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水相中纳米材料的紫外-可见光谱表征

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DOI：

10.3791/61764

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2021年10月25日

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1School of Geography, Earth and Environmental Sciences, University of Birmingham, 2UK Centre for Ecology and Hydrology, 3Natural England, 4Center for Nanosafety Metrology, Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS), 5Department of Materials, University of Oxford, 6Department of Analytical Chemistry, Helmholtz-Centre for Environmental Research, 7Department of Chemical and Product Safety, German Federal Institute for Risk Assessment (BfR)

本文内容

摘要

本研究展示了为测试紫外-可见光谱法（UV-Vis）表征金（Au）胶体分散液的标准操作程序（SOP）而设计的六家实验室间比对（ILC）的基准测试结果，参与比对的六家单位均来自H2020 ACEnano项目，共同完成了样品制备、测量及结果分析工作。

摘要

由于纳米材料（NMs）尺寸微小（至少一个维度处于纳米尺度，即1–100 nm）、性质动态且多样，其理化表征常常面临分析上的挑战。与此同时，为了确保含纳米材料产品的生产安全与质量，可靠且可重复的表征至关重要。目前已有多种方法可用于监测和实现对纳米尺度相关特性的可靠测量，其中一种方法是紫外-可见光谱法（UV-Vis）。该技术成熟、操作简便且成本低廉，可对纳米材料的尺寸、浓度和聚集状态进行非侵入性、快速的实时筛查评估。这些特点使UV-Vis成为评估经验证的标准操作程序（SOP）在表征方法性能与可重复性方面能力的理想方法，尤其适用于熟练度测试方案（PTS）的评估。本文通过实验室间比对（ILC），评估了H2020项目ACEnano中六个合作实验室的PTS实施情况。各参与机构采用UV-Vis对不同尺寸的标准金（Au）胶体悬浮液（尺寸范围5–100 nm）进行表征，旨在建立一套可实施且稳健的纳米材料尺寸表征方案。

引言

由于纳米材料（NMs）在纳米尺度（1至100 nm）下具有与其体相材料不同的独特性质，例如与尺寸相关或量子效应（如单位体积比表面积增加）导致的反应性、光学、热学、电学和磁学性质的显著差异，因而受到广泛关注1,2。纳米材料在社会中的潜在应用广泛，涉及医疗保健、食品工业、化妆品、涂料、涂层和电子等多个领域3,4,5。金纳米颗粒（AuNPs）在纳米技术中应用广泛（如在医疗、化妆品和电子领域），主要得益于其制备简便、尺寸依赖的光学特性、可进行表面功能化的潜力以及适宜多种关键应用的理化性质6,7。

纳米材料（NMs）在合成与表征过程中的质量与可重复性对于质量保证至关重要，同时也关系到基于纳米材料产品的安全制造，尤其是考虑到纳米材料的反应活性，特别是在复杂环境中，纳米材料的性质（如粒径分布和形貌）可能发生快速变化8,9。目前已有多种方法可用于监测与纳米尺度相关的特性。例如，扫描/透射电子显微镜（SEM/TEM）可用于获取纳米材料的高分辨率（可达亚纳米级）光学与成分信息；原子力显微镜（AFM）可在垂直方向（z轴）提供纳米级分辨率；X射线衍射（XRD）则可提供纳米材料的原子结构信息；但这些方法仅适用于干燥样品（粉末）10,11。适用于液体介质中纳米材料表征的技术包括场流分离（FFF），该技术可根据尺寸分离大分子、聚集体和颗粒；动态光散射（DLS）；以及纳米颗粒追踪分析（NTA）——这两种方法均通过布朗运动广泛用于测定颗粒的粒径分布；此外还有紫外-可见分光光度法（UV-Vis），该方法通过简单的吸收测量即可评估纳米材料的粒径、聚集状态和折射率等特性11,12,13。尽管上述所有技术均可用于纳米材料的表征，但其性能依赖于仪器设置、仪器间的差异、复杂的样品制备方法以及操作人员的专业水平。此外，大多数技术无法实现实时监测纳米材料的粒径、样品完整性，或区分分散态与聚集态颗粒6。紫外-可见光谱法是一种广泛应用的技术，可对纳米材料的粒径、浓度和聚集状态进行无创、快速的实时评估。此外，该方法操作简便、成本低廉，且样品前处理极少，因此成为众多学科和领域实验室中广泛使用的关键工具6,12,14。UV-Vis通过测量波长在180至1100 nm范围内的电磁辐射透过液体样品的透射率来工作。紫外和可见光谱范围覆盖了紫外（170 nm至380 nm）、可见（380 nm至780 nm）以及近红外（780 nm至3300 nm）波段4,14。测量穿过样品池的光的波长；进入样品的光强记为I0，从另一侧出射的光强记为I114。比尔-朗伯定律描述了吸光度A与样品浓度C、样品消光系数ε以及两个光强之间的关系14。吸收测量可在单一波长或宽谱范围内进行；测得的光透射率通过比尔-朗伯定律方程转换为吸光度值。吸光度的标准方程为A = ɛlc，其中（A）为样品在给定波长下吸收的光量，（ɛ）为摩尔衰减系数（吸光度/(g/dm3)），（l）为光在溶液中穿过的路径长度（cm），（c）为单位体积内的浓度（g/dm3）。吸光度通过参考样品光强（I0）与待测样品光强（I）的比值计算得出，如以下方程所示14：

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紫外-可见光谱法（UV-Vis）操作简便，是比对既定测量方案中能力验证测试（PTS）的理想技术6,12,15。能力验证测试（ILC 或 PTS）的目的是利用标准操作程序（SOP）验证方法的性能和可重复性15。这进而为其他用户提供了快速表征纳米颗粒悬浮液的标准化方法。

为了评估本文所述方法的熟练程度、一致性和可靠性，共有六家实验室作为“地平线2020 ACEnano项目”（https://cordis.europa.eu/project/id/720952）的成员参与了一项实验室间比对（ILC）。该比对研究涉及对不同粒径（5–100 nm）的标准金胶体分散液进行紫外-可见光谱（UV-Vis）表征。所有参与实验室均收到一份标准操作程序（SOP），以确保金纳米颗粒（AuNP）悬浮液制备、结果评估与报告的一致性，从而推动建立一种可实施且稳健的分级方法，用于纳米材料（NM）的理化表征、数据解读，并改进适用于工业和监管需求的最佳实践方案8。

方案

1. AuNP 样品的递送：

  1. 准备5 mL的金胶体分散液分装样品，粒径分别为5、20、40、60和100 nm，并包括一个浓度为50 µg/mL的“未知粒径”样品（有关所用纳米材料的更详细信息，请参见材料表）。
  2. 将样品置于7 mL聚苯乙烯容器中，并加入冰袋，寄送至各参与实验室，以在运输过程中维持适宜温度。收到后应立即在4 °C下保存。
    注意： “未知粒径”样品的实际粒径应为80 nm；该信息应由分发材料的合作方掌握，但不得告知其他合作方。

2. 分光光度计的校准：

  1. 开启紫外-可见分光光度计至少 20 分钟，使光源灯预热。
    注意：有关所用分光光度计的型号和品牌，请参见材料表。
  2. 在软件中，从显示操作模式的模式窗口中选择选项 光谱扫描。
  3. 在进行测量前，于软件中调整仪器 | 设置与参数中的参数设置：测量模式 | 光谱扫描，数据模式 | 吸光度（ABS），起始波长为 680 nm，终止波长为 380 nm，扫描速度为 400 nm/min，采样间隔为 0.5，狭缝宽度为 1.5，光程长度为 10。
  4. 参数设置完成后，取两支比色皿（3 mL；聚苯乙烯材质），每支加入 1 mL 超纯水（UPW）（18.2 M·Ω·cm）。将比色皿分别放入参比池架（后部）和样品池架（前部），以覆盖光路（比色皿的具体品牌和型号请见材料表）。
    注意：请确保比色皿正确放置并准确定位，以消除与样品无关的噪声及其他环境因素的影响。
  5. 关闭紫外-可见分光光度计的盖子，然后在命令栏中选择空白校正，继续进行空白校准。基线校正通过将两支装有 1 mL 超纯水的比色皿置于样品池架中运行参比测量来完成。其他合作方所采用的替代方案，请参见补充信息（SI）。

3. 样品制备

  1. 分别取5、20、40、60、100 nm及未知尺寸的AuNP样品各500 µL作为子样品，并加入500 µL超纯水（UPW）进行稀释。
  2. 将稀释后的悬浮液置于1 mL比色皿中；总稀释比例应为1:1，最终浓度为25 µg/mL。
    注意：稀释后的样品必须在紫外-可见光谱（UV-Vis）测量前立即配制。

4. 纳米颗粒分散液的测量

  1. 完成空白校准并制备新鲜样品后，将样品池架（前部）中的一个空白比色皿替换为 AuNP 分散液样品；另一个装有 1 mL 超纯水（UPW）的参比比色皿必须保持不变。
    注意：不同样品应使用新的 disposable 比色皿，以避免样品间的交叉污染。若使用石英比色皿，则在更换样品时需用超纯水（UPW）冲洗样品比色皿。
  2. 从命令栏中选择 测量/开始 选项，以对每种稀释后的 AuNP 分散液进行光谱扫描。每种 AuNP 样品（包括未知尺寸样品）应获得三次光谱扫描结果。
    注意：进行测量时，确保空白比色皿仍置于参比池架中。

5. 结果报告

  1. 通过选择文件菜单并点击导出报告 (*.csv) 文件，将每次测量的原始实验数据提取为可兼容电子表格的文件格式。
  2. 记录每次紫外-可见光谱读数的最大吸收波长（Absmax）和最大波长（λmax），并填入提供的模板中。
    注：该预设模板已提供给ACEnano合作伙伴，可通过在工作簿中设置适当的计算公式自动计算波长的平均标准偏差。有关模板的更多详细信息和访问方式，请参见补充信息（SI）。
  3. 在工作簿中，以λmax的平均值（y轴）对已知的纳米颗粒尺寸（nm）（5、20、40、60 和 100 nm）绘制校准曲线。例如，在电子表格中，可通过命令栏选择数据 | 插入图表 | 散点图 | 添加趋势线 | 多项式曲线（幂次为2）来创建校准曲线。
  4. 在校准曲线中包含多项式方程：从命令栏中选择趋势线选项 | 在图表上显示方程（图1）。
  5. 最后，为计算未知AuNP样品的尺寸，利用二次公式推导法，从校准曲线的多项式方程中求解未知λmax的平均值（图1）。计算得到的尺寸可填入模板中，以完成数据的完整汇总，便于结果的一致性、快速解读与评估（见SI）。

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图1：用于计算未知样品尺寸的标准曲线。 该图显示了用于绘制标准曲线的金纳米颗粒（AuNPs）的波长（λmax）与其尺寸之间的关系。图中仅展示来自一个合作方的一条标准曲线。请点击此处查看本图的放大版本。

结果

紫外-可见光谱法（UV-Vis）是纳米材料表征中最常用的技术之一，可让用户精确分析纳米材料的性质，如最大吸光度（Absmax）和最大吸收波长（λmax）6,12。本研究结果通过六个参与实验室之间的国际实验室比对（ILC），展示了金纳米颗粒（AuNP）分散液的紫外-可见光谱表征。

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图2：Lambda与吸光度结果。 图中显示了各实验室针对不同尺寸金纳米颗粒（AuNP）所报告结果的图示。 A) 最大吸收波长结果。 B) 最大吸收值结果。由于样品污染，5号实验室未能报告100 nm的数据。 请点击此处以查看此图的放大版本。

各合作实验室对λmax波长的测定结果显示出良好的重复性（图2A）。计算所得的数值范围（用于评估各测定值之间的差异）也表现出类似趋势，大多数金纳米颗粒（AuNP）尺寸的差异范围较小，介于1.00至2.40（λmax）之间（表1）。通过汇总各实验室每种AuNP尺寸的测定均值所计算出的总体λmax均值，对大多数尺寸而言，其标准偏差也较低。仅有100 nm尺寸为例外，其在不同实验室间的变异范围较大（λmax达4.66），导致标准偏差较高（572 ± 2.00 nm），明显高于其他AuNP尺寸（表1）。需要特别指出的是，由于污染问题可能影响了结果的重复性，实验室5未能对100 nm尺寸的颗粒进行任何测量。

相比之下，吸光度结果（Absmax）的数据值范围较λmax结果更为分散（图2B）。尽管这些结果在不同实验室之间的变异性看似更高，但分析显示其总体均值的标准差更小，且实验室间的变异范围（0.11–0.21 Absmax）出乎意料地低于λmax结果（表1）。

数值AuNP（nm）
5204060100未知
λmax 范围1.451.003.002.004.662.40
Aumax 范围0.120.110.130.130.120.21
λmax 平均值517.7 ± 0.59524.6 ± 0.45527.8 ± 1.13535.3 ± 0.74572 ± 2.00549.7 ± 0.85
Aumax 平均值0.395 ± 0.0480.497 ± 0.0500.509 ± 0.0570.689 ± 0.0550.472 ± 0.0510.661 ± 0.101

表1：计算得到的Lambda和吸光度范围及均值。显示了每种金纳米颗粒（AuNP）尺寸的范围、总体均值及标准差。结果基于各实验室报告的Lambda和吸光度均值计算得出（共六次测量），但100 nm尺寸因第5个实验室报告样本污染，仅使用五次测量结果进行计算。

还计算了Z分数值，以表示各个数值与总体均值之间的偏离程度。Z分数的分析提供了有关ILC结果置信度的信息，因为该分数通过标准差的数量直观地显示了一个数据点距离均值的远近，从而直接关联到总体分布16。结果显示，大多数实验室在λmax上的Z分数值为0.01–1.93，呈正值，表明大多数结果接近均值，并呈现出正态分布曲线；通常认为Z分数绝对值大于2或小于-2的数据点远离均值，不符合正态分布16。在Absmax中，实验室1报告的40 nm粒径样品具有最高的Z分数，为1.93，其Absmax平均值为530 ± 0，而总体均值为527.82 ± 1.13（图3A）。在λmax中，实验室3报告的5 nm AuNP样品Z分数最高，达1.23，其报告的λmax为0.454 ± 0，而总体均值为0.395 ± 0.04。紧随其后的是60 nm AuNP，其Z分数为1.18，λmax均值为0.754 ± 0，而总体平均值为0.689 ± 0.05。其余粒径的Z分数值介于-0.04至-1.23之间（图3B）。

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图3：Lambda 和吸光度 Z 值。 Z 值根据各实验室报告的结果与总体均值进行计算。A) 计算得到的 Lambda 最大值 Z 值。B) 计算得到的吸光度最大值 Z 值。请点击此处查看该图的放大版本。

未知样品的检测结果显示，大多数参与实验室计算出的粒径为 76–80 nm。实验室 1-4 和 6 的平均值记录为 78.02 ± 1.36 nm。实验室 5 报告的粒径较大，为 109 nm，导致总体平均值和标准差扩大至 83.18 ± 12.70 nm，表明该值为异常值（图 4A）。所有实验室的 Z 值计算结果介于 -0.25 至 -0.56 之间；唯一的例外是实验室 6 报告的未知样品粒径，其 Z 值为最高的正值（2.03），相较于所有测量值而言，可视为远离均值的数据（图 4B）。

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图4：未知样品尺寸与Z值。 A) 各实验室报告的所提供未知样品的尺寸。 B) 针对总体均值83.18 ± 12.70 nm，每个单独结果计算出的Z值。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充信息 (SI)： 请点击此处下载此文件。

讨论

目前有多种方法可用于表征纳米尺度相关性质（例如分析型超速离心（AUC）、扫描电子显微镜/透射电子显微镜（SEM/TEM）以及动态光散射（DLS）10,11）。然而，与紫外-可见光谱（UV-Vis）相比，这些技术在获取纳米材料（NMs）表征的初步结果方面缺乏足够的简便性12,13。紫外-可见光谱仪即使在设备条件一般的实验室中也十分常见，使其成为纳米材料表征中不可替代的工具6。在对纳米材料进行表征时，必须充分考虑所用技术的局限性、优势与不足。在使用紫外-可见光谱仪时，光束穿过样品室产生吸光度值；因此，外界振动、环境光干扰、污染物以及操作人员的操作水平均可能影响测量过程与结果4,12。同样，在绘制校准曲线以确定未知样品尺寸时，必须完整记录构建校准曲线所需的所有测量数据，因为遗漏关键因素可能导致不同测量之间以及不同操作者之间的结果出现偏差。

例如，未知样品总体 Absmax 均值的高变异性可能与不同实验室之间的差异有关，这源于光束强度、位置以及仪器本身之间的相互依赖性17,18。此外，由于污染问题，第5个实验室缺少100 nm粒径的数据，这也可能导致结果之间存在较大差异，因为缺失的数据可能影响了校准曲线以及用于计算未知AuNP悬浮液粒径的拟合多项式方程。显然，不同实验方案和实验室之间的可重复性可能十分复杂，许多因素都可能导致实验活动缺乏一致性，致使研究人员有时无法复现其他实验室的结果，进而导致科学进展放缓、时间和资金以及资源的浪费19。对纳米材料（NMs）理化性质（尤其是粒径）的成功表征，需要所有参与实验室均能简便执行的方法，这一点主要可通过系统性和概念性的重复来实现，例如制定标准操作程序（SOP）、仪器操作培训，以及避免使用标识错误或交叉污染的样品15,19。

同样，胶体悬浮液的质量和稳定性也是需要考虑的重要因素，因为其理化性质的变化可能导致不同的结果。因此，为了确保纳米材料悬浮液在较长时间内的稳定性，应将其避光保存于 4 °C 环境中。在运输过程中，分装的样品也应保持低温，因为长时间处于室温可能导致显著的聚集现象20。此外，为了克服纳米材料表征中的失败问题，合作实验室之间有必要共享原始数据、实验方案和关键研究材料，尤其是在通过实验室间比对（ILC）评估实验能力、一致性和可靠性时尤为重要15。明确并公开这些因素，是任何实验室或设备成功完成纳米材料表征的关键。忽视这些方面可能导致结果缺乏可重复性、准确性，甚至产生误导性或错误的结论15。尽管紫外-可见光谱法（UV-Vis）已被证明是纳米材料表征的金标准，但它也可广泛应用于其他领域，因为它能够对无机和有机化合物中的多种溶液进行宽动态范围的定量测定6,21。

此外，紫外-可见光谱法可轻松与其他工具联用，以测量多种属性，从而提升任何分析的质量22。基于这些特点，紫外-可见光谱法已广泛应用于多个领域，例如在生物制药领域中通过测定高浓度蛋白质溶液的紫外-可见吸收光谱进行分析，在环境监测中实时比较污染物与其相关杂质之间的相似性，以及在工业废水处理厂中作为废水色度测定及相关可接受水平标准的组成部分22,23。随着技术的进步，分光光度法将具备更先进的功能并积累更丰富的应用经验，该技术可测量的应用范围和参数必将进一步拓展22。例如，在现场应用中，在线紫外-可见光谱法是一种有价值的工具，可用于实时监测多种液体中的大量参数，这一特性在各类在线传感器系统中尤为突出22。

本文所述的实验室间比对（ILC）旨在检验在H2020 ACEnano项目中由六个参与实验室共同制定的紫外-可见光谱（UV-Vis）标准操作程序（SOP）。结果分析表明，ILC可为各参与实验室提供有价值的信息，以建立对其内部纳米材料（NM）表征方法的技术信心。采用既定模板进行数据收集，证实了数据的一致性和结果解读的高效性，并为未知金纳米颗粒（AuNP）样品的尺寸估算提供了模型；当校准曲线包含足够多的数据点时，该模型还表现出良好的结果重复性。此外，研究结果验证了UV-Vis在纳米材料表征中的有效性，以及制定最佳实践规程的重要性。这一方法进一步为所实施的程序创造了机会，使其能够通过基于方法选择和数据解释的可重复纳米材料表征规程，为立法框架的建立提供支持，相关规程对认证监管机构和科研管理机构均具有参考价值。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

ACQ 感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT）对其博士研究工作的资助。所有作者均承认获得了欧洲联盟“地平线 2020”计划（H2020）资助协议编号 no 720952，项目 ACEnano（招标号 NMBP-26-2016）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸收超微量比色皿，200 µLHellma105.201-QS
Cary 5000 分光光度计（分光光度计 C）AgilentCary 5000
5 nm 金纳米颗粒BBI solutionsEM.GC5
20 nm 金纳米颗粒BBI solutionsEM.GC20
40 nm 金纳米颗粒BBI solutionsEM.GC40
60 nm 金纳米颗粒BBI solutionsEM.GC60
80 nm 金纳米颗粒BBI solutionsEM.GC80
100 nm 金纳米颗粒BBI solutionsEM.GC100
Agilent / HP 8453（分光光度计 E）
Jenway 6800 分光光度计（分光光度计 A）JenwayUV6800
聚苯乙烯比色皿，1.5 mL，微型，10 mm 光程Sigma759015
聚苯乙烯比色皿，3 mL（10 mm × 10 mm × 45 mm）Sarstedt Inc67.742
半微量石英比色皿，1 mL（1 mm × 10 mm × 45 mm）Agilent6610001
超纯水（UPW）（18.2 MΩcm）。 //
UV-1800 分光光度计（分光光度计 B）ShimadzuUV1800
Varian Cary 50 分光光度计（分光光度计 D）AgilentCary 50

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