方法文章

用于表征纳米材料蛋白与代谢物冠层的毛细管电泳-质谱联用方法

4.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61760

⸱

2020年10月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Geography Earth and Environmental Sciences, University of Birmingham, 2Biomedical Microscale Analytics, Leiden University, 3Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck, 4AB Sciex UK Ltd

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用毛细管电泳-质谱联用技术，对纳米材料从生物流体中吸附的完整生物分子冠（包括蛋白质和代谢物）进行表征的实验方案。

摘要

过去十年中，生物分子从周围生物基质吸附到纳米材料（NMs）表面形成蛋白冠的现象引起了广泛关注。人们对生物-纳米界面的关注源于这样一个事实：生物分子冠赋予纳米材料一种生物学身份，从而使机体将其识别为“自身”。例如，先前的研究已证明，蛋白冠中的蛋白质能够与膜受体相互作用，影响细胞摄取，并证实蛋白冠在纳米材料的细胞内转运及其最终毒性中起决定性作用。迄今为止，大多数研究集中于蛋白冠，而忽视了蛋白冠中所含代谢物可能产生的影响，或完整生物分子冠中各组分之间的协同效应。因此，本研究展示了采用自下而上的蛋白质组学与代谢组学方法并行分析生物分子冠中蛋白质和代谢物组分的表征技术。该方法包括使用表面活性剂对蛋白冠进行原位酶解以提高蛋白质回收率，以及通过分析纳米材料暴露前后代谢物基质的变化来被动表征代谢物冠。本研究引入毛细管电泳-质谱联用技术（CESI-MS）作为纳米材料蛋白冠表征的新方法。文中所述方案展示了如何利用CESI-MS可靠地表征纳米材料所形成的蛋白质和代谢物冠。相较于传统的液相色谱-质谱（LC-MS）方法，CESI-MS显著降低了所需样品体积，仅需5 µL样品即可实现多次进样，因此特别适用于样品体积受限的情况。此外，由于CESI-MS具有极低的流速（<20 nL/min）并使用水性电解质，避免了有机溶剂的使用，因而相较于LC-MS显著减少了分析过程对环境的影响。

引言

在纳米材料（NM）表面与生物基质之间的界面上发生的生物-纳米相互作用，是当前纳米安全性与纳米医学研究中的一个热点领域1。吸附在NM表面的生物分子层赋予了纳米材料一种生物学身份，使细胞将其识别为“自身”物质，从而影响纳米材料的细胞摄取、分布及生物学效应终点2,3,4。绝大多数生物-纳米研究集中于蛋白冠中的蛋白质，已证明不同组成的纳米材料其蛋白冠在种类和数量上均存在差异5。这种差异既取决于纳米材料本身的特性（如尺寸、表面功能化和材料性质），也受生物基质特性（如组成成分和盐浓度）的影响5。当前生物-纳米界面研究中日益受到关注的一个方向是吸附在纳米材料上的代谢物6。多项研究表明，与蛋白质类似，纳米材料的特性是决定蛋白冠中代谢物组成的关键因素，并且这些代谢物可影响纳米材料暴露后的生物学结果6,7,8。

在生物分子冠的研究中，其表征过程可分为四个明确的阶段：生物分子冠的形成、冠中生物分子的分离、通过定性或定量质谱进行检测以及鉴定9。迄今为止，已采用多种技术用于分离蛋白冠，包括在SDS-PAGE电泳缓冲液中煮沸、溶剂和盐类萃取，或直接在纳米材料（NMs）表面原位消化蛋白质。对于冠中代谢物的分离，则更为复杂，已有多种方法被提出，如使用溶剂提取，甚至通过溶解纳米材料来实现8,10,11。然而，与蛋白冠不同，由于代谢物组所涵盖的化学空间广泛，且纳米材料的种类多样，难以采用统一的“通用型”方法来实现从各类纳米材料中分离代谢物。另一种替代策略是在纳米材料暴露前后对生物基质进行表征，将代谢物浓度的变化归因于其在纳米材料表面的吸附12。

这种替代方法适用于所有生物流体和纳米材料；尽管需要进行两倍量的分析，但它能更精确地测定代谢物冠层，且不会将纳米材料表面代谢物回收率低误认为是特定代谢物结合能力弱。

生物分子冠分析的第二步是生物分子的检测。传统上，对于冠层中的蛋白质，这一任务主要由纳米液相色谱-质谱法（nano-LC-MS）承担，后者是蛋白质组学的核心技术；其他方法如核磁共振（NMR）13、一维和二维SDS-PAGE也已被应用。在代谢物冠层方面，已采用液相色谱-质谱法（LC-MS）7、气相色谱-质谱法（GC-MS）8以及直接进样质谱法14。然而，一种新兴方法近年来逐渐受到关注，即毛细管电泳-质谱法（CE-MS）11,15，该技术此前已在纳米材料（NM）实验室中作为独立技术用于表征纳米材料的各种物理和化学性质16。CE-MS是一种与nanoLC-MS和GC-MS正交的分离技术，能够实现对高极性和带电代谢物的检测17,18。此外，CE-MS也非常适用于蛋白质及其翻译后修饰（如磷酸化和糖基化）的分析19,20,21,22。最后一步——鉴定与数据分析——可根据所采用的是定量/定性或靶向/非靶向策略，通过多种方式进行，但此部分内容不在本实验方案的范围之内。

CESI-MS 是毛细管电泳（CE）与纳米电喷雾电离（nanoESI）接口相结合的技术，是近年来毛细管电泳技术的一项进展，采用无鞘流接口设计。该技术可将超低流速的毛细管电泳（<20 nL/min）直接连接至高分辨质谱仪，且无稀释效应，从而显著提高检测灵敏度23,24,25。CESI-MS 能够在保持高度灵敏分析的同时，对体积受限的样品（< 10 µL）进行分析26。在重现性27,28、通量和交叉污染等方面，CESI-MS 与蛋白质组学和代谢组学中传统的低流速 nanoLC-MS 方法相比也具有优势，因此在全面表征生物分子冠方面展现出广阔的应用前景。

为了突出CESI-MS在生物-纳米相互作用分析中的潜力，本研究描述了从单个人类血浆样本中分离纳米材料生物分子冠的样品制备方法，旨在最大限度地获取完整的生物分子冠中蛋白质和代谢物两方面的数据。尽管本文报告使用的是人血浆，但该方案同样适用于其他生物流体，如血液血清、完全细胞培养基、细胞裂解液、脑脊液或尿液。随后将分别采用中性涂层CESI毛细管分析蛋白质冠，以及裸熔融石英毛细管分析阳离子和阴离子代谢物，对这两个组分（蛋白质和代谢物）进行分析。

方案

使用人源性生物流体已根据莱顿大学和因斯布鲁克医科大学的机构审查委员会（IRB）协议指南获得批准。当研究涉及人或动物的生物流体时，必须获得研究机构的伦理审批，本方案所示结果的研究已取得相应批准。此外，应进行充分的数据报告，以确保未来研究中数据的透明性和可重复使用性9,29,30。

1. 背景电解质（BGE）的制备

注意：所有溶剂均应在合适的通风橱中配制，且所有步骤均需使用适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜）。每一步均需使用低吸附塑料离心管，以最大限度减少分析物损失以及玻璃器皿中浸出的盐类对样品的污染。

  1. 为代谢组学分析，每日配制10%乙酸BGE（v/v），pH 2.2。
    1. 取1 mL乙酸加入10 mL容量瓶中，再加入去离子水（DI水）至刻度线，充分混匀。
  2. 为蛋白质组学分析，每日配制100 mM乙酸，pH 2.9。
    1. 取57 µL乙酸加入10 mL容量瓶中，再加入去离子水（DI水）至刻度线，充分混匀。

2. 纳米材料制备

  1. 根据已发表的指南，将纳米材料（NMs）在水中充分分散31,32,33。
    注意：在本方案的开发过程中，共使用了7种纳米材料，具体如下：100 nm 和 1,000 nm 的羧基化聚苯乙烯分别用于蛋白质和代谢物冠状结构的研究；100 nm 未修饰聚苯乙烯纳米材料、13 nm 未修饰锐钛矿型 TiO2 纳米材料（或经聚丙烯酸盐或 PVP 聚合物包覆）以及 22 nm 未修饰 SiO2 纳米材料则同时用于蛋白质和代谢物冠状结构的研究。尽管该方法是基于上述纳米材料开发并验证的，但需指出的是，该方法适用于多种不同成分、尺寸、形状和形貌的纳米材料。
  2. 采用动态光散射34,35、单颗粒电感耦合等离子体质谱36、纳米颗粒追踪分析37或透射电子显微镜测定粒径，并使用泽塔电位仪通过测定泽塔电位表征表面电荷34。

3. 生物分子冠的形成

  1. 将2 mL人血浆（或选定的生物流体）分装为1 mL等份，一份用于代谢物和蛋白质冠层分析，另一份用于血浆代谢组表征。
  2. 将1 mg/mL的纳米材料在人血浆中37℃孵育1小时 ˚C，在恒温混匀仪中以500 rpm轻轻混匀。孵育后，在4,000 x g 4℃下孵育15分钟 ˚C 以沉淀纳米材料。
  3. 收集血浆上清液用于代谢物冠层分析。保留纳米材料-蛋白冠层复合物用于蛋白冠层表征。

4. 蛋白质冠分离

  1. 将纳米材料-蛋白质复合物（沉淀）重悬于1 mL 10x PBS缓冲液中，剧烈涡旋振荡2分钟，以去除未结合的蛋白质。将PBS溶液在4,000 x g 4℃下孵育15分钟 ˚C离心以沉淀纳米材料，并小心移除上清液，避免扰动沉淀物。
  2. 将沉淀重悬于1 mL碳酸氢铵缓冲液（ABC）（100 mM，pH 8.0）中，剧烈涡旋振荡2分钟，以去除未结合的蛋白质和不需要的盐分。在4,000 x g 4℃下孵育15分钟 ˚C 下离心以沉淀纳米材料；移除并弃去上清液。重复此步骤一次。
  3. 通过将纳米材料-蛋白质沉淀物溶解于20 μL还原缓冲液中，以还原蛋白质的二硫键 µL ABC缓冲液（100 mM，pH 8），含10 mM二硫苏糖醇。将还原溶液于56 °C孵育30分钟 ˚C.
  4. 为消化蛋白质，加入2 µ20 微克测序级胰蛋白酶 µL 含 0.1% 表面活性剂的 ABC。将消化液于 37 °C 孵育 16 小时 ˚C.
  5. 通过加入20 µL烷基化试剂对样品进行烷基化处理 µ100 mM ABC 中含有 55 mM 碘乙酰胺的 L，室温孵育 20 分钟。
  6. 加入20 µ加入 0.1 M HCl 溶液 1 L 以裂解表面活性剂，并在室温下静置 10 分钟。
  7. 使用C18填充的脱盐移液枪头对肽段进行富集和脱盐。
    1. 用80润湿尖端 µL 0.1% 甲酸 50% 乙腈 5 次，用 80 µL 0.1% 甲酸5次，吸取并洗脱样品10次，通过冲洗80次对样品进行脱盐 µL 0.1% 甲酸洗涤5次，并用80 µ将0.1%甲酸70%乙腈加入洁净的低吸附PCR管中。
  8. 将样品冻干并于 -20 ℃ 保存 ˚C，直至分析。

5. 代谢物冠层的分离

  1. 取第3.3步中制备的对照血浆和纳米材料血浆孵育后的上清液，在样品制备过程中保持冰上放置。
  2. 分别取50 µL至不同的小瓶中，用去离子水按1:10稀释。从每种稀释后的样品中取50 µL转移至新小瓶，用于第5.3步。
  3. 加入200 µL氯仿、250 µL甲醇和350 µL去离子水，剧烈涡旋混合2分钟。在4 ˚C下以20,800 × g离心10分钟。
  4. 取500 µL上清液，通过3 kDa离心滤膜在4 ˚C下以10,000 × g过滤2小时。取430 µL滤过液，在真空浓缩仪中干燥。样品现可在分析前冷冻保存。

6. CESI-MS 系统的准备38

注意：在安装毛细管之前，应检查毛细管的入口端和出口端是否完好，确认毛细管无可见破损。

  1. 用于蛋白质冠分析的中性涂层毛细管的安装39。
    1. 按照制造商指南，将一根新的中性涂层毛细管（90 cm 长，内径 30 µm）安装至 CESI 仪器中。
  2. 用于蛋白质组学分析的 CESI 毛细管准备。
    1. 使用 100 mM 盐酸以 100 psi 压力正向冲洗分离毛细管 5 分钟，并检查毛细管出口端是否形成液滴。随后以 100 psi 压力用 BGE 冲洗分离毛细管 10 分钟，再以 100 psi 压力用去离子水冲洗 30 分钟（此步骤仅适用于新毛细管）。
    2. 以 90 psi 压力用 BGE 同时冲洗分离毛细管和导电毛细管 5 分钟，并确保两根毛细管出口端均形成液滴。
    3. 以 90 psi 压力用去离子水冲洗分离毛细管 10 分钟，接着以 50 psi 压力用 0.1 M 盐酸冲洗 10 分钟，再以 90 psi 压力用去离子水冲洗 10 分钟，最后以 90 psi 压力用 BGE 冲洗 10 分钟。使用纳米电喷雾源和适配器将 CESI 与质谱仪连接，方法如前所述38。
  3. 用于代谢物冠表征的裸熔融石英毛细管的安装38。
    1. 按照制造商指南，将一根新的裸熔融石英毛细管（90 cm 长，内径 30 µm）安装至 CESI 仪器中。
  4. 用于代谢组学分析的 CESI 毛细管准备。
    1. 以 50 psi 压力使用 100% 甲醇正向冲洗分离毛细管 15 分钟，并检查毛细管出口端是否形成液滴。随后以 90 psi 压力用 BGE 同时冲洗分离毛细管和导电毛细管 5 分钟，并确保两根毛细管出口端均形成液滴。
    2. 以 90 psi 压力用去离子水冲洗分离毛细管 10 分钟，接着以 50 psi 压力用 0.1 M 氢氧化钠冲洗 10 分钟，再以 90 psi 压力用去离子水冲洗 10 分钟，最后以 90 psi 压力用 BGE 冲洗 10 分钟。使用纳米电喷雾源和适配器将 CESI 与 ESI-MS 连接，方法如前所述38。

7. 蛋白质冠分析的毛细管电泳-质谱法

  1. 将步骤4.8的样品重悬于20 µL、50 mM、pH 4.0的乙酸铵溶液中。
  2. 对样品进行水动力进样，压力为5 psi，持续10秒。采用30 kV分离电压进行分离，压力梯度如下：0–10分钟为1 psi，10–35分钟为1.5 psi，35–45分钟为5 psi，背景电解质（BGE）为100 mM、pH 2.9的乙酸。
  3. 采集质谱数据范围为250–2000 m/z，采用前10位数据依赖性碎裂模式进行采集。
  4. 样品之间，使用0.1 M盐酸以100 psi冲洗毛细管3分钟，随后对分离毛细管以100 psi持续10分钟BGE冲洗，导电液毛细管则以100 psi持续3分钟BGE冲洗。

8. 用于代谢物冠层分析的 CESI-MS

注意：所有样品必须分析两次，一次采用正离子模式检测阳离子，一次采用负离子模式检测阴离子。对照血浆样品至少需要分析5次。

  1. 将第5.4步中经纳米材料暴露和未暴露的血浆样品重悬于430 µL 去离子水中并剧烈涡旋 2 分钟。通过 0.1 µm 膜滤器
  2. 取 95 µ升滤液并加入5 µL 内标物，浓度为 200 µ阳离子的 M（L-甲硫氨酸砜）和 400 µM 的阴离子（2,2,4,4-D4-柠檬酸）并剧烈涡旋。在 4,000 x g 在4 ˚在进行CESI-MS分析前，于C条件下孵育10分钟。
  3. 以2 psi的压力，分别水力进样30秒（阳离子）和40秒（阴离子）。
  4. 使用10%乙酸，以30 kV分离电压在正向（阳离子）和反向（阴离子）模式下分离代谢物。反向分离模式下，分离毛细管施加0.5 psi的正向压力辅助分离。
  5. 将质谱仪设置为在质量范围65-1000内采集正离子（阳离子）或负离子（阴离子）模式的数据 m/z 样品之间，依次用 0.1 M HCl、0.1 M NaOH、去离子水和 BGE 在 50 psi 压力下冲洗毛细管 2 分钟。

结果

所描述的方法是首次利用同一个人体血浆样本对纳米材料生物分子冠中的蛋白质和代谢物同时进行表征。该方法能够检测 >200 种蛋白质和 >150 种代谢物，从而能够确定生物分子冠全貌的最全面概述，有助于深入理解纳米材料的细胞附着、摄取及其影响。

采用CESI-MS进行蛋白质组学（图1）和代谢组学（图2）的分离与检测，两种毛细管在各自方法中均表现出良好的分离窗口。

该方法能够区分不同成分的纳米材料（NMs）蛋白冠中的蛋白质，从而证明了该方法适用于具有广泛物理和化学特性的纳米材料表1).

利用该方法的代谢组学分支，还可以区分代谢物冠层的独特指纹特征（图3）。尽管该方法采用被动方式来表征纳米材料代谢物冠层，但仍能够揭示代谢物在生物分子冠层中作用的有趣发现，例如异构体的差异性吸附（图4）。

色谱图、相对丰度随时间变化的曲线图、峰分析、化学分离。
图1：经颗粒内酶解后，采用CESI-MS分离SiO2蛋白冠的典型电泳图谱。 请点击此处查看该图的放大版本。

色谱结果，强度与迁移时间关系图，用于组分分析的峰鉴定。
图2：通过毛细管电泳-质谱法（CE-MS）检测血浆中内源性化合物得到的提取离子电泳图示例。 编号化合物如下：1. 鸟氨酸；2. 赖氨酸；3. 精氨酸；4. 组氨酸；5. 肌酸；6. 甘氨酸；7. 丙氨酸；8. 缬氨酸；9. 异亮氨酸；10. 亮氨酸；11. 丝氨酸；12. 苏氨酸；13. 天冬酰胺；14. 甲硫氨酸；15. 谷氨酰胺；16. 谷氨酸；17. 苯基-D5-丙氨酸；18. 苯丙氨酸；19. 酪氨酸；20. 脯氨酸；21. 甲硫氨酸砜（内标）。在开放获取的 Creative Commons CC BY 许可下发布，转载自 Zhang 等17。 请点击此处查看此图的放大版本。

表1：六种纳米材料表面蛋白冠的分析。 在二氧化硅（SiO2）、二氧化钛（TiO2）、聚乙烯吡咯烷酮包覆的二氧化钛（TiO2-PVP）、Dispex包覆的二氧化钛（TiO2-Dispex）、聚苯乙烯及羧基化聚苯乙烯纳米材料表面鉴定出的蛋白质类别的热图。百分比表示基于每种蛋白质前三种肽段丰度计算得出的蛋白质丰度占总蛋白质含量的相对比例。由于在不同纳米材料蛋白冠中观察到蛋白质相对丰度存在差异，显然本方案具有足够的灵敏度以区分不同纳米材料的蛋白冠组成。该图改编自一项采用CESI-MS技术对蛋白冠进行分析的研究，原图依据开放获取的Creative Commons CC BY许可协议发布11。 请点击此处下载该表格。

二氧化硅、TiO2-un、TiO2-Dispex、TiO2-PVP 中的氨基酸浓度箱线图；比较分析。
图3：纳米材料蛋白冠中阳离子代谢物的靶向分析。 阳离子在SiO2和TiO2纳米材料上的吸附。红色表示代谢物的初始浓度，而蓝色表示在37 °C下与纳米材料孵育1小时后的代谢物浓度。溶液中代谢物浓度的降低是由于代谢物吸附到纳米材料表面所致。在聚苯乙烯纳米材料中未观察到代谢物的显著吸附。箱线图表示最小值和最大值、中位数以及四分位间距。该图改编自一项采用CESI-MS对代谢物蛋白冠进行靶向分析的研究，已根据开放获取的Creative Commons CC BY许可协议发布15。 请点击此处查看此图的放大版本。

二氧化钛（TiO₂）与不同稳定剂（无、PVP、Dispex）的浓度对比图：数据分析结果
图4：针对NM冠状物中阴离子代谢物的靶向分析，重点关注异构体吸附。 阴离子吸附到多种二氧化钛纳米材料（titania NMs）上表现出明显的差异，例如在糖磷酸盐的不同异构体之间。红色表示代谢物的初始浓度，而蓝色表示在37 °C下与纳米材料共同孵育1小时后的代谢物浓度。溶液中代谢物浓度的降低是由于代谢物吸附至纳米材料表面所致。对于SiO₂，未观察到代谢物的显著吸附。2 以及聚苯乙烯纳米材料。箱线图显示最小值和最大值、中位数及四分位距。该图改编自一项基于CESI-MS对代谢物冠层进行靶向分析的研究，已根据开放获取的Creative Common CC BY许可协议转载15. 请点击此处以查看此图的放大版本。

分析物峰面积平均相对标准偏差迁移时间平均相对标准偏差
1928 种肽类日内重复性 (n=3)15%0.30%
27 种阳离子日内重复性 (n=16)5.80%2.20%
27 种阳离子日间重复性 (n=36)8.60%1.80%

表2：肽段和阳离子代谢物的CESI-MS技术重复实验的重现性。 RSD：相对标准偏差，用于衡量重现性。CESI-MS在峰面积和迁移时间方面的重现性良好，所有分析物的平均RSD均较低 <15% 和迁移时间 <2.2%。这些结果表明，采用该技术所收集的数据具有高度可信性，并证实所检测到的差异源于样品组成的真实差异（在纳米材料上的富集），而非分析过程中的变异。表2由先前展示的结果生成11,15.

讨论

这是首个利用CESI-MS从同一样品中表征完整生物分子冠（包含蛋白质和代谢物）的方法。能够从同一样品中同时分析蛋白质和代谢物，将显著增加单次实验暴露所获取的数据量，从而为冠层形成过程及其对纳米材料作为纳米药物的毒性和疗效的影响提供新的见解。此外，CESI-MS是一个理想平台，仅需更换毛细管即可实现对这两类生物分子的表征。未来，针对非水相毛细管电泳开发的新方法将使脂质组学可通过CE-MS40实现，因此现在已有可能利用单一平台分析蛋白质、代谢物和脂质。而目前的传统方法则需要两个专用的LC-MS平台，一个用于蛋白质冠，另一个用于代谢物冠。因此，该方法可在单一分析平台上获取两倍于传统方法的数据量。

该方法存在一些注意事项，特别是对于代谢物冠层，因为本方案提出的是对冠层进行间接测量。因此，当代谢物浓度相对于纳米材料（NMs）较高，而基质中代谢物浓度的后续下降幅度较小时，可能会出现问题。然而，与蛋白冠层不同，由于每种纳米材料具有独特的表面化学性质，因此不太可能开发出一种适用于所有情况的“通用”代谢物冠层分离方法。未来更有可能针对特定纳米材料开发并验证其专属的代谢物冠层分离方法，但这些方法仅适用于相应的特定纳米材料。尽管如此，CESI-MS 仍将是表征极性带电代谢物的非常合适的平台，无论这些代谢物以何种方式被分离。值得注意的是，如果在旨在沉淀纳米材料的离心步骤中未形成沉淀，可能需要更高的离心力；这种情况最可能发生在密度较低的纳米材料中。此外，必须严格遵守方案中的所有过滤步骤，因为毛细管内径较窄，若样品中的颗粒物未被充分去除，则极易发生堵塞。

尽管蛋白冠（protein corona）已作为研究热点多年，但将其与代谢物冠（metabolite corona）相结合的研究尚属新兴领域，正引起探索生物-纳米界面科学家的广泛关注6,14。迄今为止，大多数相关研究集中于代谢物冠中非极性的脂质组分9,28。本方法则实现了对冠层中高度极性及带电代谢物的表征，其中包括参与能量代谢、糖酵解和DNA合成的重要代谢物。因此，结合蛋白质组学工作流程，可实现对生物分子冠更全面的表征，从而推动对生物-纳米相互作用的深入分析。该方法有助于增强对受体介导的内吞作用机制的理解，揭示蛋白质和代谢物与细胞膜受体相互作用的细节。此外，还可进一步探索冠层内部及冠层之间蛋白质与小分子的相互作用；例如，近期研究已表明，冠层中的蛋白质在代谢物的招募过程中发挥关键作用15。值得注意的是，图3和图4中的代表性结果为代谢物的绝对定量，然而，采用多变量数据分析的非靶向方法，比较对照组与暴露后血浆中所有毛细管电泳-质谱（CE-MS）特征，同样可揭示代谢物的结合情况。因此，深入探究哪些代谢物和蛋白质以及它们如何相互影响进入纳米材料冠层，具有广阔的研究空间。这些进一步的研究可能有助于设计优化的冠层结构，以提升纳米药物的递送效率，或揭示其发展过程中存在的其他障碍，例如因生物分子冠阻断或屏蔽靶向功能而导致药理作用被抑制的问题。

CESI-MS 的流速约为 20 nL/min，属于纳升级别，且有机溶剂使用量极低，在溶剂消耗方面相较于标准 LC-MS 和 nanoLC-MS 具有更优的绿色环保和经济性，而这正是代谢组学和蛋白质组学研究各自面临的主要挑战。CESI-MS 在迁移时间和峰面积方面均能提供高度可重复的结果，与基于 LC-MS 的方法相比具有明显优势11,15。此外，与 nanoLC-MS 相比，CESI-MS 不存在样品残留（carry-over）问题，因此在样品分析之间无需进行系统性的彻底清洗，从而显著提高了样品通量11。

综上所述，本研究所提出的实验流程首次详细阐述了一种同时表征纳米材料完整生物分子冠中蛋白质和代谢物组分的方法。该方法揭示了生物-纳米相互作用的一个新层面——代谢物冠，从而能够从同一样本中获取两倍于以往的数据，有助于更全面地理解生物-纳米界面的相互作用。

披露

J.A.T 是参与 ACEnano 项目的企业合作伙伴AB Sciex UK Ltd的员工，J.A.T 和所有其他作者在本研究中均无利益冲突。

致谢

A.J.C、J.A.T 和 I.L 感谢欧洲委员会通过“地平线2020”计划 ACEnano 项目（项目编号：H2020-NMBP-2016-720952）提供的资助。W.Z 感谢中国国家留学基金管理委员会（CSC，编号：201507060011）提供的博士生奖学金资助。R.R 感谢荷兰科学研究组织（NWO）Vidi 项目（NWO Vidi 723.0160330）提供的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二硫苏糖醇Sigma10197777001
2,2,4,4-D4-柠檬酸Sigma485438-1G阴离子内标
乙酸铵 >98%SigmaA1542
碳酸氢铵 >99.5%Sigma09830
毛细管卡盒冷却液Sciex359976
CESI 8000 仪器SciexA98089
CESI 帽SciexB24699
CESI 小瓶SciexB11648
氯仿Sigma650498有毒，需在通风橱中使用
冰乙酸SigmaA6283
1 mol/L 盐酸Sigma43617
碘乙酰胺SigmaI1149
L-蛋氨酸砜SigmaM0876-1G阳离子内标
甲醇（LC-MS 超纯 Chromasolve）Sigma14262需在通风橱中使用
微量小瓶Sciex144709
纳米小瓶Sciex5043467
中性表面卡盒 30 µM 内径 × 90 cm 总长度SciexB07368
适用于 Sciex Nanospray III 源的 OptiMS 适配器SciexB07363Thermo 质谱仪使用 B07366 和 B83386，Waters 质谱仪使用 B85397，Bruker 质谱仪使用 B86099
OptiMS 熔融石英卡盒 30 µm 内径 × 90 cm 总长度SciexB07367
10× 磷酸盐缓冲液SigmaP7059
Pierce C18 小柱，100 µL 填料体积Thermo Fisher Scientific87784
聚苯乙烯 100 nmPolysciences Inc876
羧基化聚苯乙烯 100 nmPolysciences Inc16688
羧基化聚苯乙烯 1000 nmPolysciences Inc08226
Rapigest SF（表面活性剂）Waters186001860
测序级修饰胰蛋白酶PromegaV5111
SiO2 Ludox TM-40Sigma420786
氢氧化钠溶液Sigma72079
TiO2 Dispex 包覆颗粒Promethion particlesBespoke particles
TiO2 PVP 包覆颗粒Promethion particlesBespoke particles
TiO2 未包覆颗粒Promethion particlesBespoke particles

参考文献

  1. Ke, P. C., Lin, S., Parak, W. J., Davis, T. P., Caruso, F. A Decade of the Protein Corona. ACS Nano. 11 (12), 11773-11776 (2017).
  2. Sasidharan, A., Riviere, J. E., Monteiro-Riviere, N. A. Gold and silver nanoparticle interactions with human proteins: impact and implications in biocorona formation. Journal of Materials Chemistry B. 3 (10), 2075-2082 (2015).
  3. Albanese, A., et al. Secreted biomolecules alter the biological identity and cellular interactions of nanoparticles. ACS Nano. 8 (6), 5515-5526 (2014).
  4. Lynch, I., Dawson, K. A. Protein-nanoparticle interactions. Nano Today. 3 (1-2), 40-47 (2008).
  5. Tenzer, S., et al. Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nature Nanotechnology. 8 (10), 772-781 (2013).
  6. Chetwynd, A. J., Lynch, I. The rise of the nanomaterial metabolite corona, and emergence of the complete corona. Environmental Science: Nano. 7 (4), 1041-1060 (2020).
  7. Lee, J. Y., et al. Analysis of lipid adsorption on nanoparticles by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 1-10 (2018).
  8. Pink, M., Verma, N., Kersch, C., Schmitz-Spanke, S. Identification and characterization of small organic compounds within the corona formed around engineered nanoparticles. Environmental Science: Nano. 5 (6), 1420-1427 (2018).
  9. Chetwynd, A. J., Wheeler, K. E., Lynch, I. Best practice in reporting corona studies: Minimum information about Nanomaterial Biocorona Experiments (MINBE). Nano Today. 28, 100758(2019).
  10. Zhang, H., et al. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size. Proteomics. 11 (23), 4569-4577 (2011).
  11. Faserl, K., Chetwynd, A. J., Lynch, I., Thorn, J. A., Lindner, H. H. Corona isolation method matters: Capillary electrophoresis mass spectrometry based comparison of protein corona compositions following on-particle versus in-solution or in-gel digestion. Nanomaterials. 9 (6), 898(2019).
  12. Nasser, F., Lynch, I. Secreted protein eco-corona mediates uptake and impacts of polystyrene nanoparticles on Daphnia magna. Journal of Proteomics. 137, 45-51 (2016).
  13. Hellstrand, E., et al. Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS Journal. 276 (12), 3372-3381 (2009).
  14. Grintzalis, K., Lawson, T. N., Nasser, F., Lynch, I., Viant, M. R. Metabolomic method to detect a metabolite corona on amino functionalised polystyrene nanoparticles. Nanotoxicology. , 1-12 (2019).
  15. Chetwynd, A. J., Zhang, W., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R. The nanomaterial metabolite corona determined using a quantitative metabolomics approach: A pilot study. Small. , (2020).
  16. Chetwynd, A. J., Guggenheim, E. J., Briffa, S. M., Thorn, J. A., Lynch, I., Valsami-Jones, E. Current application of capillary electrophoresis in nanomaterial characterisation and its potential to characterise the protein and small molecule corona. Nanomaterials. 8 (2), 99(2018).
  17. Zhang, W., et al. Assessing the suitability of capillary electrophoresis-mass spectrometry for biomarker discovery in plasma-based metabolomics. Electrophoresis. , 00126(2019).
  18. Ramautar, R., Somsen, G. W., de Jong, G. J. CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016-2018. Electrophoresis. 40 (1), 165-179 (2019).
  19. Sarg, B., Faserl, K., Lindner, H. H. Identification of novel site-specific alterations in the modification level of myelin basic protein isolated from mouse brain at different ages using capillary electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 17 (19), 1700269(2017).
  20. Faserl, K., Sarg, B., Maurer, V., Lindner, H. H. Exploiting charge differences for the analysis of challenging post-translational modifications by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1498, 215-223 (2017).
  21. Zhang, Z., Qu, Y., Dovichi, N. J. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for bottom-up proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 108, 23-37 (2018).
  22. Shen, X., et al. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for top-down proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 120, 115644(2019).
  23. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (2), 885-892 (2012).
  24. Faserl, K., Kremser, L., Müller, M., Teis, D., Lindner, H. H. Quantitative proteomics using ultralow flow capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (9), 4633-4640 (2015).
  25. Faserl, K., Sarg, B., Kremser, L., Lindner, H. Optimization and evaluation of a sheathless capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry platform for peptide analysis: comparison to liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (19), 7297-7305 (2011).
  26. Segers, K., et al. CE-MS metabolic profiling of volume-restricted plasma samples from an acute mouse model for epileptic seizures to discover potentially involved metabolomic features. Talanta. 217, 121107(2020).
  27. Chetwynd, A. J., David, A. A review of nanoscale LC-ESI for metabolomics and its potential to enhance the metabolome coverage. Talanta. 182, 380-390 (2018).
  28. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-Mass spectrometry at trial by metabo-ring: Effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  29. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
  30. Leong, H. S., et al. On the issue of transparency and reproducibility in nanomedicine. Nature Nanotechnology. 14 (7), 629-635 (2019).
  31. Kaur, I., et al. Dispersion of nanomaterials in aqueous media: Towards protocol optimization. Journal of Visualized Experiments. (130), e56074(2017).
  32. Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle and Fibre Toxicology. 5 (1), 1-14 (2008).
  33. Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment - and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
  34. Lu, P. J., et al. Methodology for sample preparation and size measurement of commercial ZnO nanoparticles. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 628-636 (2018).
  35. Langevin, D., et al. Inter-laboratory comparison of nanoparticle size measurements using dynamic light scattering and differential centrifugal sedimentation. NanoImpact. 10, 97-107 (2018).
  36. Lee, S., Bi, X., Reed, R. B., Ranville, J. F., Herckes, P., Westerhoff, P. Nanoparticle size detection limits by single particle ICP-MS for 40 elements. Environmental Science and Technology. 48 (17), 10291-10300 (2014).
  37. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101(2013).
  38. Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples. Journal of Visualized Experiments. , e54535(2016).
  39. Faserl, K., Sarg, B., Lindner, H. H. Application of CE-MS for the analysis of histones and histone modifications. Methods. , (2020).
  40. Azab, S., Ly, R., Britz-Mckibbin, P. Robust method for high-throughput screening of fatty acids by multisegment injection-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry with Sstringent quality control. Analytical Chemistry. 91 (3), 2329-2336 (2019).
  41. Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles. Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).

重印与许可

标签

CESI MS
用于表征纳米材料蛋白与代谢物冠层的毛细管电泳-质谱联用方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。