本文介绍一种在Nicotiana benthamiana中表达、提取和纯化与GFP融合的重组人IgG的简单方法。该方案可拓展用于利用柱层析技术进行多种蛋白质的纯化与可视化。此外，该方案适用于线下和虚拟的高校教学实验课程，支持基于项目的探究式学习。
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方法文章
在Nicotiana benthamiana中瞬时表达IgG融合蛋白的制备
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
由于抗体在多种传染性、代谢性、自身免疫性、肿瘤性及其他疾病治疗中的高需求，开发高效的重组抗体生产方法变得日益迫切。截至2019年，已有超过70种单克隆抗体获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，且该领域具有指数级增长潜力。尽管前景广阔，但其广泛应用仍受限于制造成本和工艺复杂性。植物表达系统可能提供低成本、安全且易于放大的蛋白质生产 策略。Nicotiana benthamiana等植物不仅能正确折叠并组装复杂的哺乳动物蛋白，还能添加与哺乳动物细胞培养系统相似的关键翻译后修饰。在本研究中，我们利用天然绿色荧光蛋白（GFP）以及一种与人源单克隆抗体融合的耐酸型GFP变体，实现了对来自N. benthamiana植物的瞬时抗体表达及纯化全过程的可视化。根据实验目的，天然GFP融合蛋白可在植物表达阶段提供更便捷的可视化效果，而耐酸型GFP融合蛋白则可在后续加工过程中实现可视化。这一可扩展且操作简便的流程仅需少量小型植株，由单名研究人员在数天内即可完成，获得毫克级高纯度抗体或抗体融合蛋白。该技术可拓展应用于任意类型的抗体纯化过程的可视化，甚至适用于多种其他蛋白，无论是在植物还是其他表达系统中。此外，这些技术可用于虚拟教学指导，并可在教学实验室中由缺乏分子生物学技术经验的本科生操作实施，为开展具有实际应用价值的项目式探究提供基础。
引言
行业报告显示，在美国销售额最高的二十种药物中，有十三种为生物制剂（基于蛋白质的药物），其中九种为抗体。截至2019年，已有超过570种抗体（Ab）治疗药物处于不同的临床研发阶段1,2,3。目前全球抗体药物销售额已超过1000亿美元，单克隆抗体（mAb）治疗药物市场预计到2025年将达到3000亿美元1,4。由于需求旺盛且收入预期持续增长，研究人员一直在致力于开发能够大规模、高质量、低成本生产抗体治疗药物的方法。与传统的哺乳动物细胞系相比，基于植物的表达系统在经济高效地大规模生产抗体治疗药物方面具有多项优势5,6。利用植物生产蛋白类治疗药物（"分子农业"）无需传统哺乳动物细胞培养技术所需的昂贵生物反应器或细胞培养设施7,8。植物不会感染人类病原体，从而最大限度地降低了污染风险9。瞬时表达和转基因植物表达系统均可作为哺乳动物或细菌表达系统的....
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方案
1. 培养N. benthamiana植株
- 将泥炭土育苗块放置于托盘中，倒入先前煮沸且仍保持温热（约40–45 °C）的水，使其充分膨胀。待育苗块完全膨胀后，用镊子将2–3粒 N. benthamiana 种子置于每个育苗块上。
- 向托盘底部倒入约0.5英寸深的水，以浸湿基质。在托盘上标注播种日期。每天用适量肥料溶液浇灌幼苗，肥料（水溶性通用植物营养剂）浓度通常为2.5–2.8 g/L。
- 将托盘放入培养室后，加盖保湿罩。将播种后的育苗块置于培养室中，保持温度23–25 °C，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度60%。
- 一周后，去除多余植株，使每个育苗块仅保留一株幼苗。
- 当植株生长至2–3周龄时，将每个泥炭育苗块移栽至单独的花盆中，花盆内装有水分控制型土壤。 本实验使用的是美乐家（Miracle-Gro）水分控制型盆栽土。
- 每天使用浓度为1 g/L的肥料溶液进行浇灌，切勿使土壤完全干燥。植株在5–6周龄时即可用于农杆菌侵染实验。
2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）浸润前的准备
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结果
本研究展示了一种简便快速的重组蛋白制备方法，并可在下游各步骤中对其进行可视化追踪。利用 N. benthamiana 根据所提供的方案，此处所述的重组蛋白生产可在不到一周的时间内完成。植物表达、提取和纯化的整体工作流程如下所示： 图12周龄幼苗、4周龄植株和6周龄植株的生长阶段如图所示 图1A（1-3）， 分别，而 图1B 显示由于坏死引起的叶片形态变化（图1B-1）或萎黄病（图1B-2）。坏死可能在浸润后第3至5天出现在注射部位。这些变化通常取决于所表达蛋白的特性以及浸润植株的健康状况（将在讨论部分进一步探讨）。同时，黄化现象也可能与所用植株的健康状况有关（将在讨论部分进一步探讨）。该过程的 农杆菌 生长.......
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讨论
本方案可用于在N. benthamiana植物中表达的任何重组抗体（Ab）或重组蛋白的可视化验证，包括那些为柱层析纯化目的需要短暂暴露于酸性环境的蛋白42,43,44。此外，将asGFP与其他蛋白在不同表达系统中进行融合，可作为实验可视化和教学的有力工具。本文所述方案还可根据所需重组蛋白的产量，按比例放大或缩小所用叶片材料的量。本方法利用了先前研究中已鉴定并构建的在酸性条件下仍保持稳定的GFP变体46。已有大量前期研究构建了与目标蛋白融合的免疫球蛋白结构域，通常称为IgG融合蛋白，本方案同样适用于此类蛋白28。通过构建并表达由人源化IgG1与GFP及asGFP融合而成的IgG融合蛋白，我们能够在表达、提取和纯化过程中直观地观察目标蛋白的存在。
如果由经验丰富的研究人员遵循本方案操作，叶.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Maria Pia DiPalma 对视频的编辑工作。同时感谢亚利桑那州立大学教育教学推广与学生服务中心为本文出版费用提供的慷慨资助。本实验方案的研究工作由亚利桑那州立大学生命科学学院支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 mL 注射器 | 任意 | 不适用 | |
| 50 mL 注射器 | 任意 | 不适用 | |
| 琼脂 | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
| 带杯搅拌机 | 任意 | 不适用 | |
| 溴酚蓝 | Bio-Rad | 1610404 | |
| DTT（二硫苏糖醇） | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
| EDTA（乙二胺四乙酸） | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
| 乙醇 | 任意 | 不适用 | |
| 甘油 | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
| 甘氨酸 | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
| HCl（盐酸） | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
| 加热块 | 任何信誉良好的供应商 | 不适用 | |
| Jiffy-7 727 带孔泥炭颗粒 | Hummert International | 14237000 | |
| 卡那霉素 | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
| KCl（氯化钾） | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
| KH2PO4（磷酸二氢钾） | J.t.baker | 3248-05 | |
| KOH（氢氧化钾） | VWR | BDH0262 | |
| 七水合硫酸镁 | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
| MES（2-(N-吗啉)乙磺酸） | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
| Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
| 控湿型盆栽混合土 | Miracle-Gro | 755783 | |
| Na2HPO4（磷酸氢二钠） | J.t.baker | 3827-01 | |
| NaCl（氯化钠） | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
| 本氏烟草种子 | 任何信誉良好的供应商 | 不适用 | |
| PMSF（苯甲基磺酰氟） | G-Biosciences | 786-787 | |
| 聚丙烯柱 | 任意 | 不适用 | |
| Precision Plus Protein 双色蛋白标准品 | Bio-Rad | 1610394 | |
| Protein G 树脂 | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
| 利福平 | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
| SDS（十二烷基硫酸钠） | G-Biosciences | DG093 | |
| 抗坏血酸钠 | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
| 分光光度计 | 任何信誉良好的供应商 | 不适用 | |
| Titan3 0.75 µm 玻璃纤维滤膜 | ThermoScientific | 40725-GM | |
| 带盖泥炭颗粒育苗盘 | 任意 | 不适用 | |
| TRIS 碱 | J.t.baker | 4109-02 | |
| Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
| 胰蛋白胨 | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
| 紫外灯 | 任意 | 不适用 | |
| 水溶性通用植物营养液 | Miracle-Gro | 2000992 | |
| 酵母提取物 | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
参考文献
- Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
- Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
- The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePha....
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重印与许可
