方法文章

大鼠骨骼肌中纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离和表征

DOI：

10.3791/61750

⸱

2021年6月9日

 ,  ,  , 
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中利用大鼠为分析提供了来自萎缩肌的组织可用性的增加，以及用于评估自由移动动物的肌肉力量和步态的更多经过验证的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中的常驻间质细胞，与肌原祖细胞（MPs）一起在肌肉稳态，损伤和修复中起关键作用。目前用于FAPs鉴定和分离的方案使用流式细胞术/荧光激活细胞分选（FACS），迄今为止 在体内 评估其功能的研究仅在小鼠中进行。大鼠较大的固有尺寸允许对骨骼肌损伤模型中的FAPs进行更全面的分析，特别是在严重萎缩的肌肉中，或者当研究人员需要大量的组织质量进行多次下游测定时。大鼠还提供了更多不需要动物镇静或牺牲的肌肉功能测定选择，从而通过进行连续评估来最大限度地减少发病率和动物使用。针对小鼠优化的流式细胞术/ FACS方案具有物种特异性，特别是受市售抗体特性的限制。它们尚未针对将FAPs与大鼠或高度纤维化肌肉分离进行优化。基于表面标志物CD31，CD45，Sca-1和VCAM-1的差异表达，开发了一种流式细胞术/ FACS方案，用于从健康和去神经化大鼠骨骼肌中鉴定和分离FAPs和MP。由于大鼠特异性，流式细胞术验证的一抗受到严重限制，因此进行了靶向Sca-1的抗体的内部偶联。使用该协议，确认了成功的Sca-1偶联，并通过细胞培养和FACS分离的FAP和MP的免疫染色来验证FAP和MP的流式细胞术鉴定。最后，我们在延长（14周）大鼠去神经支配模型中报告了一种新的FAPs时间过程。这种方法为研究人员提供了在新型动物模型中研究FAPs的能力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中常驻的多能祖细胞群，在肌肉稳态，修复和再生中起关键作用，相反，还介导对肌肉损伤的病理反应。顾名思义，FAPs最初被确定为具有分化成成纤维细胞和脂肪细胞1的潜力的祖细胞群体，并且据称是慢性损伤和疾病中骨骼肌纤维脂肪浸润的关键介质。进一步的研究表明，FAPs还具有成骨和软骨形成2，3，4的能力。因此，它们在文献中被更广泛地标记为间充质或基质祖3，5，6，7，8。在急性骨骼肌损伤中，FAPs通过短暂增殖间接帮助再生肌生成，为激活的肌肉卫星细胞及其下游肌原祖（MPs）对应物1，9，10提供有利的环境。在成功再生的同时，FAPs经历凋亡，使其数量恢复到基线水平1，9，10，11。相反，在慢性肌肉损伤中，FAPs会覆盖促凋亡信号，这导致它们持续存在9，10，11和异常的肌肉修复。

评估FAPs介导肌肉反应的细胞和分子机制的体内研究利用了迄今为止的小鼠动物模型1，7，9，10，11，12，13，14。虽然基因工程小鼠是用于这些分析的强大工具，但动物的小尺寸限制了在长期局部损伤模型中研究的组织可用性，其中肌肉萎缩可能是深刻的，例如创伤性去神经支配。此外，肌肉力量和身体功能的测量需要需要终止小鼠的离体或原位测量，或需要手术和/或全身麻醉的体内方法，以评估肌肉收缩性能15，16，17，18，19，20.在大鼠中，除了对更复杂的运动行为（例如步态分析，例如坐骨神经痛功能指数，CatWalk分析）的分析之外，还存在经过良好验证和全球利用的肌肉功能分析，并在清醒和自发移动的动物中进行21，22，23，24.这还优化了动物实验中最低发病率的原则，以及使用的研究动物的数量。因此，大鼠为FAPs研究者提供了更大的损伤肌肉体积的灵活性，用于蛋白质和细胞分析，并且能够对警觉动物中的肌肉复合物静态和动态功能活动和行为进行连续评估。

FAPs主要分别使用流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）从全肌肉样品中鉴定和分离。这些是基于激光的测定，能够根据特征特征（例如大小，粒度以及细胞表面或细胞内标记物的特定组合）鉴定多个特定细胞群25。这在骨骼肌等器官系统的研究中非常有利，因为稳态和再生是由大量细胞类型协调的复杂多因素过程。一项开创性的研究确定了FAPs以及MP，在小鼠骨骼肌中使用流式细胞术方法1。他们证明FAPs本质上是间充质的，因为它们缺乏来自内皮（CD31），造血（CD45）或肌源性（整合素-α7 [ITGA7]）起源的细胞特异性的表面抗原，但表达间充质干细胞标志物Sca-1（干细胞抗原1）1并在培养物中分化成纤维化和脂肪生成细胞。其他研究表明，基于替代干细胞标志物，血小板衍生的生长因子受体α（PDGFRα）2，7，8的表达，成功分离肌肉间充质祖细胞，进一步的分析显示这些可能与FAPs3相同。FAPs现在通常在流式细胞术中使用Sca-1或PDGFRα作为阳性选择标记物1，9，10，11，12，13，14，26，27，28，29，30，31.PDGFRα的使用对人体组织是首选的，然而，作为小鼠Sca-1的直接人类同系物尚未被鉴定32。此外，其他细胞表面蛋白已被报道为MP的标志物（例如，VCAM-1），为ITGA7提供了一种潜在的替代方案，作为FAPs分离期间肌源谱系细胞的指标33。

虽然流式细胞术/FACS是研究FAPs在骨骼肌1、9、10、11、13、29中的作用和致病潜力的强大方法，但它在技术上受到其所需试剂的特异性和优化的限制。由于流式细胞术鉴定和分离FAPs已经在小鼠动物模型1、9、10、11、29中得到开发和进行，这给希望在其他模式生物中研究FAPs的研究人员带来了挑战。许多因素 - 例如要处理的最佳组织尺寸，以及试剂和/或抗体特异性和可用性 - 因所用物种而异。

除了在新型动物模型中研究FAPs的技术障碍外，它们在很大程度上是在急性有毒环境中研究的 - 通常通过肌内化学注射或心脏毒素。对FAPs长期动力学的评估主要限于评估杜氏肌营养不良症，使用mdx小鼠模型9，10，11和组合肌肉损伤模型，如巨大的肩袖撕裂，其中同时在肩部肌肉组织上进行肌腱横断和去神经支配26，27，28.FAPs对慢性创伤性去神经支配的唯一侮辱的反应，在重工业，农业和出生创伤（臂丛神经损伤）34，35，36，37中常见的工作场所事故中发生，具有显着的发病率，尚未得到很好的表征，通常仅限于短期时间范围11，38。

我们描述了一种从大鼠的健康以及严重萎缩和纤维化骨骼肌中识别和分离FAPs和MP的方法。首先，使用组织消化和流式细胞术染色方案鉴定CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs和CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+MPs，并通过对FACS分离的细胞进行培养和免疫细胞化学染色，随后对我们的发现进行验证。使用这种方法，我们还在大鼠的长期孤立去神经支配损伤模型中报告了一种新的FAPs时程。

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方案

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执行该协议的调查人员必须获得当地动物伦理委员会/护理委员会的许可。所有动物工作均由圣迈克尔医院团结健康多伦多动物护理委员会（ACC #918）批准，并根据加拿大动物护理委员会（CCAC）制定的指导方针进行。流式细胞术方案的示意图如图 1所示。如果下游应用是FACS和随后的细胞培养，则应使用适当的无菌技术完成所有步骤。

1. 肌肉收割

  1. 根据当地动物饲养场和动物伦理委员会指南，使用适当的麻醉剂和牺牲对大鼠进行麻醉。例如，该协议从成年雌性刘易斯大鼠（200-250g）收获腓肠肌。使用2-3%异氟醚麻醉大鼠，并通过心内注射T61来处死大鼠。
  2. 一旦动物被处死，剃掉整个后肢，以促进肌肉的位置，并尽量减少收获组织的毛皮污染。
  3. 使用无菌手术刀，在皮肤上做两个切口:第一个切口在踝关节的周长周围，第二个在从脚踝到臀部的后肢内侧的中线。
  4. 剥离皮肤和浅表肌肉层，露出下方的腓肠肌，它起源于股骨的内侧和外侧髁，插入跟腱。
  5. 使用钝性夹层将腓肠肌与周围组织分开，仅通过肌腱处理肌肉，以避免挤压伤。
  6. 用锋利的剪刀将跟腱尽可能远端切除，将腓肠肌腱与其插入分开。切开后，用镊子抓住跟腱，轻轻地将腓肠肌从下层骨上剥离。仍然用一只手用镊子握住肌肉，找到腓肠肌的两个起源，并在内侧和外侧股骨髁处切开。
  7. 将切除的腓肠肌轻轻擦拭在无菌纱布上，以尽可能多地去除血液。修剪无菌表面上的肌肉，去除任何多余的结缔组织以及跟腱。
  8. 将肌肉放在称重艇中，并使用精密秤称重。该协议经过优化，可消化湿重为200-600毫克的肌肉。如果需要，操作员可以将多余的收获组织细分为其他下游检测。
  9. 轻轻地进一步将收获的肌肉分成3-4个较小的块（约1-2 cm3），并浸没在冰冷的1x PBS中。在冰上保持冷藏，直到所有样品都收获完毕。

2. 肌肉消化

  1. 从PBS中取出肌肉，并置于无菌的10cm细胞培养皿中。用镊子轻轻撕开并切碎组织，直到碎片约3-4毫米3，去除尽可能多的结缔组织。一旦完全切碎，转移到含有6 mL DMEM + 1%青霉素/链霉素（P / S）的无菌50 mL锥形管中。
  2. 将10μL300mM CaCl2溶液加入365μL胶原酶II溶液（储备浓度4800 U / mL）以激活胶原酶酶。将活化的胶原酶II溶液加入含有组织浆液的50mL锥形管中。最终胶原酶 II 浓度为 250 U/mL。
  3. 将管子在37°C，240 x g的摇摇杯中孵育1小时，确保每15分钟手动旋转一次，以移走粘附在管子侧面的任何组织。
  4. 1小时后，从摇摇杯中取出试管，并为每个样品加入以下内容:100μL胶原酶II（4，800 U / mL）和50μLDispase（4.8 U / mL）。
  5. 使用血清学移液器移液样品15-20次，直到溶液均质。如果处理多个样品，请为每个样品使用单独的无菌移液器，以避免样品交叉污染。
  6. 在37°C和240×g的振荡器中再次孵育30分钟。 15分钟后，用手摇动样品，将粘附组织从管的侧面移开。

3. 单细胞悬浮液的产生

  1. 用 20 G 针头通过 10 mL 注射器缓慢剪切样品 10 个循环。
    注意:一个周期涉及将肌肉溶液吸收到注射器中，然后将其注射回管中。确保通过缓慢完成剪切来最小化任何气泡，因为过多的泡沫会导致额外的细胞死亡39。









    11. figure-protocol-1









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结果

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使用包括 Sca-1 和 VCAM-1 在内的新型抗体组合，通过流式细胞术鉴定 FAP 和MP
用于识别大鼠肌肉中FAPs的门控策略基于小鼠29的流式细胞术方案，其门控CD31（内皮）和CD45（造血）阳性细胞（称为谱系[Lin]），并检查来自谱系阴性（Lin-）群体的FAPs标志物Sca-1和MP标记ITGA7的荧光谱。在缺乏市售的荧光团偶联和流式细胞术验证的大鼠Sca-1和ITGA7抗体的情况下，我们自偶联了大鼠Sca-1::APC抗体，并采取了替代策略来鉴定MP。由于VCAM-1最近被证明是分离大鼠MPS33 的有效单一阳性选择标记物，并且可以使用靶向VCAM-1的大鼠特异性，偶联，流式细胞术验证的抗体，因此我们使用VCAM-1来鉴定MP，而不是ITGA7。

我们证实了Sca-1:APC抗体与健康大鼠腓肠杆菌产生的补偿珠和细胞悬浮液的单染色的...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对于希望研究由于生物学或技术原因在小鼠中不可行的损伤模型的研究人员来说，针对大鼠肌肉的优化，经过验证的FAPs分离方案至关重要。例如，小鼠不是研究慢性局部或神经退行性损伤（如长期去神经支配）的最佳动物模型。从生物学上讲，小鼠的短寿命和快速衰老使得由于衰老混杂因素的去神经支配而难以准确描绘肌肉特征。从技术角度来看，由于严重萎缩导致的肌肉质量急剧减少不足以进行有效的流式细胞术分析。事实上，小鼠FAPs分离方案建议将健康的肌肉组合在一起，以更好地增加分类FAPs29的产量。虽然这解决了获得足够的肌肉组织进行分析的技术障碍，但它同时限制了研究人员在肌肉特定水平上评估FAPs。例如，由于特定肌肉群的纤维类型组成、血管化程度和线粒体数47存在固有的差异，因此组合多个不同的肌肉进行流式细胞术分析可防止肌肉特异性FAPs表征。相比之下，我们表明，健康和长期去雾化，萎缩和纤维化大鼠胃肠为有效的流式细胞术提供了足够量的起始材料。此外，在健康样品中，多余的肌肉可以进一步细分为多个下游测定，使研究人员能够同时分析同一组织的细胞，分子和组织学特征。最后，对于用治疗方法...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有冲突要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢渥太华大学的流式细胞术核心设施和基南生物医学科学研究中心（KRC），多伦多圣迈克尔斯医院Unity Health在优化本手稿中介绍的流式细胞术/ FACS方案方面的专业知识和指导。这项工作由医学设计新想法2018年基金（MbDNI-2018-01）资助给JB。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 mL 聚丙烯圆底管Falcon352063
5 mL 聚苯乙烯圆底管，带细胞过滤器盖Falcon352235
10 cm 细胞培养皿Sarstedt83.3902
12 孔细胞培养板ThermoFisher130185
12 mm 玻璃盖玻片，No.2VWR89015-724
10 mL 注射器Beckton Dickenson302995
15 mL 离心管FroggaBio91014
20 号针头Beckton Dickenson305176
25mL 血清移液管Sarstedt86.1685.001
40µM 细胞过滤器Fisher Scientific22363547
50mL 离心管FroggaBioTB50
AbC 总抗体补偿珠 ThermoFisherA10497
氯化铵，试剂级BioshopAMC303.500
APC 偶联试剂盒，50-100µgBiotium92307
Aquatex 水性封片剂Merck108562
生物层粘连蛋白 411 LNBiolaminaLN411
牛血清白蛋白 （BSA）BioshopALB001
氯化钙Bioshop CCL444.500
II 型胶原酶Gibco17101015
CountBright Plus 绝对计数微球ThermoFisherC36995
地塞米松Millipore SigmaD4902
分散酶Gibco17105041
Dulbecco's 改良 Eagle 培养基 （DMEM） （1X）Gibco11995-065（+）4.5 g/L D-葡萄糖
（+）L-谷氨酰胺
（+）110 mg/L 丙酮酸钠
EDTAFisherScientificS311
FACSClean 解决方案Beckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse 解决方案Beckton Dickenson
牛血清SigmaF1051
流式细胞术鞘液Beckton Dickenson342003
FlowJo 软件Beckton Dickenson--
荧光封固剂DakoS302380-2
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555 二抗InvitrogenA21424
山羊抗兔 Alexa Fluor 488 二抗InvitrogenA11008
山羊抗兔 Alexa Fluor 555 二抗InvitrogenA21429
山羊血清Gibco16210-064
火腿 F10 培养基ThermoFisher 11550043（+） 酚红
（+） L-谷氨酰胺
（-） HEPES
Hank's 平衡盐溶液 （HBSS） （1X）多池311-513-CL
热灭活马血清Gibco26050-088
血球计数器ReichertN/A
HEPES，最低 99.5% 滴定SigmaH3375
马血清ThermoFisher16050130
人转化生长因子和 β;1 （hTGF -&β;1）Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879也称为 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
异丙醇SigmaI9516也称为 2-丙醇
Lewis 大鼠，雌性Charles River Kingston004 （菌株代码）200-250 克使用
LSRortessa X-20台式流式细胞仪Beckton Dickenson--
微量离心机EppendorfEP-5417R
MoFlo XDP 细胞分选仪Beckman Coulter--
小鼠抗 CD31：：FITC 抗体Abcamab33858克隆 TLD-3A12
小鼠抗 CD45：：FITC 抗体Biolegend202205克隆 OX-1
小鼠抗 CD106：:P E抗体Biolegend200403也称为 VCAM-1
小鼠抗 MHC 抗体发育研究 杂交瘤库 （DSHB）N/A也称为 MF20
小鼠抗 Pax7 抗体发育研究 杂交瘤库 （DSHB）N/A
中性缓冲福尔马林，10 %SigmaHT501128
油红 OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 偶联试剂盒Abcamab102903
青霉素-链霉素Sigma P4333
磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4 （1X）Gibco10010-023（-）氯化钙
（-）氯化镁
氢钾，试剂级BioshopPBC401.250
兔抗成纤维细胞特异性蛋白 1 （FSP-1） 抗体InvitrogenMA5-32347FSP-1 也称为 S100A4
兔抗整合素-a7 抗体Abcamab203254
兔抗层粘连蛋白抗体SigmaL9393
兔抗磷脂-1 抗体Abcamab3526
兔抗 Sca-1 抗体Millipore SigmaAB4336
兔重组抗 I 型胶原抗体Abcamab260043也称为 Col1a1
兔重组抗 PDGFRα 抗体Abcamab203491
重组人 FGF 碱性GibcoPHG0266
氮化钠SigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
曲格列酮Millipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510
340346胎碳酸叠

参考文献

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