恒河猴脂肪源性干细胞的分离、增殖与分化

摘要

本文中，我们描述了采用酶消化法分离恒河猴来源的脂肪源性干细胞（ADSCs）的实验步骤。接下来，介绍了ADSC的增殖过程，包括细胞消化、计数和接种。最后，描述了使用特异性成脂诱导剂诱导ADSC分化的方法。此外，我们还介绍了用于确认分化的染色技术。

摘要

脂肪组织是多能干细胞丰富且易于获取的来源，这些干细胞具有自我更新能力。这些脂肪来源的干细胞（ADSCs）提供了一种稳定的体外细胞体系，其功能类似于体内脂肪细胞。在生物医学研究中使用ADSCs，可对脂肪组织的代谢调控和功能进行细胞水平的研究。ADSC的分化对于脂肪细胞的充分扩增至关重要，而分化不良是脂肪组织功能障碍的主要机制之一。理解ADSC分化过程中的变化，对于认识代谢功能障碍和疾病的发生发展具有重要意义。按照本文所述方案操作，可获得成熟的脂肪细胞，用于多种体外功能检测，以评估ADSC的代谢功能，包括但不限于葡萄糖摄取、脂解、脂质生成和分泌等检测。恒河猴(Macaca mulatta)在生理、解剖和进化上与人类高度相似，因此其组织和细胞被广泛应用于生物医学研究及治疗方法的开发。本文描述了利用4至9岁恒河猴的皮下和网膜脂肪组织新鲜样本分离ADSC的方法。脂肪组织样本经胶原酶消化后，通过过滤和离心从基质血管组分中分离ADSC。分离得到的ADSC在基质细胞培养基中扩增，随后使用含0.5 μg/mL地塞米松、0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤和50 μM吲哚美辛的诱导剂，在基质细胞培养基中进行约14至21天的分化。大约在分化第14天可观察到成熟的脂肪细胞。本文详细介绍了ADSC的体外分离、扩增和分化方案。尽管我们主要聚焦于恒河猴脂肪组织来源的ADSC，但这些方案经微小调整后也可适用于其他动物的脂肪组织。

引言

脂肪组织由多种细胞组成的异质性混合物构成，主要包括成熟的脂肪细胞以及包含成纤维细胞、免疫细胞和脂肪来源的干细胞（ADSCs）的基质血管组分^1,2,3。原代ADSCs可直接从白色脂肪组织中分离，并可被诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞或成骨细胞⁴。ADSCs表现出典型的干细胞特性，例如在体外维持多向分化潜能和自我更新能力，并且在培养中具有贴壁生长的特性^5,6。由于ADSCs具有多向分化潜能，并可通过非侵入性技术大量获取，因此在再生医学领域具有重要的研究价值⁷。ADSCs的脂肪向分化可产生在功能上模拟成熟脂肪细胞的细胞，包括脂质积累、胰岛素刺激的葡萄糖摄取、脂解作用以及脂肪因子分泌⁸。由于其与成熟脂肪细胞的高度相似性，ADSCs已被广泛用于研究脂肪细胞的细胞特性及代谢功能。越来越多的证据 支持代谢功能障碍及相关疾病的发生起源于细胞或组织水平的观点^9,10,

方案

所有获取的组织和操作程序均经路易斯安那州立大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院指南（NIH 出版物 No. 85-12，1996 年修订版）进行。

1. 缓冲液和溶液的配制

1. 通过向1×PBS中添加5%青霉素/链霉素（pen/strep）和0.25 μg/mL抗真菌抑制剂，制备无菌的5-磷酸盐缓冲液洗涤液（5-PBS）。通过向1×PBS中添加2%青霉素/链霉素（pen/strep）和0.25 μg/mL抗真菌抑制剂，制备无菌的2-磷酸盐缓冲液洗涤液（2-PBS）。洗涤液可于4 °C保存以供后续使用，且必须在4周内使用完毕。
   注意：5-PBS缓冲液用于脂肪组织的采集和初始洗涤，以尽量减少可能的污染，因为尸检时获取的组织样本处于非无菌环境中。
2. 通过在含1%牛血清白蛋白的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中加入0.075% I型胶原酶（酶活性125单位/mg）、2%青霉素/链霉素（pen/strep）和0.25 μg/mL抗真菌抑制剂，制备无菌的胶原酶缓冲液（CB）。CB必须在1小时内使用完毕。
3. 使用α-MEM缓冲液制备无菌的ADSC生长培养基。在394 mL α-MEM缓冲液中加入100 mL胎牛血清（FBS）、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺溶液、500 μL 0.25 μg/mL抗真菌抑制剂和10 mL青霉素/链霉素溶液。ADSC生长培养基可在4 °C保存，且必须....

结果

从恒河猴脂肪组织样本中分离的脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）被接种于培养板上，如图1所示。接种当天，细胞尚未贴壁，在培养皿中呈悬浮状态，如图1A所示。72小时内，ADSCs贴壁并达到约80%融合，可进行脂肪细胞分化（图1B）。经化学诱导后，ADSCs表现出显著的成脂特性。分化14天后，可通过光学显微镜观察到成熟的脂肪细胞（图2A）。为确认ADSCs的成脂分化能力，可使用多种染色方法对分化成熟的脂肪细胞中的脂滴进行可视化观察。在分化第14天，细胞经油红O染色固定以显示脂滴（图2B），以及用BODIPY染色（图2C）。黑色箭头指示一个已分化的脂肪细胞（图2B）。这些结果表明，按照本方案，可从恒河猴脂肪组织中成功获得ADSCs，.......

讨论

ADSC 的分离、增殖和分化方案简单且可重复，但需要精细的操作技术以确保充分的分离、健康的扩增以及高效的分化。无菌的工作环境对于所有细胞培养实验都至关重要。细菌或真菌可能通过受污染的工具、培养基或工作环境进入细胞培养体系。真菌污染通常表现为培养物中出现孢子生长，而细菌污染则表现为培养基变得浑浊。我们建议在使用前对生物安全柜以及所有移液器、瓶具和工具进行消毒，在使用生物安全柜前至少提前15分钟开启层流空气系统，并在使用后对安全柜和所有移液器进行再次消毒，以降低污染风险。此外，建议将不可过滤的移液器吸头进行高压灭菌用于真空抽吸，并在使用后用无菌水冲洗抽吸装置，再用70%乙醇冲洗。可将仅含培养基的培养皿置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中数天，以检测培养基的无菌性。受污染的培养物应使用漂白剂处理30分钟后再丢弃。细胞培养箱也应定期进行消毒。

本手稿中的实验方案与先前发表的方案之间的一个主要区别在于，我们在ADSC胶原酶消化缓冲液中使用了BSA，这使得能够分离出成熟的脂肪细胞和ADSCs。此外，我们的实验方案采用添加20%胎牛血清（FBS）的ADSC生长培养基，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4 % 台盼蓝	Thermo-Fisher	15250061
1.5-ml 微量离心管	Dot Scientific	707-FTG
100 % 异丙醇	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm 细胞培养皿	Corning	430167
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	I7018
50-mL 塑料锥形管	Fisher Scientific	50-465-232
70-µm 细胞筛	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
铝箔	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
离心机	Eppendorf	5810 R
胶原酶 I 型	Thermo-Fisher	17100017
地塞米松水溶性	Sigma-Aldrich	D2915
二甲基亚砜，DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
蒸馏水	Thermo-Fisher	15230162
胎牛血清，USDA 批准	Sigma-Aldrich	F0926
制霉菌素/两性霉素 B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks 平衡盐溶液 (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
带盖玻片的血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629
吲哚美辛	Sigma-Aldrich	I7378
倒置光学显微镜	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-谷氨酰胺 (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
实验室摇床，0.5 至 1.0 Hz	Reliable Scientific	Model 55 Rocking
中性缓冲福尔马林 (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
油红 O	Sigma-Aldrich	O0625
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4	Thermo-Fisher	10010023
红细胞 (RBC) 裂解液	Qiagen	158904
移液管，2 至 25 mL	Costar Stripettes
标准恒温恒湿细胞培养箱，37 °C，5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)	Thermo-Fisher	25200056