 mM 磷酸氢二钠和 42 mM 磷酸二氢钠）
   - 氯化钠柠檬酸钠（SSC）缓冲液，20× 浓缩液（3 M NaCl 和 300 mM 柠檬酸三钠）

2. 安全问题

1. 所有涉及活体致病菌的操作均须在二级生物安全实验室中进行。
   注意：裂解后（步骤5）仅细胞提取物可移出实验室。
2. 穿戴实验服和手套。
3. 确保手腕部位被完全覆盖。
4. 使用消毒液清洁生物安全柜（II级）。
5. 将接触过细菌的固体废弃物丢弃至指定的生物医学废物容器中。
6. 用消毒液处理含有污染液体的烧瓶，然后倒入水槽中弃置。
7. 离开二级生物安全实验室前，须用肥皂仔细清洗手部和手腕，并脱下实验服。

3. 质粒构建

注意：出于克隆目的，首先确定内源性小RNA（sRNA）的边界至关重要。pCN51-P3 和 pCN51-P3-MS2 质粒的描述见 Tomasini 等（2017）²⁷。P3 启动子可在细胞密度依赖的方式下实现 sRNA 的高水平表达（即当细菌进入生长的稳定期时）。许多葡萄球菌的小RNA在此生长阶段积累。

1. 使用高保真DNA聚合酶和PCR仪，通过PCR扩增sRNA序列。请严格遵循制造商说明书，并阅读Garibyan和Avashia（2013）的相关内容。³¹ 详情请见。
2. 使用以下模板设计特异性引物：
   
   和 5’-CGCGGATCC(N)-3’，分别用于正向和反向引物。
   注意：这些寡核苷酸可用于将MS2序列（加粗）连接至目标小RNA（sRNA）的5'端。 Pst我与 Bam在 MS2-sRNA 构建体的 5’ 和 3’ 末端添加了 HI 限制性酶切位点（下划线标出），以便将扩增子克隆至 pCN51-P3 质粒中²⁷(N) 对应于基因特异性序列（15-20 个核苷酸）。
3. 用2 U的限制性内切酶分别消化1 µg pCN51-P3质粒和1 µg MS2-sRNA PCR产物 PstI 和 1 U 的 Bam根据制造商的建议，在适当的缓冲液中进行HI。
4. 37 °C 下孵育 1 小时，使用 PCR 纯化试剂盒纯化 DNA（参见 材料表).
5. 将消化后的pCN51-P3质粒（300 ng）与MS2-sRNA扩增子（载体与插入片段的摩尔比为1:3）加入1.5 mL离心管中混合。参见Revie et al. (1988)³² 为最大化连接效率，每个试管中加入1 µL连接酶缓冲液和10 U T4连接酶，用超纯水将体积调至10 µL。
6. 在22 °C下孵育至少2小时。
7. 将5 µL连接混合物加入50 µL冻存的DH5α化学感受态细胞中 E. coli 细胞。参见 Seidman 等（2001）³³ 了解质粒转化和化学感受态细胞的更多信息。
8. 冰上孵育30分钟。
9. 将转化管置于预热至42 °C的金属浴或水浴中热激45秒。
10. 加入900 µL LB培养基，37 °C孵育30分钟。
11. 在添加氨苄青霉素（100 µg/µL）的LB琼脂平板上接种100 µL细菌悬液。  
    注意：pCN51-P3 载体编码氨苄青霉素抗性基因，可用于筛选仅含该载体的转化子 E. coli 携带 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒的克隆
12. 从含有氨苄青霉素（100 µg/µL）的过夜培养细菌（5 mL）中，使用质粒DNA小提试剂盒提取pCN51-P3-MS2-sRNA质粒（参见 材料表).
13. 通过Sanger测序验证构建³⁴ 使用以下引物：5’-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3’。 
14. 将 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒转化至化学感受态 DC10B 中 E. coli 细胞。重复步骤 3.7 至 3.11。
15. 提取pCN51-P3-MS2-sRNA质粒（见步骤3.12），并将1–5 µg质粒DNA转化至HG001 ΔsRNA电转感受态细胞中 S. aureus 使用电穿孔仪转染细胞。请仔细遵循制造商的说明。参阅 Grosser 和 Richardson（2016）³⁵ 了解有关制备电转感受态细胞的方法 S. aureus.
    警告：此步骤涉及病原菌的操作（参见步骤 2）.
16. 加入900 µL BHI培养基，37 °C孵育3小时。
17. 离心1分钟，16,000 x g弃去上清液。
18. 将沉淀重悬于100 µL BHI培养基中，并将菌液涂布于添加红霉素（10 µg/µL）的BHI琼脂平板上。  
    注意：pCN51-P3 载体还编码一个红霉素抗性基因，可用于筛选仅含该载体的细胞 S. aureus 携带 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒的克隆

4. 细菌收获

注意：此步骤涉及病原菌的操作（参见步骤 2）。

1. 将含有 pCN51-P3-MS2-sRNA 或 pCN51-P3-MS2²⁷ 质粒的菌株分别接种于 3 mL 添加红霉素（10 µg/µL）的 BHI 培养基中，每组设两个重复，培养至单菌落。
2. 将过夜培养物按约 1/100 的比例转接至 50 mL 新鲜的含红霉素（10 µg/µL）BHI 培养基中，调整初始 OD_600nm 至 0.05。使用 250 mL 灭菌锥形瓶（培养液体积与瓶容量之比为 5:1）。
   注意：培养基及培养条件应根据所研究 sRNA 的表达模式进行相应设置。
3. 在 37 °C、180 rpm 振荡条件下培养 6 小时。
4. 将每份培养物转移至 50 mL 离心管中。
5. 在 4 °C 条件下，以 2,900 x g 离心 15 分钟，弃去上清液。
6. 将菌体沉淀置于冰上，立即进行机械裂解细胞（步骤 5），或于 -80 °C 冷冻保存。

5. 机械细胞裂解

注意：以下步骤必须在冰上进行，缓冲液温度应保持在 4 °C。请佩戴手套，并采取所有预防措施以防止样本受到 RNase 污染。

1. 将沉淀物（步骤 4.6）重悬于 5 mL 缓冲液 A 中。
2. 将重悬的细胞转移至 15 mL 离心管中，加入 3.5 g 二氧化硅珠（0.1 mm）。
3. 将离心管放入机械细胞裂解仪中（见材料表），以 4.0 m/s 运行 40 秒。
   注意：如果一个循环不足以裂解细胞，可将仪器冷却 5 分钟，同时将样品置于冰上。然后重复另一个 40 秒、4.0 m/s 的循环。可通过将上清液涂布于 BHI 琼脂平板来检测细胞裂解效率。
4. 在 15,700 × g 条件下离心 15 分钟，收集上清液并置于冰上保存。

6. 柱层析柱的制备

注意：切勿让直链淀粉树脂变干。如有需要，可用端盖密封层析柱。在开始亲和纯化之前，准备好所有溶液。

1. 将层析柱放入层析柱支架中（参见材料表）。
2. 移除层析柱尖端，并用超纯水清洗层析柱。
3. 加入 300 µL 淀粉树脂。
4. 用 10 mL 缓冲液 A 洗涤层析柱。
5. 将 1,200 pmol 的 MBP-MS2 蛋白用 6 mL 缓冲液 A 稀释后上样至层析柱中。
6. 用 10 mL 缓冲液 A 洗涤层析柱。

7. MS2 亲和纯化（图1）

1. 将细胞裂解液加入柱中。
   注意：保留 1 mL 细胞裂解液（粗提物，CE），用于提取总 RNA（步骤 8）、进行 Northern 印迹（步骤 9）和转录组学分析（步骤 10）。
2. 用干净的收集管收集穿流组分（FT）。
3. 用 10 mL 缓冲液 A 洗柱 3 次，收集洗涤组分（W）。
4. 用 1 mL 洗脱缓冲液 E 洗脱柱，并将洗脱组分（E）收集到 2 mL 微量离心管中。
5. 将所有收集的组分置于冰上，直至进行 RNA 提取（步骤 8），或在 -20 °C 冻存以备后续使用。

8. 收集组分（CE、FT、W 和 E）的 RNA 提取

1. 取1 mL每种组分（包括流穿组FT和洗涤组W）用于RNA提取。
2. 加入1体积酚，剧烈混匀。
   注意：酚具有挥发性和腐蚀性，操作时需格外小心，并在通风橱内安全操作。
3. 在20 °C下以16,000 × g 离心10分钟。
4. 将上层液体转移至洁净的2 mL微量离心管中。
5. 加入1体积氯仿/异戊醇（24:1），重复步骤8.3至8.4。
   注意：请在通风橱内安全操作。
6. 加入2.5体积预冷的100%乙醇和1/10体积的3 M醋酸钠（NaOAc）pH 5.2。
7. 在-20 °C下沉淀过夜。
   备注：也可在乙醇/干冰浴中沉淀20分钟，或在-80 °C下沉淀2小时。
8. 在4 °C下以16,000 × g 离心15分钟，用移液器缓慢吸除乙醇，注意不要扰动沉淀。
   注意：RNA沉淀并不总是可见，且在乙醇存在时有时较为松散。
9. 加入500 µL预冷的80%乙醇。
10. 在4 °C下以16,000 × g 离心5分钟。
11. 用移液器缓慢吸弃乙醇，使用真空浓缩仪在运行模式下干燥沉淀5分钟。
12. 将沉淀溶于适量体积（15–50 µL）的超纯水中，于-20 °C保存以备后续使用。
13. 使用分光光度计/荧光计（见材料表）测定RNA浓度（260 nm）和纯度（260/280和260/230波长比值），并严格遵循仪器制造商的操作说明。
    备注：通常在洗脱组分（E）中可获得3–4 µg RNA，具体产量主要取决于实验条件。

9. 通过Northern印迹分析MS2亲和纯化³⁶

1. 将CE、FT、W组分的5 µg RNA以及E组分的500 ng RNA溶于10 µL超纯水中，再与10 µL RNA上样缓冲液混合。
2. 在90 °C下孵育3分钟。
3. 将样品加入含有20 mM硫氰酸胍的1%琼脂糖凝胶孔中，在4 °C条件下以100–150 V电压在1× TBE缓冲液中电泳。更多细节请参见Koontz (2013)³⁷。
4. 通过真空转移1小时或毛细管转移过夜，将RNA转移至硝酸纤维素膜上。
   注意：毛细管转移法对大片段RNA更有效。
5. 使用紫外交联仪在254 nm波长、120 mJ强度下对膜上的RNA进行紫外交联。
6. 将膜放入杂交瓶中，RNA面朝上。
7. 加入10–20 mL预热的杂交液，在68 °C下孵育30分钟。
8. 弃去溶液，加入10–20 mL新鲜杂交液，并添加1 µL特异性sRNA探针。在68 °C下孵育过夜。
   注意：地高辛（DIG）标记的RNA探针使用DIG RNA标记试剂盒并按照制造商说明合成。也可使用放射性标记探针。
9. 用10–20 mL洗涤液1（2× SSC和0.1% SDS）在20 °C下洗涤膜5分钟，重复一次。
10. 用10–20 mL洗涤液2（0.2× SSC和0.1% SDS）在68 °C下洗涤膜15分钟，重复一次。
11. 加入10–20 mL封闭液，在20 °C下孵育至少30分钟。
12. 弃去封闭液，加入10–20 mL含多克隆抗地高辛抗体（1/1000稀释）、碱性磷酸酶偶联物的封闭液，在20 °C下孵育30分钟。
13. 用10–20 mL洗涤液3（1×马来酸缓冲液和0.3% Tween 20）在20 °C下洗涤膜15分钟，重复一次。
14. 加入10–20 mL检测缓冲液（0.1 M Tris HCl和0.1 M NaCl，pH 9.5），在20 °C下孵育5分钟。
15. 将膜置于塑料膜上，滴加底物（见材料表），避光孵育5分钟。
16. 用塑料膜密封膜，放入放射自显影暗盒中。
17. 在专用暗室中将膜与放射自显影胶片接触曝光。
    注意：曝光时间取决于信号强度，从数秒至数分钟不等。
18. 将曝光后的胶片放入自动显影仪中显影。

10. RNA测序样品的制备

注意：此步骤仅适用于从 E 和 CE 组分中提取的 RNA。

1. 向每个样品中加入 10 µL 10x DNase 缓冲液和 DNase I（每微克待处理 RNA 加入 1 U）。加入水，使终体积为 100 µL。
2. 在 37 °C 下孵育 1 小时。
3. 按照前述方法提取并纯化 RNA（步骤 8.2 至 8.11）。
4. 将 RNA 沉淀重悬于 20 µL 超纯水中。
   注意：可使用 PCR 及特异性引物（例如 16S 基因）检测残留 DNA 的存在。
5. 使用基于微流控的电泳分析系统评估 RNA 的浓度和质量（参见 材料表）。
   注意：DNase 处理后，洗脱组分（E）中通常可获得 1 µg RNA。
6. 使用细菌 rRNA 耗竭试剂盒去除核糖体 RNA。
   注意：大量且丰度高的 RNA（即 rRNA）倾向于非特异性结合亲和柱。此步骤需要 500 ng 提取的 RNA。
7. 再次使用基于微流控的电泳分析系统评估 RNA 的浓度和质量。
8. 使用 cDNA 文库构建试剂盒，按照制造商说明，以 10–20 ng 去除核糖体后的 RNA 制备 cDNA 文库。
9. 使用测序仪对获得的文库进行测序（例如单端测序，150 bp；参见 材料表）。
   注意：每个样品通常获得 500 万至 1000 万条读长即可满足需求。

11. RNA测序数据分析（图2）

1. 从测序平台下载 FastQ 测序文件。
2. 访问罗斯科夫生物站的 Galaxy 实例（https://galaxy.sb-roscoff.fr/）并登录。
   注意：所有提及的算法均可通过搜索栏轻松找到。每个工具均提供用户指南。
   警告：所需工具的版本可能与公共 Galaxy 服务器上的版本不同³⁸。
3. 点击 获取数据 图标，然后选择 从您的计算机上传文件。上传每个 MS2 对照样本和 MS2-sRNA 样本的 FastQ 测序文件。同时上传 FASTA 参考基因组文件和 GFF 注释文件。
4. 运行 FastQC 读段质量报告（Galaxy 版本 0.69）。
   注意：该工具可对原始序列进行质量评估（例如，质量值、接头序列的存在情况）。
5. 运行 Trimmomatic 灵活读段修剪工具（Galaxy 版本 0.36.6），主要用于去除接头序列和低质量读段。输入文库制备过程中使用的接头序列（例如，TruSeq 3，单端）。添加以下 Trimmomatic 操作：SLIDINGWINDOW（碱基数=4；平均质量=20）和 MINLEN（最小读段长度=20）。
6. 再次运行 FastQC 读段质量报告（Galaxy 版本 0.69）。
7. 运行 Bowtie2 — 将读段比对至参考基因组（Galaxy 版本 2.3.2.2）。使用历史记录中的参考基因组 FASTA 文件，采用默认设置（高灵敏度局部比对）进行读段比对。
   注意：Bowtie2 工具生成的 BAM 文件可使用 Integrative Genomics Viewer（IGV）进行可视化。同时需要关联的 BAI 文件。
8. 可选：运行 Flagstat，用于汇总 BAM 数据集的统计信息（Galaxy 版本 2.0）。
9. 运行 htseq-count — 计数（Galaxy 版本 0.6.1），将读段与 GFF 注释文件中的特征重叠区域进行比对。使用“交集（非空）”模式。
10. 将所有来自 htseq-count 分析的原始计数文件归档为一个 Zip 压缩文件。
11. 运行 SARTools DESeq2 以比较数据（Galaxy 版本 1.6.3.0）。提供包含原始计数文件的 Zip 文件以及实验设计文件（一个制表符分隔的文本文件，用于描述实验设计）。请严格按照提供的说明生成设计文件。

结果

代表性结果来源于对S. aureus中RsaC靶标组的研究²⁹。RsaC是一种非常规的长1,116 nt的小RNA，其5’端包含多个重复区域，而其3’端（544 nt）在结构上独立，并包含所有预测的与mRNA靶标相互作用的位点。当锰（Mn）缺乏时，该小RNA的表达被诱导，这种情况常出现在宿主免疫反应的背景下。利用MAPS技术，我们鉴定了多个与RsaC直接相互作用的mRNA，揭示了RsaC在氧化应激（sodA、ldh1和sarA）以及金属相关（znuBC-zur和sufCDSUB）应答中的关键作用。

MS2-sRNA 构建体及实验条件的验证
在进行 MAPS 实验之前，确定所研究 sRNA 表达的最佳条件至关重要。如果使用非天然启动子，将有助于在靶标存在时有效表达 MS2-sRNA 构建体。此外，应仔细验证 MS2-sRNA 构建体的大小、稳定性、表达水平和功能。MS2 适配体被融合至全长...

讨论

一种适用于革兰氏阳性菌的改良方案
MAPS 的初始方案旨在研究模式生物 E. coli^20,30 中的小RNA相互作用组。本文中，我们描述了一种改良后的方案，适用于机会性人类病原体 S. aureus 中依赖小RNA的调控网络的表征，且该方案无疑可推广至其他革兰氏阳性菌，无论其是否具有致病性。

特别关注了细胞裂解步骤。已使用机械细胞裂解仪替代法式高压破碎仪。该方法能有效裂解革兰氏阳性菌细胞，并降低操作致病菌株相关的风险。为了提高MS2亲和纯化的得率，已大幅增加固定在直链淀粉树脂上的MS2-MBP的量。这需要调整洗涤的严格程度和洗涤次数。

与初始方案不同，MAPS 从两个生物学重复样本中分别进行，每个样本重复操作一次。已开发出一套工作流程以实施统计分析（图2），从而显著提高...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Sarstedt	72.690.001
15 mL 离心管	Falcon	352070
2 mL 微量离心管	Starstedt	72.691
2100 生物分析仪	Agilent	G2939BA	RNA 定量与质量检测
250 mL 培养瓶	Dominique Dutscher	2515074	细菌培养
50 mL 离心管	Falcon	352051	培养物离心
无水乙醇	VWR Chemicals	20821.321	RNA 提取与纯化
Allegra X-12R 离心机	Beckman Coulter		细菌沉淀
氨苄青霉素（amp）	Sigma-Aldrich	A9518-5G	培养基
淀粉树脂	New England BioLabs	E8021S	MS2 亲和纯化
抗地高辛碱性磷酸酶 Fab 片段	Sigma Aldrich	11093274910	Northern 印迹分析
自显影胶片盒	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Northern 印迹分析
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	质粒构建
BHI（脑心浸液）肉汤	Sigma-Aldrich	53286	培养基
封闭试剂	Sigma Aldrich	11096176001	Northern 印迹分析
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Northern 印迹分析（底物）
Centrifuge 5415 R 离心机	Eppendorf		RNA 提取与纯化
氯仿	Dominique Dutscher	508320-CER	RNA 提取与纯化
DIG-RNA 标记混合物	Sigma-Aldrich	11277073910	Northern 印迹分析
DNase I	Roche	4716728001	DNase 处理
红霉素（ery）	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	培养基
FastPrep 裂解仪	MP Biomedicals	116004500	机械裂解
硫氰酸胍	Sigma-Aldrich	G9277-250G	Northern 印迹分析
Hybridization Hoven Hybrigene 杂交炉	Techne	FHB4DD	Northern 印迹分析
杂交管	Techne	FHB16	Northern 印迹分析
异戊醇	Fisher Scientific	A/6960/08	RNA 提取与纯化
LB（溶菌肉汤）	Sigma-Aldrich	L3022	培养基
Lysing Matrix B 散装	MP Biomedicals	6540-428	机械裂解
MicroPulser 电穿孔仪	BioRad	1652100	质粒构建
Milli-Q 超纯水系统	Millipore	Z00QSV0WW	超纯水
NanoDrop 分光光度计	ThermoFisher Scientific		RNA/DNA 定量与质量检测
硝酸纤维素膜	Dominique Dutsher	10600002	Northern 印迹分析
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	清洁与去污染
苯酚	Carl Roth	38.2	RNA 提取与纯化
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530	质粒构建
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP 蛋白表达
Poly-Prep 层析柱	BioRad	7311550	MS2 亲和纯化
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	质粒构建
Qubit 3 荧光计	Invitrogen	15387293	RNA 定量
RNAPro 溶液	MP Biomedicals	6055050	机械裂解
ScriptSeq Complete 试剂盒	Illumina	BB1224	cDNA 文库制备
Spectrophotometer Genesys 20 分光光度计	ThermoFisher Scientific	11972278	细菌培养
SpeedVac Savant 真空浓缩仪	ThermoFisher Scientific	DNA120	RNA 提取与纯化
Stratalinker UV 交联仪 1800	Stratagene	400672	Northern 印迹分析
T4 DNA 连接酶	ThermoFisher Scientific	EL0014	质粒构建
TBE（Tris-硼酸-EDTA）缓冲液	Euromedex	ET020-C	Northern 印迹分析
ThermalCycler T100 梯度PCR仪	BioRad	1861096	质粒构建
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Northern 印迹分析
X射线胶片处理器	hu.q	HQ-350XT	Northern 印迹分析
X射线胶片 Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Northern 印迹分析