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机械分离与溶解鸡卵外层和内层卵周质亚层中的蛋白质

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DOI：

10.3791/61739

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2021年1月27日

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1Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement, Université de Tours, Biologie des Oiseaux et Aviculture, 37380, Nouzilly, France

本文内容

摘要

本文报道了一种简单的方法，可在尽量减少结构改变的前提下分离鸡蛋的外层和内层卵周质亚层，并优化各亚层蛋白质的溶解性，以用于蛋白质组学分析。

摘要

包裹卵黄的卵周膜在受精过程、卵的防御以及禽类胚胎发育中起着基础性作用。该膜由两种不同的蛋白质亚层紧密连接构成，分别由雌性生殖器官的不同部位合成。目前认为这两个结构各自具有特定的功能，但其具体功能仍有待阐明。为了表征构成各亚层的蛋白质功能，首要挑战是建立适当的条件，以实现这两种紧密连接的亚层在机械上的有效分离，同时最大限度地减少结构损伤。第二步是优化实验条件，以便从这两个亚层中有效溶解蛋白质，用于后续的生化分析。该方法的效率通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析各亚层的蛋白质谱型进行评估，预期两种结构的蛋白质谱型应存在明显差异。这一两步法操作简便，仅需常规的生化仪器和试剂，且适用于进一步深入的蛋白质组学研究。此外，该方法还可推广至其他禽类卵进行比较生物学研究，因为已知卵周膜的结构和组成具有物种特异性。同时，亚层分离过程中所采用的非变性条件（第一步）使得可通过扫描电镜和透射电镜对两亚层进行结构分析。该方法也可作为后续蛋白质纯化的初始步骤，用于分析其各自的生物学活性和三维结构，或进行进一步的免疫组织化学和功能分析。此类研究将有助于阐明这两个亚层的生理功能，而其结构与功能的完整性正是决定繁殖成功的关键因素。

引言

本方法旨在提供一种实验方案，用于对卵黄周围层（PL）进行后续的生化表征。卵黄周围层是一种包裹卵黄的薄层蛋白质结构，在鸟类繁殖过程中发挥着至关重要的作用。PL在文献中也被称为“卵黄膜”，是由多种糖蛋白构成的三维纤维网络结构。该结构包括与卵黄直接接触的内层卵黄周围层（IPL），其在卵巢中组装形成；以及位于IPL之上的外层卵黄周围层（OPL，与蛋清接触），由漏斗部产生（图1）。漏斗部是输卵管的漏斗状上段，排卵后接收成熟的含卵黄卵泡，并是受精发生的部位。OPL的分泌发生于上述两个事件之后，随后在输卵管的其他特定区段依次沉积蛋清和蛋壳。PL的生理功能不仅与受精及胚胎发育早期阶段相关，还涉及对胚胎的物理和分子层面的保护。针对鸡卵全层PL进行的蛋白质组学分析已鉴定出137种不同的蛋白质1，但其中大多数蛋白质在IPL与OPL之间的分布情况仍有待阐明。文献中有限的数据表明，IPL与OPL具有截然不同的蛋白质谱型2,3,4，提示二者可能具有不同的结构与功能特性。目前关于OPL与IPL间蛋白质分布的研究数据之所以稀少，很可能是因为这两层结构均较薄且紧密嵌合，难以有效分离。

本文所述方法旨在以对两层组织各自的组织学结构影响最小的方式分离这两种子层，同时保留其蛋白质含量，并提供一套完整的蛋白质溶解方案，以便后续进行蛋白质组学分析。该方法包括两个主要步骤：1）外周层（PL）取样及外颗粒层（OPL）与内颗粒层（IPL）的分离；2）对PL、OPL和IPL进行处理以实现蛋白质的完全溶解，并进行电泳以用于质谱分析。整个工作流程见图2。值得注意的是，尽管本方案已针对蛋白质组学分析进行了优化（步骤2.2），但可在某些步骤中止，以便进行组织学分析（如电子显微镜观察）、免疫组织化学分析、功能研究（步骤1），或用于分离可溶性盐蛋白，以进一步表征其结构与生物学活性（步骤2.1）（图2）。

第一步是去除蛋黄中的总磷脂（PL）图2，步骤1.1）。所有已发表的方法均首先通过手工或使用蛋清分离器将蛋清与蛋黄分离，随后用镊子或通过滤纸吸附去除残留的蛋清及粗大的系带。5 (图2A）。接下来，用于采集PL的技术因已发表的文章而异。一些论文中包括用去离子水或蒸馏水对卵黄进行多次洗涤1,5,6，置于0.85至1%的生理盐水溶液中2,7,8，置于缓冲溶液中，例如 0.15 M NaCl/N-[Tris(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸，pH 7.44或在 0.01N HCl（pH 2）中3这些操作步骤适用于鸡、鸭、环颈雉、灰山鹑、鸡尾鹦鹉、家鸽或平胸类鸟类的蛋。2,6,9在未使用水溶液的情况下，将蛋黄保留在培养皿中并去除浆膜层（PL）可能非常费力，因为浆膜层较为脆弱，且蛋黄容易黏附于浆膜层上。1,5 因此难以后续清除。在37 °C下使用酸性缓冲液或溶液处理一小时3 也不推荐，因为此类条件可能会改变 PL 的结构，并可能导致蛋白质丢失。同时，必须去除含有胚盘的区域，因为该区域可能具有独特的结构和分子特征，不能代表整个 PL 的情况。4,6,10 (图2B）。该方法借鉴了部分已发表文章中强调的思路，并提出了一些改进措施，以在保持PL完整性的同时促进其采样。图 2C).

第二步是分离两层亚层（图2，步骤1.2）。此步骤至关重要，因为外颗粒层（OPL）与内颗粒层（IPL）彼此紧密结合。该操作应在双目解剖显微镜下使用镊子小心进行。目前报道OPL/IPL分离的文献较为有限2,3,7,11，其中部分研究采用了特定条件（如在37 °C酸性缓冲液中孵育1小时2,3），这些条件可能会影响亚层的组织学结构和/或导致蛋白质丢失，或引入蛋黄或蛋清污染。为了更清晰地区分OPL与IPL，有研究者报道使用甲苯胺蓝对OPL进行轻微染色（内层保持无色）11。在本研究建立的方法中，我们优化了实验条件，使分离过程易于实现，且无需使用任何染料（图2D）。

第二步主要是溶解构成各亚层的蛋白质。传统方法是将纯净的冻干1、干燥2,6或新鲜制备3,4,11的PL/亚层直接与用于电泳的Laemmli缓冲液混合。其他研究者则倾向于先将各层在1% NaCl、1% SDS缓冲溶液2,3,11或含有蛋白酶抑制剂和SDS6的溶液中于室温下进行初步溶解，或使用Triton处理后于45 °C孵育12，并持续剧烈搅拌。也有研究者描述了一种方案，即将PL在磷酸盐缓冲液（PBS）或尿素中孵育并进行超声处理13。上述处理均需随后进行离心，并将上清液稀释至Laemmli缓冲液中。这些方法的共同缺点是蛋白质无法从各层中完全溶解，因为不溶性物质（离心后获得的沉淀）会被弃去，不再用于后续分析。

此外，某些作者采用变性条件（如尿素、去污剂、高温等）进行蛋白质溶解，这与后续用于表征的蛋白质纯化步骤不兼容，因为这些条件可能导致蛋白质发生不可逆失活，干扰其生物学活性，并破坏其三维结构。针对本方案的第2步，本实验流程包含两个子步骤：第一个子步骤可在非变性条件下，在PL/OPL/IPL机械解构后溶解最丰富的蛋白质，从而不影响后续可能需要的蛋白质研究（图2，步骤2.1）；第二个子步骤则可实现蛋白质的完全溶解，适用于电泳和深入的蛋白质组学分析（图2，步骤2.2）。该流程综合了多篇已发表文献中的建议，并结合了通过实验验证的新思路所进行的优化调整。

方案

1. PL、IPL 和 OPL 取样

  1. PL 取样
    1. 手动打破新鲜产出的未受精卵，将蛋分离器置于玻璃烧杯上，分离蛋黄与蛋清。用小剪刀去除系带，并将蛋黄在滤纸上滚动，以去除附着的蛋清，后者呈现为透明且可见的结构（图 2A）。
      注意事项：操作剪刀时需小心，避免刺破 PL。使用镊子代替剪刀去除系带可能引起 PL 破裂，导致蛋黄泄漏。在滤纸上滚动的步骤至关重要，应迅速完成，因为滤纸具有吸水性，可能导致 PL 破裂。此外，必须使用当天产出的未受精卵，以优化本步骤及后续所有步骤的成功率。作为替代方案，可在低温环境下储存不超过 10 天的鸡蛋，但实验人员需考虑 PL 发生改变的潜在风险。
    2. 将蛋黄浸入已预冷至 4 °C 的含 10 mM Tris-HCl（pH 8）的结晶皿中，使用钝头剪刀去除胚盘区域周围直径约 1 cm 范围内的 PL（图 2B）。
      备注：最初 PL 被浸入去离子水中，但该方法存在一些缺点，例如无法控制 pH 值，且后续难以分离亚层（步骤 1.2）。因此，测试了多种条件，包括 Tris 浓度（图 3A）和 pH 值（图 3B）。使用 pH 8 的缓冲液而非去离子水或去矿物质水，符合鸡蛋生理特性（产蛋当天蛋清的 pH 值约为 7.8）14，并可最小化蛋白质损失。相比之下，酸性或强碱性 pH 值可能引发 PL 结构破坏及早期蛋白质溶解（图 3B）。实验发现，10 mM Tris-HCl（pH 8）缓冲液最为理想，因其符合鸡蛋生理环境，且不会引起显著的蛋白质溶解（工作缓冲液中的蛋白质浓度保持最低水平，图 3A、B）。
    3. 在缓冲液中用小剪刀刺破 PL，用镊子夹住破裂 PL 的两侧边缘，将 PL 从蛋黄上剥离。
    4. 用镊子固定 PL，并在多份 10 mM Tris-HCl（pH 8）缓冲液中反复冲洗，直至肉眼不可见任何蛋黄残留。此时应确保 PL 清洁、呈白色，并漂浮于缓冲液中。可进入步骤 1.2 进行亚层分离，或直接进入步骤 2.1 进行生化分析。
  2. OPL 与 IPL 取样
    1. 将完整的 PL 样品平铺于塑料培养皿中，使 OPL 朝上，尽量展平并减少皱褶。加入 10 mM Tris-HCl（pH 8）、50 mM NaCl 覆盖样品。使用塑料培养皿（而非玻璃）以限制 PL 移动，因为 PL 更易黏附于塑料表面。
      1. 为确定 OPL 一侧，观察残留系带的位置，其附着于 OPL 而非 IPL。此步骤需较低 NaCl 浓度（50 mM），以促进亚层分离。
        备注：根据 图 3C 所示图表及文献11，该浓度不会导致显著的蛋白质损失。最初曾使用去离子水分离亚层，如先前研究所述1,5,6，但该技术被发现极为费力，且会导致 PL 结构完整性受损。因此，测试了不同 NaCl 浓度（图 3C），因盐分有助于两亚层的分离。然而需注意，当 NaCl 浓度 >100 mM 时，会增加 PL 中蛋白质的溶解/释放，而本步骤并不希望发生此现象（此将在步骤 2 中作为目标）（图 3C）。在 10 mM Tris-HCl（pH 8）缓冲液中添加 50 mM NaCl，可促进两亚层分离，同时最小化蛋白质损失。
    2. 用小剪刀将整个 PL 切成约 2 cm × 3 cm 的小片。在双目解剖显微镜下，使用超精细尖头镊子机械分离每片 PL 的两层（图 4）。将分离得到的 IPL 和 OPL 样品分别储存于微量离心管中，于 -80 °C 保存，以备后续使用。
      备注：本方案可在此处暂停。需注意，两层分离的效率与难易程度极大依赖于鸡蛋的新鲜程度。事实上，储存后的鸡蛋因蛋清 pH 值迅速升高，导致 PL 松动（并弱化），进而引起蛋黄指数显著变化。IPL 比 OPL 更脆弱，因此建议将 OPL 面朝上，并用镊子夹住 OPL 向外拉以分离两亚层。两亚层均需极其小心地操作。

2. 蛋白质溶解及SDS-PAGE分析的样品处理

  1. 初级蛋白质溶解
    1. 分别对 IPL 和 OPL 样品进行冷冻干燥。冷冻干燥完成后，在洁净的带有防漏螺旋盖的微量离心管中，从每份样品中切取约 1 mg。将剩余样品保存在密封严实的管中，于 -80 °C 长期储存。
      注意：使用带有防漏螺旋盖的微量离心管可确保密封且不泄漏，防止样品重新吸水，从而保障样品安全。
    2. 将每份冻干的亚层样品 1 mg 与 400 µL 的 50 mM Tris（pH 7）、500 mM NaCl 混合。使用混匀研磨仪在 30 Hz 条件下处理两次，每次 5 分钟，以将 OPL 和 IPL 结构粉碎成微粒并促进蛋白质溶解。分别收集含有 OPL 和 IPL 的样品各 400 µL 至两个洁净的微量离心管中。
      注意：此处所用缓冲液旨在增强蛋白质溶解性（与步骤 1 不同）。该缓冲液的选择依据来自图3的结果，显示在 pH 7 时蛋白质溶解性增加（图3B），且使用 0.5 M NaCl 时效果更佳（图3C）。本步骤可暂停。此时样品可用于主要 PL 蛋白的纯化，或继续进行步骤 2.2。
  2. 用于电泳的蛋白质溶解
    1. 向每份 400 µL 样品中加入 5x SDS-PAGE 上样缓冲液（100 µL，含 0.25 M Tris-HCl、0.05% 溴酚蓝、50% 甘油、5% SDS、5% 巯基乙醇，pH 6.8），并在 100 °C 加热 5 分钟。
      注意：本步骤可暂停，样品可储存于 -80 °C。在此阶段，OPL 和 IPL 已完全溶解。可通过将样品在 10,000 x g 条件下离心 5 分钟评估溶解效率。完全溶解的特征是离心后无可见沉淀。因此，在完全溶解的前提下，此处认为 1 mg 冻干亚层相当于 1 mg 蛋白质（500 µL 样品中的蛋白浓度为 2 mg/mL）。事实上，PL 中蛋白质含量超过 80%2,15。使用 5x 上样缓冲液可减少样品稀释，但也可使用 1x 或 2x 缓冲液。
    2. 在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶（4%–20% 梯度胶）上每道最多上样 20 µg 蛋白质，并使用垂直电泳系统在 120 V 条件下进行电泳。
      注意：使用 4%–20% 梯度胶并非强制要求，但此处更推荐，因为 OPL 和 IPL 所含蛋白质的分子量范围从 <10 kDa 到 >250 kDa。保留通常会被移除的浓缩胶可能也有助于判断，若在加样孔底部出现不溶性蛋白质或蛋白聚集体，则提示溶解效果不佳，样品制备过程中可能存在遗漏步骤。
    3. 电泳结束后，将凝胶从玻璃板中取出，并用考马斯亮蓝染色液（50% H2O、40% 乙醇、10% 乙酸和 R250 考马斯亮蓝）染色 30 分钟。
    4. 用含 50% H2O、40% 乙醇、10% 乙酸的脱色液脱色，直至凝胶背景呈浅蓝色。
    5. 最后将凝胶转移至含有去离子水的培养皿中，以完成脱色和聚丙烯酰胺凝胶的再水合。蛋白质应表现为透明背景上的蓝色条带。

结果

将新鲜产出的未受精卵的蛋白层（PL）分离为外蛋白层（OPL）和内蛋白层（IPL），以通过SDS-PAGE分析其蛋白质谱。整个实验方案的工作流程如图2所示。图3展示了不同Tris浓度（图3A）、不同pH值（图3B）以及不同NaCl浓度（图3C）下的蛋白质释放情况。在双目解剖显微镜下观察所得的两个亚层，结果如图4所示，其中IPL呈半透明状，而OPL则致密、浑浊且呈白色。这些特征可在一定程度上验证亚层分离的有效性。

分离后，OPL 和 IPL 分别进行冻干处理，并通过机械研磨、阴离子去污剂（SDS）以及还原剂（beta-mercaptoethanol）的联合使用，使其中的蛋白质完全溶解，随后进行煮沸处理。在聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE 电泳）中迁移后，OPL 和 IPL 样品表现出明显的电泳图谱差异（图5），符合预期结果。

显微镜示意图，视网膜OPL和IPL层，结构分析，5μm比例尺。
图1：新鲜未受精卵的卵周层（PL）结构。 卵周层（PL）横切面的示意图及透射电子显微镜照片（个人数据，©法国图尔大学及大学医疗中心电子显微镜IBiSA平台，S. Georgeault）。请注意，本图所示样品系按照本实验方案处理所得。OPL，外卵周层；IPL，内卵周层。黑色箭头指示分隔两个亚层的连续膜结构。请点击此处查看该图的放大版本。

卵白蛋白分离与分析工作流程图；显微镜观察、用于蛋白质组学研究的SDS-PAGE。
图2：总结本实验方案两个主要步骤及应用示例的工作流程图。该方案已针对PL层的蛋白质组学分析进行了优化，但也可在某些步骤终止，以适用于其他应用。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质释放分析图；Tris、pH、NaCl 的影响；柱状图；蛋白质定量数据
图 3：PL 取样缓冲液组成的优化。简言之，将洁净的 PL（n = 4）与等体积的不同缓冲溶液在 2 小时内孵育。移除 PL 后，通过测定剩余缓冲液在 280 nm 处的吸光度来估算蛋白质浓度。（A）pH 8 条件下 Tris-HCl 浓度的影响。（B）pH（7 至 9）的影响。（C）NaCl 浓度的影响。根据这些结果，我们得出结论：由 10 mM Tris-HCl、pH 8、50 mM NaCl 组成的缓冲液最为合适，因其可最大限度减少蛋白质损失。结果表示为四个不同 PL 样品的平均值 ± 标准差。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，随后进行 Tukey 多重比较检验。P 值 <0.05 被认为具有显著性差异（ns，无显著性；* p<0.05，*** p<0.001，**** p<0.0001）。请点击此处查看该图的放大版本。

用于结构分析的带刻度剥离开的大蒜层，OPL 和 IPL。
图 4：双目解剖显微镜下的 OPL 和 IPL 特征。分离后，IPL（右侧）呈半透明状，而 OPL（左侧）呈不透明状。请点击此处查看该图的放大版本。

通过分子量比较IPL和OPL蛋白质样品的SDS-PAGE电泳结果。
图5：新鲜产出的未受精卵中分离得到的OPL和IPL的SDS-PAGE分析。使用4%–20%丙烯酰胺凝胶并进行考马斯亮蓝染色。分子量标准蛋白条带的质量以kDa表示。OPL图谱主要由分子量>30 kDa的蛋白质组成，而IPL图谱中检测到的主要条带分子量<30 kDa。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本实验方案的成功依赖于两个经过独立优化的关键步骤：首先是对内丛状层（IPL）和外丛状层（OPL）进行机械分离，该过程应尽可能减少结构破坏；其次是将各亚层中的蛋白质完全溶解，这一过程则需要进行结构破坏和变性。此外，本文还强调了为确保每一步骤成功实施所需考虑的一些特定要点。

该方案不依赖于蛋壳颜色、蛋重、生产类型或母鸡的遗传品系。然而，其效果取决于鸡蛋的新鲜程度。事实上，鸡蛋在产出后会迅速发生显著的内部理化变化，尽管在冷藏条件下储存可延缓这些变化14,15。储存期间，二氧化碳通过蛋壳孔隙逸出，导致蛋清pH值升高（从7.8升至9.5），同时蛋黄与蛋清之间通过蛋壳膜（PL）发生水分交换。这两种变化均对PL的分子结构和组织学结构产生负面影响，使其变得脆弱且张力降低14,15，这可能与其蛋白质成分的理化性质改变有关16,17,18。据推测，储存时间越长，尤其是室温下长期储存，PL各亚层的分离将变得极为困难。迄今为止，本方案所使用的鸡蛋均为在4 °C下储存不超过4天的鸡蛋，而能够有效分离PL亚层的鸡蛋最长可储存时间尚不明确。此外，若研究目标为分析各个亚层，则必须使用未受精的鸡蛋。在产蛋当天，受精蛋的胚胎已有23小时的发育历史，若将蛋进行孵化，其后续发育极为迅速。事实上，胚胎发育及部分胚外结构的生长会以PL作为基质，导致PL迅速降解，并被胚外卵黄囊所取代19。

在人工分离蛋黄和蛋清后，需要清除附着在蛋黄膜（PL）上的残留蛋清以及仍紧密附着的系带。建议将蛋黄小心地在滤纸上滚动，并用缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8）对蛋黄进行多次充分洗涤。所用缓冲液的pH值与蛋清的生理pH一致14，已被证明可最大限度减少蛋白质损失（图3）。使用冷藏缓冲液有助于将蛋黄膜从蛋黄上剥离，因为在4 °C时，脂质性的蛋黄会收缩并变得流动性降低，从而促进蛋黄膜的去除。进一步的洗涤步骤可清除蛋黄膜上的蛋黄残留物。此外，必须切除对应于胚盘的区域，因为该结构含有雌性原核，可能不能代表蛋黄膜的整体特性。当卵子受精时，此处是受精作用及胚胎细胞增殖的发生部位。该区域被认为具有特殊的组成，可能无法代表整个蛋黄膜，因此需将其去除。当蛋黄浸入低温缓冲液中时，此特定步骤的操作将得到显著改善。尽管本实验方案中将胚盘结构弃去（超出本研究目标范围），但对于关注胚胎发育早期阶段蛋黄膜成分（蛋白质组学与活性）及结构（电子显微镜）演变的研究人员而言，对受精卵中该区域进行专门分析可能具有重要价值19,20,21。至此，完整的蛋黄膜在结构上保持完整，可用于后续电子显微镜下的结构分析（图2），然后进入步骤1.2或步骤2.1（如果目标是分析完整的蛋黄膜）。

步骤1.2需在双目解剖显微镜下进行，因为外丛状层（PL）非常薄且脆弱（厚度约10 µm）。在无最低盐浓度的水或缓冲液中，亚层的分离几乎无法实现，此前尝试使用此类条件均导致PL严重损伤。因此，本步骤所选缓冲液保持生理pH（pH 8），并含有50 mM NaCl。该步骤操作繁琐，必须谨慎轻柔地进行，以防PL撕裂。分离完成后，两个亚层因其独特的物理特征（不透明与半透明）而易于区分。在显微镜光线下，若内丛状层（IPL）呈现不均一性，则提示分离不完全，即仍有外丛状层（OPL）残留于IPL上。此外，处理整张膜极为困难，使用2 cm × 3 cm大小的膜片可显著提高成功率。所得亚层适用于通过透射电子显微镜进行组织学研究图1值得注意的是，在显微照片中可见一种名为连续膜（CM）的特定线性结构，其厚度为0.05至1 μm。图1）并且在分离过程中通常保持附着于其中一层亚层。已有文献报道，当使用相对较高盐浓度（500 mM）进行分离时，细胞膜（CM）仍附着于外丛状层（OPL）。7 而水的使用5 将有利于CM与IPL的结合。本方案中采用低盐摩尔浓度以实现特定目标（保持PL亚层结构完整并最大程度减少蛋白质损失），这意味着该CM很可能与IPL相关联。然而，通过透射电子显微镜对IPL和OPL进行额外分析，将能明确验证这一假设。在步骤1结束时获得的PL、OPL或IPL层也可用于体外实验，以分析精子-卵子结合情况22 或分析胚胎发育的早期阶段23,24.

第2步涉及蛋白质成分的溶解，可部分（步骤2.1）或完全（步骤2.2）进行。首先将PL和/或OPL进行冻干，以去除水分子并实现精确的质量测定。事实上，PL主要由水（88%）7组成，而干物质中则主要含有蛋白质（根据不同研究为80%至90%）、碳水化合物、脂肪和矿物质2,7,25。考虑到PL中的水分通过冷冻干燥被去除，碳水化合物主要保留在PL的糖蛋白中，而来自蛋黄的脂肪和矿物质则通过多次洗涤被基本去除，因此可认为所得PL几乎完全由蛋白质构成。因此，完全冻干后获得的质量值主要对应于蛋白质。随后，将等量的PL、OPL和/或IPL溶解于含有0.5 M NaCl的缓冲液中。高盐浓度结合研磨对纤维网络的机械破坏，极大地促进了在非变性条件下蛋白质的溶解。接下来通过煮沸、SDS去垢剂以及还原剂β-巯基乙醇实现完全溶解（步骤2.2）。事实上，某些IPL蛋白质是SDS可溶性糖蛋白25,26,27，而OPL的主要成分是NaCl可溶性的1,11。采用本方案时，我们在离心后未观察到任何不溶性蛋白质沉淀，表明溶解过程很可能已完全。随后通过SDS-PAGE对PL、OPL和/或IPL中的蛋白质进行分析。所得蛋白质谱图与已发表文献一致2,4,11,16，但分辨率和信号强度显著提高，且在不同IPL和OPL独立样本之间表现出更高的均一性。

此外，由于我们推断出各亚层重量的准确性，使得外周层（OPL）与内周层（IPL）之间的定量比较成为可能2,7。而且，OPL 和 IPL 的谱带图谱差异显著，除了一条微弱的 14 kDa 和 75 kDa 条带外，两个 PL 亚层中并未明显共享具有相同分子量的条带。该观察结果证实了亚层分离的有效性，且无明显交叉污染。根据目前唯一发表的 PL 蛋白质组学分析1，OPL 中最显著的条带（<30 kDa）应为溶菌酶（14 kDa）、卵黄膜外层蛋白 1（17 kDa）和禽 β-防御素 11（表观分子量为 12 kDa）；而 IPL 中显著的条带（>30 kDa）则可能为 Zona-Pellucida 蛋白 1（102 kDa）和 Zona-Pellucida 蛋白 3（47 kDa）。PL 中丰度极高的蛋白质——如卵转铁蛋白（78 kDa）、卵清蛋白相关蛋白 X（45 kDa）和卵清蛋白（43 kDa）1——在两个亚层之间的分布仍有待阐明。事实上，这些蛋白质的高分子量（>30 kDa）提示它们应属于 IPL，这与 SDS-PAGE 图谱结果一致；但它们的组织特异性（在输卵管中表达的蛋白质）又更倾向于将其归为 OPL28,29。此外，有研究指出，由于洗涤不充分，PL 样品可能受到蛋清和蛋黄蛋白的潜在污染1。上述信息的缺失正是本实验方案开发的基础，该方案将用于 PL、OPL 和 IPL 的深入定量蛋白质组学研究。

或者，在步骤 2.1 之后，通过离心去除不溶性物质，可进一步提取某些特定蛋白质，用于生化和生物学表征。最近已有研究采用该方法对卵壳膜外层主要成分——卵黄膜外层蛋白 1（VMO1）和禽β-防御素 11（AvBD11）的生物学活性和/或三维结构进行了表征30,31。将这些蛋白质以纯化形式获得，也有助于制备特异性抗体，用于免疫组织化学等进一步实验，或用于开发包括酶联免疫吸附测定（ELISA）在内的定量检测方法。

本实验方案的两个主要局限性在于：（1）亚层分离的难度，尤其是当鸡蛋在 4°C 下储存超过 4 天时；（2）完全溶解蛋白质需要使用还原性和变性缓冲液，而这会损害所得样品的固有生物学活性。针对第一个局限性，机械分离需要一定的技术技巧，但在经过 2 至 3 次实验训练后即可熟练掌握。由于内颗粒层（IPL）和外颗粒层（OPL）两个亚层紧密结合，可能会有少量 IPL 组织残留在 OPL 上，反之亦然。然而，只要谨慎操作机械分离步骤，一种亚层对另一种亚层的污染应可降至最低。在理想亚层分离条件下，典型的 IPL 和 OPL 的 SDS-PAGE 图谱如图 5所示。针对第二个局限性，本文所述实验步骤已针对蛋白质组学分析进行了优化，旨在提供构成各亚层的蛋白质的全面列表。若需进一步表征各蛋白质的生物学活性，则应在第 2.1.2 步骤后终止操作，避免进入变性条件处理（第 2.2.1 步骤，使用含 SDS 和 β-巯基乙醇的缓冲液并进行煮沸）。值得注意的是，第 2.1.2 步骤获得的蛋白质仅为盐溶性蛋白质，而盐不溶性蛋白质则会形成聚集体。为进一步评估这些蛋白质各自的生物学活性，一种可行方案是利用异源表达系统（E. coli、杆状病毒、酵母等）将盐不溶性蛋白质以重组蛋白形式表达。

该方案可适用于其他鸟类的卵，以进行比较研究，从而更好地理解每个物种的独特性。事实上，蛋清（PL）在结构和蛋白质组成方面均表现出某些鸟类特有的特征，这可能归因于对新环境的适应，也与发育过程中的特异性有关2,6,9,32。本方案仅需中等技术水平和常规仪器/材料，为鸟类繁殖及物种形成研究领域开辟了新的研究途径。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢法国国家农业食品与环境研究院（INRAE，PEAT，37380，Nouzilly，法国，https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12）的 Philippe Didier 和 Karine Anger 提供未受精的 Isa-brown 鸡蛋。我们还感谢法国图尔大学为 M. Bregeon 的博士研究提供经费支持。本工作获得了法国国家科研署（EQLIPSE，ANR-19-CE21-0006）的财政资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
双目解剖显微镜Vision Engineering, France型号 Mantis Elite
冷冻干燥机Cryotec, France型号 Cosmos 80
Mini-Protean II 电泳槽Biorad, Hercules, USA1652960任何适用于蛋白质电泳的设备
Mixer Mill MM400Retsch, Hann, Germany20.745.0001适用于少量样品干法、湿法及低温研磨的混合研磨仪
不锈钢超细解剖剪，长度 12 cmDutscher, Brumath5066
超精细尖头镊子，抗磁性不锈钢，9.5 × 109.3 mmDutscher, Brumath327005

参考文献

  1. Mann, K. Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane. Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).
  2. Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -C. Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).
  3. Kido, S., Doi, Y. Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen's Eggs. Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).
  4. Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo. Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).
  5. Bain, J. M., Hall, J. M. Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen's egg: an electron microscope study. Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).
  6. Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds. PLoS One. 15 (1), 0228310(2020).
  7. Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. The vitelline membrane of the hen's egg: a chemical and electron microscopical study. Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).
  8. Kido, S., et al. Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability. Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).
  9. Damaziak, K., et al. Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs. Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).
  10. Kirunda, D. F., McKee, S. R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer. Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).
  11. Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen's eggs. Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).
  12. Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells. Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).
  13. Okumura, H., et al. A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction. Biochemical Journal. 384, Pt 1 191-199 (2004).
  14. Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F. Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation. Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. Roberts, J. 1, Burleigh Dodds Science Publishing Limited. Cambridge, UK. 161-193 (2016).
  15. Trziszka, T., Smolinska, T. Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs. Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).
  16. Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage. Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).
  17. Kelley, A. J. The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens. Texas A&M University. , Master of Science Thesis (2003).
  18. Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC. Zeitschrift Für LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).
  19. Romanoff, A. L. The avian embryo: Structural and functional development. , The Macmillan Company. New York, NY. (1960).
  20. Haas, H. J., Spratt, N. T. Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane's potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane. The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).
  21. Jensen, C. Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).
  22. Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males. Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).
  23. New, D. A. T. The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).
  24. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).
  25. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. I. Membrane structure and its deterioration with age. Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).
  26. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I. Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).
  27. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II. Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).
  28. Réhault-Godbert, S., et al. Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities. Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).
  29. Gautron, J., et al. Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer. Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).
  30. Guyot, N., et al. Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules. Scientific Reports. 6, 27974(2016).
  31. Guyot, N., et al. function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).
  32. Mori, M., Masuda, N. Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs. Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).

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