本方案概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中使用大鼠可提供更多的萎缩肌肉组织用于分析，并具备更丰富的已验证方法，用于评估自由活动动物的肌肉力量和步态。
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方法文章
大鼠骨骼肌中纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）与肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离与表征
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中固有的间质细胞，与肌源性祖细胞（MPs）共同在肌肉稳态、损伤及修复过程中发挥关键作用。目前针对FAPs的鉴定与分离方案主要依赖流式细胞术/荧光激活细胞分选（FACS），而迄今为止评估其功能的体内研究均 exclusively 在小鼠中开展。大鼠固有的体型较大，使得在骨骼肌损伤模型中对FAPs进行更全面的分析成为可能，尤其适用于严重萎缩的肌肉组织，或当研究人员需要大量组织样本以开展多项下游检测的情况。此外，大鼠还提供了更多可选的肌肉功能检测方法，这些方法无需对动物进行镇静或处死，从而通过连续多次评估显著降低动物发病率并减少动物使用量。目前为小鼠优化的流式细胞术/FACS方案具有物种特异性，尤其受限于 commercially available 抗体的特性，尚未针对大鼠或高度纤维化的肌肉组织中的FAPs分离进行优化。本研究建立了一种适用于健康及去神经支配大鼠骨骼肌中FAPs和MPs鉴定与分离的流式细胞术/FACS方案，该方案基于表面标志物CD31、CD45、Sca-1和VCAM-1的差异表达。由于经流式细胞术验证的、针对大鼠特异性的初级抗体极为有限，本研究自行完成了靶向Sca-1抗体的标记偶联。通过该方案，成功验证了Sca-1抗体的偶联效果，并通过细胞培养及对FACS分离获得的FAPs和MPs进行免疫染色，确认了流式细胞术对两类细胞的鉴定准确性。最后，我们报道了一种在长期（14周）大鼠去神经支配模型中FAPs动态变化的 novel 时间进程。该方法使研究人员能够在一种 novel 动物模型中开展FAPs的相关研究。
引言
纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）是一类存在于骨骼肌中的常驻多能祖细胞，在肌肉稳态、修复和再生中发挥关键作用；相反，它们也介导了肌肉损伤后的病理性反应。顾名思义，FAPs最初被鉴定为具有分化为成纤维细胞和脂肪细胞潜能的祖细胞群体1 ，并被认为是在慢性损伤和疾病状态下骨骼肌发生纤维-脂肪浸润的关键介导者。进一步研究表明，FAPs还具备成骨和软骨生成能力2,3,4。因此，在文献中更广泛地将其标记为间充质或基质祖细胞3,5,6,7,8。在急性骨骼肌损伤中，FAPs通过短暂增殖，为活化的肌肉卫星细胞及其下游的成肌祖细胞（MPs）提供有利微环境，从而间接促进再生性成肌过程1,9,10。随着再生成....
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方案
实施本方案的研究人员必须获得当地动物伦理委员会/护理委员会的许可。所有动物实验均经圣迈克尔医院Unity Health Toronto动物护理委员会（ACC #918）批准，并依照加拿大动物护理委员会（CCAC）制定的指南进行。流式细胞术方案的示意图见图1。如果后续应用为FACS及细胞培养，则所有步骤均需采用适当的无菌技术完成。
1. 肌肉组织的获取
- 使用适当的麻醉剂麻醉大鼠，并根据当地动物饲养设施和动物伦理委员会指南实施安乐死。本方案以成年雌性Lewis大鼠（200–250 g）的腓肠肌收获为例。大鼠通过2–3%异氟烷麻醉，并通过心内注射T61实施安乐死。
- 动物安乐死后，剃除整个后肢的毛发，以便于定位肌肉并最大限度减少收获组织中的毛发污染。
- 使用无菌手术刀在皮肤上做两个切口：第一个切口围绕踝关节周长，第二个切口沿后肢内侧中线从踝关节向上至髋部。
- 剥离皮肤和浅层肌肉组织，暴露出下方的腓肠肌，该肌肉起源于股骨的内侧和外侧髁，止于跟腱。
- 采用钝性分离法将腓肠肌与其周围组织分离，操作时仅通过肌腱抓持肌肉，以避免挤压损伤。
- 用锋利的剪刀尽可能远端横断跟腱，从而将腓肠肌从其止点分离。切断后，用镊子夹住跟腱，轻轻将腓肠肌从下方骨骼剥离。一手仍用镊子夹持肌肉，找到腓肠肌的两个起点，并在股骨内侧和外侧髁处切断。....
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结果
使用包含 Sca-1 和 VCAM-1 的新型抗体组合通过流式细胞术鉴定 FAP 和 MPs
在大鼠肌肉中鉴定 FAP 的设门策略基于小鼠的流式细胞术方案29，该方案通过设门排除 CD31（内皮细胞）和 CD45（造血细胞）阳性细胞（称为谱系细胞 [Lin]），并在谱系阴性（Lin-）群体中分析 FAP 标记物 Sca-1 和 MPs 标记物 ITGA7 的荧光信号。由于目前尚无商业化、荧光标记且经流式细胞术验证的适用于大鼠 Sca-1 和 ITGA7 的抗体，我们自行将 Sca-1 抗体与 APC 进行偶联，并采用替代策略来鉴定 MPs。最近研究表明，VCAM-1 可作为有效的大鼠 MPs 单阳性筛选标记33，且已有商品化的、针对大鼠特异性的、荧光标记并经流式细胞术验证的抗 VCAM-1 抗体，因此我们选择使用 VCAM-1 而非 ITGA7 来鉴定 MPs。
我们通过使用补偿微珠和来自健康大鼠腓肠肌的细胞悬液进行单一染色，验证了Sca-1:A.......
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讨论
一种经过优化且已验证的大鼠肌肉FAPs分离方案，对于希望研究因生物学或技术原因无法在小鼠中实施的损伤模型的研究人员至关重要。例如，小鼠并非研究慢性局部损伤或神经退行性损伤（如长期失神经支配）的理想动物模型。从生物学角度看，小鼠寿命短、衰老迅速，使得难以准确区分失神经支配引起的肌肉继发性改变与衰老这一混杂因素的影响。从技术角度看，由于严重萎缩导致肌肉质量显著减少，不足以进行有效的流式细胞术分析。事实上，现有小鼠FAPs分离方案建议将健康肌肉组织合并处理，以提高分选FAPs的得率29。尽管这种方法克服了获取足够肌肉组织进行分析的技术障碍，但同时也限制了研究人员在特定肌肉水平上对FAPs进行评估的能力。由于不同肌群在肌纤维类型组成、血管化程度以及线粒体数量等方面本就存在固有差异47 ，例如，将多种不同肌肉合并进行流式细胞术分析会阻碍对特定肌肉FAPs的特征解析。相比之下，我们证明无论是健康的，还是长期失神经支配后发生萎缩和纤维化的的大鼠腓肠肌，均能提供足够量的起始材料用于有效的流式细胞术分析。此外，在健康样本中，多余的肌肉组织还可进一步细.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢渥太华大学流式细胞术核心设施以及圣迈克尔医院Unity健康多伦多生物医学科学基南研究中心（KRC）在优化本论文所述流式细胞术/FACS方案方面提供的专业知识和指导。本研究由“通过设计实现医学进步”新理念2018基金（MbDNI-2018-01）资助，资助对象为JB。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 mL 聚丙烯圆底管 | Falcon | 352063 | |
| 带细胞筛帽的 5 mL 聚苯乙烯圆底管 | Falcon | 352235 | |
| 10 cm 细胞培养皿 | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12 孔细胞培养板 | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm 玻璃盖玻片，No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL 注射器 | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL 离心管 | FroggaBio | 91014 | |
| 20 号针头 | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25 mL 血清移液管 | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm 细胞筛 | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL 离心管 | FroggaBio | TB50 | |
| AbC 总抗体补偿微珠 | ThermoFisher | A10497 | |
| 氯化铵，试剂级 | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC 偶联试剂盒，50–100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex 水性封片介质 | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| 氯化钙 | Bioshop | CCL444.500 | |
| II 型胶原酶 | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus 绝对计数微珠 | ThermoFisher | C36995 | |
| 地塞米松 | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-葡萄糖 (+)L-谷氨酰胺 (+)110 mg/L 丙酮酸钠 |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean 清洗液 | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva 软件 | Beckton Dickenson | -- | |
| FACSRinse 冲洗液 | Beckton Dickenson | 340346 | |
| 胎牛血清 | Sigma | F1051 | |
| 流式细胞术鞘液 | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo 软件 | Beckton Dickenson | -- | |
| 荧光封片介质 | Dako | S302380-2 | |
| 山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555 二抗 | Invitrogen | A21424 | |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 488 二抗 | Invitrogen | A11008 | |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 555 二抗 | Invitrogen | A21429 | |
| 山羊血清 | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 培养基 | ThermoFisher | 11550043 | (+) 酚红 (+) L-谷氨酰胺 (-) HEPES |
| Hank’s 平衡盐溶液 (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| 热灭活马血清 | Gibco | 26050-088 | |
| 血细胞计数板 | Reichert | N/A | |
| HEPES，滴定纯度不低于 99.5% | Sigma | H3375 | |
| 马血清 | ThermoFisher | 16050130 | |
| 人转化生长因子 β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | 又称 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 |
| 异丙醇 | Sigma | I9516 | 又称 2-丙醇 |
| 雌性 Lewis 大鼠 | Charles River Kingston | 004 (品系编号) | 使用体重 200–250 克 |
| LSRFortessa X-20 台式流式细胞仪 | Beckton Dickenson | -- | |
| 微量离心机 | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP 细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 小鼠抗 CD31::FITC 抗体 | Abcam | ab33858 | 克隆号 TLD-3A12 |
| 小鼠抗 CD45::FITC 抗体 | Biolegend | 202205 | 克隆号 OX-1 |
| 小鼠抗 CD106::PE 抗体 | Biolegend | 200403 | 又称 VCAM-1 |
| 小鼠抗 MHC 抗体 | 发育研究杂交瘤库 (DSHB) | N/A | 又称 MF20 |
| 小鼠抗 Pax7 抗体 | 发育研究杂交瘤库 (DSHB) | N/A | |
| 中性缓冲福尔马林，10% | Sigma | HT501128 | |
| 油红 O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 偶联试剂盒 | Abcam | ab102903 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)氯化钙 (-)氯化镁 |
| 碳酸氢钾，试剂级 | Bioshop | PBC401.250 | |
| 兔抗成纤维细胞特异性蛋白 1 (FSP-1) 抗体 | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 又称 S100A4 |
| 兔抗整合素-a7 抗体 | Abcam | ab203254 | |
| 兔抗层粘连蛋白抗体 | Sigma | L9393 | |
| 兔抗 Perilipin-1 抗体 | Abcam | ab3526 | |
| 兔抗 Sca-1 抗体 | Millipore Sigma | AB4336 | |
| 兔重组抗 I 型胶原抗体 | Abcam | ab260043 | 又称 Col1a1 |
| 兔重组抗 PDGFR Alpha 抗体 | Abcam | ab203491 | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 (FGF-basic) | Gibco | PHG0266 | |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | |
| 吐温-100 (Triton-X-100) | Fisher Scientific | BP151 | |
| 曲格列酮 | Millipore Sigma | T2573 | |
| 吐温-20 (Tween-20) | Bioshop | TWN510 |
参考文献
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J.
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重印与许可
