MS2亲和纯化联合RNA测序在革兰氏阳性菌中的应用

摘要

MAPS 技术已开发用于在体内深入分析特定调控 RNA 的靶标组。感兴趣的 sRNA 被标记上 MS2 适体，从而实现其 RNA 相互作用伙伴的共纯化，并通过 RNA 测序对其进行鉴定。该改进后的实验方案特别适用于革兰氏阳性细菌。 

摘要

尽管小调控RNA（sRNA）在细菌生命域中广泛存在，但由于难以鉴定其mRNA靶标，许多sRNA的功能仍表征不足。本文介绍了一种改良的MS2亲和纯化结合RNA测序（MAPS）技术方案，旨在体内揭示特定sRNA的所有RNA互作伙伴。总体而言，将MS2适配体融合至目标sRNA的5'末端，构建该融合表达系统并在体内表达，使MS2-sRNA能够与其细胞内互作分子结合。细菌收获后，通过机械裂解细胞获得裂解液。将粗提物加载至预先包被MS2蛋白（与麦芽糖结合蛋白融合）的淀粉样亲和层析柱中，从而特异性捕获MS2-sRNA及其相互作用的RNAs。洗脱后，通过高通量RNA测序及后续生物信息学分析鉴定共纯化的RNA。该方案已在革兰氏阳性人类病原体Staphylococcus aureus中成功实施，原则上可推广至其他任何革兰氏阳性细菌。综上所述，MAPS技术是一种深入探索特定sRNA调控网络的有效方法，可提供其完整靶标组（targetome）的快照。然而需注意的是，MAPS鉴定出的潜在靶标仍需通过其他互补的实验手段加以验证。

引言

在大多数细菌基因组中已鉴定出数百个甚至数千个小调控RNA（sRNA），但其中绝大多数的功能尚未明确。总体而言，sRNA是一类短的非编码分子，在细菌生理功能及适应不断变化的环境过程中发挥着重要作用^1,2,3。事实上，这些大分子处于众多复杂调控网络的核心，影响着代谢通路、应激反应，以及毒力和抗生素耐药性。逻辑上，它们的合成由特定的环境刺激触发（例如营养缺乏、氧化应激或膜应激）。大多数sRNA通过短而间断的碱基配对，在转录后水平调控多个靶标mRNA。它们通常通过与核糖体竞争翻译起始区来抑制翻译起始⁴。sRNA与mRNA形成双链结构后，还常常通过招募特定的核糖核酸酶，导致靶标mRNA被主动降解。

对sRNA靶标组（即其全部靶标RNA的集合）进行表征，有助于识别其参与的代谢通路及其可能响应的信号分子，从而通常可依据靶标组推断特定sRNA的功能。为此，已开发出多种基于计算机的预测工具，例如IntaRNA和CopraRNA^5,6,7。这些工具主要依赖序列互补性、配对能量以及....

方案

1. 缓冲液与培养基

1. 进行 MAPS 实验时，配制以下缓冲液和培养基：
   - 缓冲液 A（150 mM KCl，20 mM Tris-HCl pH 8，1 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT）
   - 缓冲液 E（250 mM KCl，20 mM Tris-HCl pH 8，12 mM 麦芽糖，0.1% Triton，1 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT）
   - RNA 上样缓冲液（8 M 尿素中含 0.025% 桔黄 G 和 0.025% 溴酚蓝）
   - 脑心浸出液（BHI）培养基（每升含小牛脑 12.5 g、蛋白胨 10 g、牛心 5 g、NaCl 5 g、Na₂HPO₄ 2.5 g 和葡萄糖 2 g）
   - 营养肉汤（LB）培养基（每升含蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g 和 NaCl 10 g）
2. 进行 Northern 印迹分析时，配制以下缓冲液：
   - 封闭液（1× 马来酸缓冲液和 1% 封闭试剂）
   - 杂交液（50% 甲酰胺，5× SSC，7% SDS，1% 封闭液，0.2% N-月桂酰肌氨酸钠，50 mM 磷酸钠）。加热并振荡至完全溶解。
   注意：请严格遵守每种产品的安全使用注意事项。
   - 1 M 磷酸钠溶液（58 mM 磷酸氢二钠和 42 mM 磷酸二氢钠）
   ....

结果

代表性结果来源于对S. aureus²⁹中RsaC靶标组的研究。RsaC是一种非常规的长1,116 nt的小RNA，其5’端包含多个重复区域，而其3’端（544 nt）在结构上独立，并包含所有预测的与mRNA靶标相互作用的位点。当锰（Mn）缺乏时，该小RNA的表达被诱导，这种情况常出现在宿主免疫反应的背景下。利用MAPS技术，我们鉴定了多个与RsaC直接相互作用的mRNA，揭示了RsaC在氧化应激（sodA、ldh1和sarA）以及金属相关（znuBC-zur和sufCDSUB）应答中的关键作用。

MS2-sRNA 构建体及实验条件的验证
在进行 MAPS 实验之前，确定所研究 sRNA 表达的最佳条件至关重要。如果使用非天然启动子，将有助于在靶标存在时有效表达 MS2-sRNA 构建体。此外，应从大小、稳定性、表达水平和功能等方面对 MS2-sRNA 构建体进行严格验证。MS2 适配体.......

讨论

一种适用于革兰氏阳性菌的改良方案
MAPS 的初始方案旨在研究模式生物 E. coli^20,30 中的小RNA相互作用组。本文中，我们描述了一种改良后的方案，适用于机会性人类病原体 S. aureus 中依赖小RNA的调控网络的表征，且该方案无疑可推广至其他革兰氏阳性菌，无论其是否具有致病性。

特别关注了细胞裂解步骤。已使用机械细胞裂解仪替代法式高压破碎仪。该方法能有效裂解革兰氏阳性菌细胞，并降低操作致病菌株相关的风险。为了提高MS2亲和纯化的得率，已大幅增加固定在直链淀粉树脂上的MS2-MBP的量。这需要调整洗涤的严格程度和洗涤次数。

与初始方案不同，MAPS 从两个生物学重复样本中分别进行，每个样本重复操作一次。已开发出一套工作流程以实施统计分析（图2），从而显著提高.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Sarstedt	72.690.001
15 mL 离心管	Falcon	352070
2 mL 微量离心管	Starstedt	72.691
2100 生物分析仪	Agilent	G2939BA	RNA 定量与质量检测
250 mL 培养瓶	Dominique Dutscher	2515074	细菌培养
50 mL 离心管	Falcon	352051	培养物离心
无水乙醇	VWR Chemicals	20821.321	RNA 提取与纯化
Allegra X-12R 离心机	Beckman Coulter		细菌沉淀
氨苄青霉素（amp）	Sigma-Aldrich	A9518-5G	培养基
淀粉树脂	New England BioLabs	E8021S	MS2 亲和纯化
抗地高辛碱性磷酸酶 Fab 片段	Sigma Aldrich	11093274910	Northern 印迹分析
自显影胶片盒	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Northern 印迹分析
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	质粒构建
BHI（脑心浸液）肉汤	Sigma-Aldrich	53286	培养基
封闭试剂	Sigma Aldrich	11096176001	Northern 印迹分析
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Northern 印迹分析（底物）
Centrifuge 5415 R 离心机	Eppendorf		RNA 提取与纯化
氯仿	Dominique Dutscher	508320-CER	RNA 提取与纯化
DIG-RNA 标记混合物	Sigma-Aldrich	11277073910	Northern 印迹分析
DNase I	Roche	4716728001	DNase 处理
红霉素（ery）	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	培养基
FastPrep 裂解仪	MP Biomedicals	116004500	机械裂解
硫氰酸胍	Sigma-Aldrich	G9277-250G	Northern 印迹分析
Hybridization Hoven Hybrigene 杂交炉	Techne	FHB4DD	Northern 印迹分析
杂交管	Techne	FHB16	Northern 印迹分析
异戊醇	Fisher Scientific	A/6960/08	RNA 提取与纯化
LB（溶菌肉汤）	Sigma-Aldrich	L3022	培养基
Lysing Matrix B 散装	MP Biomedicals	6540-428	机械裂解
MicroPulser 电穿孔仪	BioRad	1652100	质粒构建
Milli-Q 超纯水系统	Millipore	Z00QSV0WW	超纯水
NanoDrop 分光光度计	ThermoFisher Scientific		RNA/DNA 定量与质量检测
硝酸纤维素膜	Dominique Dutsher	10600002	Northern 印迹分析
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	清洁与去污染
苯酚	Carl Roth	38.2	RNA 提取与纯化
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530	质粒构建
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP 蛋白表达
Poly-Prep 层析柱	BioRad	7311550	MS2 亲和纯化
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	质粒构建
Qubit 3 荧光计	Invitrogen	15387293	RNA 定量
RNAPro 溶液	MP Biomedicals	6055050	机械裂解
ScriptSeq Complete 试剂盒	Illumina	BB1224	cDNA 文库制备
Spectrophotometer Genesys 20 分光光度计	ThermoFisher Scientific	11972278	细菌培养
SpeedVac Savant 真空浓缩仪	ThermoFisher Scientific	DNA120	RNA 提取与纯化
Stratalinker UV 交联仪 1800	Stratagene	400672	Northern 印迹分析
T4 DNA 连接酶	ThermoFisher Scientific	EL0014	质粒构建
TBE（Tris-硼酸-EDTA）缓冲液	Euromedex	ET020-C	Northern 印迹分析
ThermalCycler T100 梯度PCR仪	BioRad	1861096	质粒构建
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Northern 印迹分析
X射线胶片处理器	hu.q	HQ-350XT	Northern 印迹分析
X射线胶片 Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Northern 印迹分析