本文中，我们描述了采用酶消化法分离恒河猴来源的脂肪源性干细胞（ADSCs）的实验步骤。接下来，介绍了ADSC的增殖过程，包括细胞消化、计数和接种。最后，描述了使用特异性成脂诱导剂诱导ADSC分化的方法。此外，我们还介绍了用于确认分化的染色技术。
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摘要
摘要
脂肪组织是多能干细胞丰富且易于获取的来源，这些干细胞具有自我更新能力。这些脂肪来源的干细胞（ADSCs）提供了一种稳定的体外细胞体系，其功能类似于体内脂肪细胞。在生物医学研究中使用ADSCs，可对脂肪组织的代谢调控和功能进行细胞水平的研究。ADSC的分化对于脂肪细胞的充分扩增至关重要，而分化不良是脂肪组织功能障碍的主要机制之一。理解ADSC分化过程中的变化，对于认识代谢功能障碍和疾病的发生发展具有重要意义。按照本文所述方案操作，可获得成熟的脂肪细胞，用于多种体外功能检测，以评估ADSC的代谢功能，包括但不限于葡萄糖摄取、脂解、脂质生成和分泌等检测。恒河猴(Macaca mulatta)在生理、解剖和进化上与人类高度相似，因此其组织和细胞被广泛应用于生物医学研究及治疗方法的开发。本文描述了利用4至9岁恒河猴的皮下和网膜脂肪组织新鲜样本分离ADSC的方法。脂肪组织样本经胶原酶消化后，通过过滤和离心从基质血管组分中分离ADSC。分离得到的ADSC在基质细胞培养基中扩增，随后使用含0.5 μg/mL地塞米松、0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤和50 μM吲哚美辛的诱导剂，在基质细胞培养基中进行约14至21天的分化。大约在分化第14天可观察到成熟的脂肪细胞。本文详细介绍了ADSC的体外分离、扩增和分化方案。尽管我们主要聚焦于恒河猴脂肪组织来源的ADSC，但这些方案经微小调整后也可适用于其他动物的脂肪组织。
引言
脂肪组织由多种细胞组成的异质性混合物构成，主要包括成熟的脂肪细胞以及包含成纤维细胞、免疫细胞和脂肪来源的干细胞（ADSCs）的基质血管组分1,2,3。原代ADSCs可直接从白色脂肪组织中分离，并可被诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞或成骨细胞4。ADSCs表现出典型的干细胞特性，例如在体外维持多向分化潜能和自我更新能力，并且在培养中具有贴壁生长的特性5,6。由于ADSCs具有多向分化潜能，并可通过非侵入性技术大量获取，因此在再生医学领域具有重要的研究价值7。ADSCs的脂肪向分化可产生在功能上模拟成熟脂肪细胞的细胞，包括脂质积累、胰岛素刺激的葡萄糖摄取、脂解作用以及脂肪因子分泌8。由于其与成熟脂肪细胞的高度相似性，ADSCs已被广泛用于研究脂肪细胞的细胞特性及代谢功能。越来越多的证据 支持代谢功能障碍及相关疾病的发生起源于细胞或组织水平的观点9,10,11,12。ADSCs的充分分化对于脂肪组织的有效扩张、脂肪细胞的正常功能以及代谢调控的实现至关重要13。
本论文中描述的实验方案是利用标准实验室设备和基础试剂的简便技术。首先，本文描述了从新鲜脂肪组织中通过机械法和酶消化法分离原代脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）的方案。接着，介绍了在基质细胞培养基中对ADSCs进行增殖和传代的方案。最后，阐述了ADSCs向脂肪细胞定向分化的实验方案。完成分化后，这些细胞可用于深入研究脂肪细胞的代谢过程及功能障碍机制。本文还描述了通过油红O染色和硼-二吡咯甲烷（BODIPY）染色来确认脂肪向分化及检测脂滴的实验方法。这些实验方案的细节主要针对从恒河猴网膜脂肪组织中分离的原代ADSCs。我们及其他研究者已成功应用该方案从恒河猴皮下和网膜脂肪组织库中分离出ADSCs14,15。在使用相同量组织的情况下，我们观察到皮下脂肪组织密度更高、质地更坚韧，消化后获得的细胞数量少于网膜脂肪组织。该方案也已被用于从人类脂肪样本中分离ADSCs16。
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方案
所有获取的组织和操作程序均经路易斯安那州立大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院指南（NIH 出版物 No. 85-12，1996 年修订版）进行。
1. 缓冲液和溶液的配制
- 通过向1×PBS中添加5%青霉素/链霉素（pen/strep）和0.25 μg/mL抗真菌抑制剂，制备无菌的5-磷酸盐缓冲液洗涤液（5-PBS）。通过向1×PBS中添加2%青霉素/链霉素（pen/strep）和0.25 μg/mL抗真菌抑制剂，制备无菌的2-磷酸盐缓冲液洗涤液（2-PBS）。洗涤液可于4 °C保存以供后续使用，且必须在4周内使用完毕。
注意：5-PBS缓冲液用于脂肪组织的采集和初始洗涤，以尽量减少可能的污染，因为尸检时获取的组织样本处于非无菌环境中。 - 通过在含1%牛血清白蛋白的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中加入0.075% I型胶原酶（酶活性125单位/mg）、2%青霉素/链霉素（pen/strep）和0.25 μg/mL抗真菌抑制剂，制备无菌的胶原酶缓冲液（CB）。CB必须在1小时内使用完毕。
- 使用α-MEM缓冲液制备无菌的ADSC生长培养基。在394 mL α-MEM缓冲液中加入100 mL胎牛血清（FBS）、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺溶液、500 μL 0.25 μg/mL抗真菌抑制剂和10 mL青霉素/链霉素溶液。ADSC生长培养基可在4 °C保存，且必须在4周内使用完毕。
注意：胎牛血清（FBS）无需进行热灭活处理。 - 通过将上述制备的ADSC生长培养基与诱导剂混合，制备无菌的ADSC分化培养基，以达到终浓度为0.5 μg/mL地塞米松、0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤和50 μM吲哚美辛。
2. ADSC 的分离
- 组织制备与消化
- 用移液器将约 10 mL 的 5-PBS 缓冲液加入四个 100 mm 细胞培养皿中。
- 将约 50 g 脂肪组织样本转移至其中一个含有 5-PBS 的 100 mm 培养皿中。通过将组织依次转移至四个含 5-PBS 的培养皿中，共清洗四次。
- 将脂肪组织样本转移至一个洁净的 100 mm 培养皿中，使用剪刀或两把无菌手术刀彻底剪碎组织。剪碎可增加组织表面积，有利于实现高效且完全的酶消化。
- 将剪碎的脂肪组织转移至含有 13 mL CB 的 50 mL 塑料离心管中（每 15 mL CB 对应 1–3 cm 段的组织）。
- 用 2 mL CB 冲洗培养皿，并将冲洗液转移至 50 mL 塑料离心管中。
注意：此时，50 mL 塑料离心管中应共有 15 mL CB 与组织。 - 使用 25 mL 血清移液管反复吹打数次，以促进机械性组织消化。
- 将含有组织与 CB 的 50 mL 塑料离心管置于摇床上，37 °C、中等速度振荡孵育 30–60 分钟。
- ADSC 培养接种
- 向含有组织的 50 mL 离心管中加入 10 mL ADSC 生长培养基，以中和酶活性。使用 25 mL 血清移液管反复吹打数次，以分散任何脂肪组织团块。
- 将液体部分转移至新的无菌 50 mL 离心管中，保留固体部分。用约 7 mL 的 2-PBS 缓冲液清洗原始 50 mL 管三次，并将每次的液体部分转移至新的 50 mL 管中。
- 以 500 x g 离心 5 分钟，获得细胞沉淀。使用血清移液管小心吸除尽可能多的上清液，避免扰动细胞沉淀。切勿倾倒。
- 用 1 mL 1x 红细胞（RBC）裂解缓冲液重悬细胞沉淀，室温孵育 10 分钟。向管中加入 5 mL ADSC 生长培养基，以 500 x g 离心 5 分钟，然后小心吸除并弃去上清液。
- 加入 5 mL ADSC 生长培养基重悬细胞沉淀，以 500 x g 离心 5 分钟进行洗涤。弃去上清液。
- 用 2 mL ADSC 生长培养基重悬细胞沉淀，并通过 70 μm 细胞筛过滤至一个新的无菌 50 mL 塑料离心管中。
- 用额外的 2 mL ADSC 生长培养基冲洗细胞筛。从 50 mL 离心管中取出 4 mL 含 ADSC 的悬液，转移至一个无菌 100 mm 培养皿中。
- 用 3 mL ADSC 生长培养基清洗 50 mL 离心管两次，并将洗涤液转移至含有 ADSC 的 100 mm 培养皿中，使培养皿中培养基总体积达到 10 mL。
- 在倒置显微镜下以 10 倍物镜观察细胞，检查培养基中是否存在漂浮细胞，如 图 1A 所示。细胞应置于 37 °C、5% CO2 及 100% 相对湿度的 CO2 培养箱中培养。
- 24 小时后，在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况。吸除培养板中的 ADSC 生长培养基，更换为 10 mL 新鲜预热（37 °C）的培养基。每 48 小时更换一次培养基，直至细胞融合度达到 80%–90%（图 1B）。
注意：24 小时内至少有 10–20% 的细胞会贴壁。需检查细胞培养物是否存在污染迹象，如细胞颗粒化、培养基浑浊或孢子生长。当细胞融合度达到 80% 时，可进行增殖、冻存或诱导分化。ADSC 可扩增至 4–6 代，之后其有效增殖与分化能力将下降。
3. ADSC 增殖
- 细胞脱离
- 使用移液器或抽吸装置移除ADSC生长培养基。用2 mL无菌、室温的PBS冲洗汇合的ADSC细胞两次。
- 抽吸PBS，每100 mm培养皿加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。确保胰蛋白酶完全覆盖整个培养皿表面。
- 将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下孵育约7分钟，直至ADSC细胞脱落。从孵箱中取出培养皿，通过强力吹打胰蛋白酶溶液使细胞完全脱离。
- 向脱落的细胞中加入2 mL ADSC生长培养基，轻柔吹打混匀。将细胞转移至无菌的50 mL塑料离心管中。为确保最大程度回收细胞，用另外2 mL ADSC生长培养基冲洗培养皿，并将冲洗液转移至含有脱落细胞的离心管中。
- 将50 mL离心管在室温下以500 x g离心5分钟，获得细胞沉淀。小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
- 每1 × 106个细胞用5–6 mL ADSC生长培养基重悬细胞沉淀。
- 细胞计数与接种
- 在1.5 mL微量离心管中，取上述细胞悬液10 μL与10 μL 0.04%台盼蓝溶液（将0.4%台盼蓝用PBS稀释10倍）混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 将所需数量的ADSC细胞重悬于生长培养基中。对于100 mm培养皿，接种约3.0 × 105个细胞于10 mL ADSC生长培养基中，以实现在72小时内达到80%汇合度，或在96小时内达到100%汇合度。
- 接种前在倒置显微镜下以10倍物镜观察培养皿，确认细胞呈悬浮状态。将细胞维持在37 °C、5% CO2及100%相对湿度的环境中培养。
- 每48小时吸除旧培养基，并更换为预热至37 °C的新鲜培养基，直至细胞汇合度达到80%至90%，如图1B所示。
- 根据需要重复第3.1和3.2节中的步骤，进行适当次数的传代以获得目标细胞数量。
注意：原代细胞在第5至第6代后开始出现衰老迹象；因此，建议在第4代前完成目标细胞数量的扩增。
4. ADSC 成脂分化
- 吸除已贴壁且融合度达到80%至90%的ADSCs中的生长培养基。
- 用无菌的室温PBS快速冲洗ADSC细胞层。
- 加入ADSC成脂分化培养基。对于100 mm培养皿，加入10 mL ADSC成脂分化培养基。
- 每3天更换一次培养基，持续约14–21天。通常在分化14天后可观察到成熟的脂肪细胞。
- 在倒置光学显微镜下以40倍放大倍数观察细胞，确认脂滴的存在，如图2A所示。
5. 脂肪细胞检测
注意：本节将介绍用于检测分化脂肪细胞中脂滴的染色方案，但也可使用针对间充质干细胞标志物CD105的免疫荧光染色来确认ADSC。
- 油红O染色
- 配制0.5% Oil Red O异丙醇储备液。取100 mg Oil Red O溶于20 mL异丙醇中，配制成20 mL Oil Red O储备液。使用带有0.2 μm滤膜的无菌注射器滤器过滤该溶液。
- 小心吸除分化培养基，沿孔壁加入 PBS 洗涤细胞 2 次，避免扰动细胞单层。
- 小心吸除细胞中的 PBS，加入足量中性缓冲福尔马林（NBF, 10%）覆盖细胞层。室温孵育 30–60 分钟。
- 在甲醛固定步骤期间，通过将3份油红O储备液与2份蒸馏水混合来配制油红O工作液。混匀溶液后，使用带有0.2 μm滤膜的无菌注射器滤器过滤。工作液在2小时内保持稳定。
- 小心吸除NBF，用蒸馏水快速洗涤细胞层（约15秒）。吸去水后，加入足量60%异丙醇覆盖细胞层，室温孵育5分钟。
- 孵育5分钟后，小心吸除异丙醇，加入足量油红O工作液以覆盖细胞层，室温孵育10–15分钟。
- 小心吸除油红O工作液，用蒸馏水洗涤细胞层数次，直至洗液变澄清。
- 向细胞培养皿中加入 PBS，然后在倒置显微镜下观察细胞，以判断是否存在分化及脂滴的出现。图2B).
- BODIPY 染色
- 将1.3 g BODIPY溶于1 mL DMSO中，配制5 mM BODIPY储备液。用PBS将储备液稀释25,000倍，配制2 μg/mL BODIPY工作液。
- 小心吸除分化培养基，沿孔壁加入 PBS 洗涤细胞 2 次，避免扰动细胞单层。
- 小心吸除 PBS，加入足量 BODIPY 工作液以覆盖细胞层，于 37 °C 孵育 30 分钟。
注意：从此步骤开始，用锡箔纸包裹培养板以避光。 - 小心吸除BODIPY工作液，用PBS洗涤细胞层3次。
- 加入4%多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育15分钟。
- 小心吸除固定缓冲液，沿孔壁加入 PBS 洗涤细胞 2 次，避免扰动细胞单层。
- 向细胞培养皿中加入 PBS，并在倒置荧光显微镜下观察细胞，以检测分化迹象及脂滴的存在图2C使用 FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma 滤光片组对细胞进行成像。激发波长为 480 nm，带宽为 40 nm，发射波长为 535 nm，带宽为 50 nm。也可使用类似或合适的滤光片组及显微镜。.
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结果
从恒河猴脂肪组织样本中分离得到的脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）被接种于培养板上，如图1所示。接种当天，细胞尚未贴壁，悬浮于培养皿中，如图1A所示。72小时内，ADSCs贴壁并达到约80%融合，可进行脂肪细胞分化诱导（图1B）。经化学诱导后，ADSCs表现出显著的成脂特性。分化14天后，可通过光学显微镜观察到成熟的脂肪细胞（图2A）。为确认ADSCs的成脂分化能力，可使用多种染色方法对分化成熟的脂肪细胞中的脂滴进行可视化观察。在分化第14天，细胞经油红O染色固定以显示脂滴（图2B），以及用BODIPY染色（图2C）。黑色箭头指示一个已分化的脂肪细胞（图2B）。这些结果表明，按照本实验方案，可从恒河猴脂肪组织中成功获得ADS...
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讨论
ADSC 的分离、增殖和分化方案简单且可重复，但需要精细的操作技术以确保充分的分离、健康的扩增以及高效的分化。无菌的工作环境对于所有细胞培养实验都至关重要。细菌或真菌可能通过受污染的工具、培养基或工作环境进入细胞培养体系。真菌污染通常表现为培养物中出现孢子生长，而细菌污染则表现为培养基变得浑浊。我们建议在使用前对生物安全柜以及所有移液器、瓶具和工具进行消毒，在使用生物安全柜前至少提前15分钟开启层流空气系统，并在使用后对安全柜和所有移液器进行再次消毒，以降低污染风险。此外，建议将不可过滤的移液器吸头进行高压灭菌用于真空抽吸，并在使用后用无菌水冲洗抽吸装置，再用70%乙醇冲洗。可将仅含培养基的培养皿置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中数天，以检测培养基的无菌性。受污染的培养物应使用漂白剂处理30分钟后再丢弃。细胞培养箱也应定期进行消毒。
本手稿中的实验方案与先前发表的方案之间的一个主要区别在于，我们在ADSC胶原酶消化缓冲液中使用了BSA，这使得能够分离出成熟的脂肪细胞和ADSCs。此外，我们的实验方案采用添加20%胎牛血清（FBS）的ADSC生长培养基，...
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致谢
作者感谢Curtis Vande Stouwe提供的技术支持。本方案开发所依据的研究由美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所的资助项目支持（资助编号：5P60AA009803-25、5T32AA007577-20 和 1F31AA028459-01）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4 % 台盼蓝 | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml 微量离心管 | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % 异丙醇 | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm 细胞培养皿 | Corning | 430167 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL 塑料锥形管 | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm 细胞筛 | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| 铝箔 | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810 R | |
| 胶原酶 I 型 | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| 地塞米松水溶性 | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 二甲基亚砜，DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 蒸馏水 | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| 胎牛血清，USDA 批准 | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| 制霉菌素/两性霉素 B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks 平衡盐溶液 (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| 带盖玻片的血细胞计数板 | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| 倒置光学显微镜 | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| 实验室摇床，0.5 至 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| 中性缓冲福尔马林 (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| 油红 O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 青霉素-链霉素 (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| 红细胞 (RBC) 裂解液 | Qiagen | 158904 | |
| 移液管，2 至 25 mL | Costar Stripettes | ||
| 标准恒温恒湿细胞培养箱，37 °C，5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
参考文献
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