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方法文章

在Nicotiana benthamiana中瞬时表达IgG融合蛋白的制备

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DOI：

10.3791/61774

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2021年1月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种在Nicotiana benthamiana中表达、提取和纯化与GFP融合的重组人IgG的简单方法。该方案可拓展用于利用柱层析技术进行多种蛋白质的纯化与可视化。此外，该方案适用于线下和虚拟的高校教学实验课程，支持基于项目的探究式学习。

摘要

由于抗体在多种传染性、代谢性、自身免疫性、肿瘤性及其他疾病治疗中的高需求，开发高效的重组抗体生产方法变得日益迫切。截至2019年，已有超过70种单克隆抗体获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，且该领域具有指数级增长潜力。尽管前景广阔，但其广泛应用仍受限于制造成本和工艺复杂性。植物表达系统可能提供低成本、安全且易于放大的蛋白质生产 策略。Nicotiana benthamiana等植物不仅能正确折叠并组装复杂的哺乳动物蛋白，还能添加与哺乳动物细胞培养系统相似的关键翻译后修饰。在本研究中，我们利用天然绿色荧光蛋白（GFP）以及一种与人源单克隆抗体融合的耐酸型GFP变体，实现了对来自N. benthamiana植物的瞬时抗体表达及纯化全过程的可视化。根据实验目的，天然GFP融合蛋白可在植物表达阶段提供更便捷的可视化效果，而耐酸型GFP融合蛋白则可在后续加工过程中实现可视化。这一可扩展且操作简便的流程仅需少量小型植株，由单名研究人员在数天内即可完成，获得毫克级高纯度抗体或抗体融合蛋白。该技术可拓展应用于任意类型的抗体纯化过程的可视化，甚至适用于多种其他蛋白，无论是在植物还是其他表达系统中。此外，这些技术可用于虚拟教学指导，并可在教学实验室中由缺乏分子生物学技术经验的本科生操作实施，为开展具有实际应用价值的项目式探究提供基础。

引言

行业报告显示，在美国销售额最高的二十种药物中，有十三种为生物制剂（基于蛋白质的药物），其中九种为抗体。截至2019年，已有超过570种抗体（Ab）治疗药物处于不同的临床研发阶段1,2,3。目前全球抗体药物销售额已超过1000亿美元，单克隆抗体（mAb）治疗药物市场预计到2025年将达到3000亿美元1,4。由于需求旺盛且收入预期持续增长，研究人员一直在致力于开发能够大规模、高质量、低成本生产抗体治疗药物的方法。与传统的哺乳动物细胞系相比，基于植物的表达系统在经济高效地大规模生产抗体治疗药物方面具有多项优势5,6。利用植物生产蛋白类治疗药物（"分子农业"）无需传统哺乳动物细胞培养技术所需的昂贵生物反应器或细胞培养设施7,8。植物不会感染人类病原体，从而最大限度地降低了污染风险9。瞬时表达和转基因植物表达系统均可作为哺乳动物或细菌表达系统的低成本替代方案10。尽管转基因植物更适合农作物生产，但利用该方法生产重组蛋白通常需要数周至数月时间。近年来，通过注射或真空农杆菌浸润法使用病毒载体进行瞬时表达的技术取得进展，可分别在数天内实现目标蛋白的小规模和大规模生产11,12,13,14。利用瞬时表达技术在N. benthamiana植物中已快速高效地生产并纯化了针对埃博拉病毒、登革热病毒、寨卡病毒以及其他多种重组蛋白的单克隆抗体15,16,17,18,19。这些优势使得基于植物的瞬时表达成为开发多种抗体治疗药物的极具吸引力的选择，本实验方案所展示的方法即为此类应用提供了有效途径20。

第一代单克隆抗体（mAbs）来源于小鼠，用于人体试验时会引起非特异性的免疫原性21。随着时间推移，人们开发出嵌合型、人源化乃至完全人源的抗体，以降低抗体治疗药物所诱导的免疫原性。然而，由于糖基化模式的差异，部分此类抗体仍可引发宿主的免疫反应21。植物基因工程的发展使得对抗体糖链进行修饰成为可能，这一点至关重要，因为抗体的稳定性与功能会显著受到其糖基化状态的影响22。技术进步已实现在植物系统中高效表达人源化单克隆抗体，并使其携带人类典型的糖链结构，从而具备大规模生产的人用药物所期望的生物学特性19,21。

除了重组抗体外，近年来抗体融合分子（Ab fusions）也被广泛探索用于多种用途。Ab fusions 通常由一个抗体或抗体片段与某种分子或蛋白质融合而成，旨在激活免疫效应细胞的应答23。这类分子已被开发为潜在的治疗手段，用于干预癌症和自身免疫性疾病等多种病理状态24,25,26,27。重组免疫复合物（recombinant immune complexes, RICs）是另一类被用作疫苗候选物的 Ab fusions28。RICs 利用免疫系统识别 Ab fusions 中 Fc 区域的能力，研究发现其与其他疫苗平台联合使用时可增强免疫原性29,30,31。 

绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种来源于维多利亚多管发光水母（Aequorea Victoria）的生物发光蛋白，在受到紫外光激发时会发出绿色荧光32,33。多年来，GFP 作为基因表达的可视化标记物，其应用已从大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达扩展到多种蛋白质表达系统，包括本氏烟草（N. benthamiana）植物34,35,36,37,38。GFP 等可视化标记物在科学概念的教学中具有广泛意义。许多初学者表示，当所教授的概念无法用肉眼直接观察时，例如分子生物学及相关领域的知识，他们难以理解这些内容39。因此，GFP 等可视化标记有助于学生处理与科学过程相关的信息，并可能减轻他们在学习众多科学概念时遇到的困难。

尽管GFP常被用作指示基因及其表达的标记物 体内在酸性条件下，下游过程中很难观察到 GFP，这主要是因为 GFP 在低 pH 值下无法维持其结构及相应的荧光特性40在各种纯化过程中，通常需要临时的酸性环境，例如在蛋白G、蛋白A和蛋白L色谱中，这些方法常用于抗体的纯化。41,42,43,44GFP突变体已被用于在酸性条件下保持荧光45,46.

本文介绍一种在N. benthamiana植物中表达、提取和纯化重组IgG融合蛋白的简单方法。我们构建了传统绿色荧光蛋白（GFP）与人源化IgG重链N端融合的蛋白，形成GFP-IgG融合蛋白。同时，我们还将一种密码子优化的、酸稳定的绿色荧光蛋白（asGFP）的植物序列与人源化IgG重链的N端融合，构建出asGFP-IgG融合蛋白。生产GFP-IgG的优势在于可在表达过程中直观监测目标蛋白的存在；而asGFP-IgG则不仅能在表达和提取阶段，还能在蛋白纯化过程中实时观察重组蛋白的存在。本方案可适用于在N. benthamiana中表达并通过需要低pH条件的层析技术进行纯化的多种GFP融合蛋白的生产、纯化与可视化。该流程还可根据所用叶片材料的量进行灵活调整。尽管带有GFP或asGFP标签的抗体及融合蛋白不用于治疗用途，但这些方法在实验中可作为有效的对照，并可进一步作为分子生物学、细胞生物学及生物技术领域线上线下教学的实用工具。

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方案

1. 培养N. benthamiana植株

  1. 将泥炭土育苗块放置于托盘中，倒入先前煮沸且仍保持温热（约40–45 °C）的水，使其充分膨胀。待育苗块完全膨胀后，用镊子将2–3粒 N. benthamiana 种子置于每个育苗块上。
  2. 向托盘底部倒入约0.5英寸深的水，以浸湿基质。在托盘上标注播种日期。每天用适量肥料溶液浇灌幼苗，肥料（水溶性通用植物营养剂）浓度通常为2.5–2.8 g/L。
  3. 将托盘放入培养室后，加盖保湿罩。将播种后的育苗块置于培养室中，保持温度23–25 °C，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度60%。
  4. 一周后，去除多余植株，使每个育苗块仅保留一株幼苗。
  5. 当植株生长至2–3周龄时，将每个泥炭育苗块移栽至单独的花盆中，花盆内装有水分控制型土壤。 本实验使用的是美乐家（Miracle-Gro）水分控制型盆栽土。
  6. 每天使用浓度为1 g/L的肥料溶液进行浇灌，切勿使土壤完全干燥。植株在5–6周龄时即可用于农杆菌侵染实验。

2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）浸润前的准备

注意：GFP-IgG 融合构建体可按照本文所述方法获得31。asGFP 基因来源于本研究45，并已针对植物系统进行了优化。以下步骤必须在本生灯旁进行，并应采用基本的无菌操作技术以避免污染。

  1. 划线 A. tumefaciens 含有豆类黄矮病毒（BeYDV）的EHA10519 每种构建体的植物表达载体（asGFP-IgG、GFP-IgG、轻链）从甘油中提取 LB 琼脂平板培养基（10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L 酵母提取物，15 g/L 琼脂，50 µg/mL 卡那霉素）上划线接种保存菌种。 
  2. 在30 °C静置培养箱中培养一天。挑取单菌落，采用标准菌落PCR筛选方法进行验证。 
  3. 为每个构建体使用经验证的菌落。向锥形管中加入10 mL LB培养基（10 g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物，50 µg/mL）。随后加入10 µL浓度为100 µg/mL的卡那霉素。加入10 µL浓度为2.5 µg/mL的利福平以防止 E. coli 污染。在30°C、120-150 rpm条件下振荡培养过夜。
  4. 第二天，如果 农杆菌 培养至 OD600 = 0.6–0.9 时，可用于浸润。若菌液过浓（OD600 > 1)，应将1-2 mL转移至含抗生素的新鲜LB培养基中，并培养至所需的OD值600. 根据初始培养物的浓度，可能需要两天时间才能生长至OD600 = 0.6-0.9.
  5. 达到合适的OD值后600将培养物置于离心机中，在4,500 × g、室温（RT）条件下离心20分钟，沉淀细菌。
  6. 弃去两个样品的上清液，然后将每份沉淀重悬于1×浸润缓冲液（10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸，10 mM 硫酸镁，用KOH调节至pH 5.5）中，以获得最终OD600 = 0.4。根据初始培养密度，此过程大约需要 15–45 mL 浸润缓冲液。将每种 IgG 融合构建体与轻链构建体等体积混合，以获得最终 OD600 每管中每种构建体为 0.2。

3. 无针注射器农杆菌渗入法

  1. 取一个拉直的回形针和步骤1中准备的5-6周龄的N. benthamiana植株。使用回形针的尖端，在叶片近轴面的表皮层上轻轻刺一个小孔，注意不要完全穿透叶片。 
    注意：下部叶片更容易进行渗透，而植株顶部的叶片则较难操作。通常，重组蛋白的表达量在植株中部叶片中最高，且这些叶片的坏死程度也较低。
  2. 取1 mL无针头的注射器，吸入步骤2中制备好的Agrobacterium菌液。将注射器前端覆盖在上一步制造的小孔处，同时用手指在叶片背面施加轻微反向压力，缓慢推动注射器，将菌液注入叶片内。观察叶片在注入过程中逐渐变暗，注意避免对注射器施加过大压力。
  3. 尽量在每片叶片上最多进行3-4次渗透操作，过度损伤叶片可能影响蛋白产量。 渗透完成的叶片从背面观察会呈现大部分深色区域。
    注意：每种构建物的菌液量应足以处理至少3-4株植物。废弃的剩余菌液须经高压灭菌处理后再丢弃。

4. 培养并观察农杆菌渗入的N. benthamiana

  1. 将侵染后的植株放回生长室，并继续每天浇水。
  2. 观察叶片侵染区域是否出现黄化和坏死现象。若存在GFP，使用长波和短波紫外灯观察植株的GFP荧光。
  3. 第4至5天叶片中两种GFP表达载体的荧光最强。在侵染后第4至5天（dpi）收获全部叶片，并称量总叶重。 
  4. 立即用于后续实验，或于-80 °C保存至需要时使用。

5. 蛋白质提取

  1. 使用前将缓冲液和匀浆杯置于冰上或 4 °C 保存。
  2. 每 1 g 植物材料准备 2–3 mL 冰冷的提取缓冲液（100 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，2 mM EDTA，用 HCl 调至 pH 8）。在提取前立即向提取缓冲液中加入苯甲基磺酰氟（PMSF）至终浓度 2 mM（来自 100 mM 储存液）和 50 mM 抗坏血酸钠。
  3. 将第 4 步得到的植物组织放入预冷的匀浆杯中。按第 5.2 步指示量加入预冷的提取缓冲液至匀浆杯中。将匀浆杯安装到匀浆器上。取一张预先裁剪好的封口膜，拉伸后覆盖在匀浆杯口。以 20 秒为间隔进行匀浆，每次匀浆后根据需要充分搅拌。
  4. 将匀浆后的样品转移至烧杯中，加入搅拌子，在 4 °C 下搅拌 30 分钟，以提高蛋白溶解度并促进固体沉淀。
  5. 在冰上的洁净烧杯口覆盖两层 Miracloth 滤布，将提取液过滤以去除大块叶片残渣。待全部提取液过滤完毕后，折叠 Miracloth 滤布以挤出残留的叶提取液。 提取液应呈深绿色，无可见颗粒物。
  6. 取 50 µL 该样品转移至新的 1.5 mL 离心管中，标记为"总提取液"，用于后续分析。将剩余提取液转移至离心管中，在 16,000 x g 条件下于 4 °C 离心 20 分钟，将上清液转移至锥形管中。
  7. 使用 50 mL 注射器和玻璃纤维滤膜（0.75 µm）过滤可溶性提取液。
  8. 离心后取 50 µL 样品，标记为"可溶性提取液"，用于后续分析。

6. Protein G 柱层析操作步骤

注意：此处所述方案适用于使用 Pierce Protein G 琼脂糖树脂的重力流层析。若使用其他树脂，请参考生产商提供的说明进行相应调整。切勿让树脂变干，防止所有液体完全排出。必要时重新盖上出口端。

  1. 设置一个可容纳 20 mL 样品的聚丙烯柱。 
  2. 根据目标免疫球蛋白类型及其对树脂的亲和力，估算所需浆液的量。通常情况下，总浆液量为 3 mL（其中床体积为 1.5 mL）足以纯化数毫克的抗体（Ab）。
  3. 将所需量的重悬浆液小心倒入带盖的柱中。打开柱底部的出口，使其自然流干，直至大部分缓冲液排出。 
  4. 立即在柱顶部加入 10 mL 洗涤缓冲液 1× PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，用 HCl 调节 pH 至 7.4），让其流干，并重复此洗涤步骤两次。 
  5. 将第 5 步过滤后的样品上样至柱中，并收集穿流液——取 50 µL 穿流液用于后续分析。其余穿流液请保存，以防抗体未结合到树脂上。
    注意：将穿流液重新上样至新柱通常无法获得良好的产率；因此建议使用新的叶片材料重新开始。
  6. 用 10 mL 1× PBS 洗涤树脂两次，以减少非特异性结合。如需验证目标抗体是否随洗涤缓冲液被洗脱，可在缓冲液流经柱子时，每次取 50 µL 洗涤液进行分析。 
  7. 准备并标记五个试管，每管中加入 125 µL 无菌的 1 M Tris-HCl（pH 8.0），用于中和酸性洗脱缓冲液中的抗体，避免其发生潜在的结构变化。或者，可加入 30 µL 的 2 M Tris 碱，以获得浓度更高的样品。 
    警告：洗脱过程中可使用紫外光进行可视化观察，但无需在整个洗脱过程中持续使用。若使用紫外光，请务必穿戴适当的个人防护装备，以防对眼睛和皮肤造成损伤。洗脱步骤中并非必须使用紫外光。
  8. 向柱中加入 5 mL 洗脱缓冲液（100 mM 甘氨酸，用 HCl 调节 pH 至 2.5）以洗脱抗体，并将洗脱液按每管 1 mL 分部收集至前述步骤中准备好的各试管中。 
  9. 立即用 20 mL 洗涤缓冲液再生柱子，随后再用 10 mL 洗涤缓冲液冲洗。确保树脂不会长时间处于酸性环境中。洗脱液通常具有荧光性，最强荧光常出现在第二次洗脱组分中，但不同提取之间可能存在差异。
  10. 储存时，用含 20% 乙醇的 PBS 溶液洗涤树脂 10 mL，并让其流至柱内液面降至一半。盖紧柱子顶部和底部，直立保存于 4 °C。 
    注意：通常情况下，蛋白 G 树脂可重复使用多达 10 次而不会显著降低效率。具体细节请参考生产商的使用说明。
  11. 使用分光光度计在 280 nm 处测定吸光度，以洗脱缓冲液作为空白对照，确定抗体浓度。将洗脱液储存于 -80 °C，并将每份组分各取 50 µL 分装至独立试管中，用于后续分析。 

7. 用于检测GFP-Ig融合蛋白的SDS-PAGE

  1. 在设置 SDS-PAGE 之前，先准备好所有样品。
    1. 向每份样品（总提取物、可溶性提取物、穿流组分、洗涤组分、所有洗脱组分）中各取 20 µL，加入 4 µL 样品缓冲液（6× 还原性样品缓冲液：3.0 mL 甘油、0.93 g DTT、1 g SDS、7 mL 4× Tris (pH 6.8) 0.5 M、1.2 mg 溴酚蓝；6× 非还原性样品缓冲液：3.0 mL 甘油、1 g SDS、7 mL 4× Tris (pH 6.8) 0.5 M、1.2 mg 溴酚蓝）。确保管盖紧固。
    2. 仅将还原性样品在沸水浴中处理 5 分钟，然后置于冰上 5 分钟。在微量离心机中离心约 5 秒，按收集顺序将每份样品各 20 µL 加样至凝胶孔中。另设一孔加入 3 µL 双色蛋白 Marker。
  2. 以恒定 100 V 电压运行 SDS-PAGE 凝胶，直至蛋白条带达到理想分离效果；约需 1.5 小时。以蛋白 Marker 作为蛋白分离程度的监测指标。
  3. 在紫外光下观察凝胶以检测 GFP 荧光。
  4. 如需评估各样品中的总蛋白含量，可用考马斯亮蓝染色法染色凝胶。或者，可使用特异性抗体进行 Western 印迹分析以检测目标蛋白。 
    注意：考马斯亮蓝染色和 Western 印迹均可按照标准实验方案进行47,48。

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结果

本研究展示了一种简便快速的重组蛋白制备方法，并可在下游各步骤中对其进行可视化追踪。利用 N. benthamiana 根据所提供的方案，此处所述的重组蛋白生产可在不到一周的时间内完成。植物表达、提取和纯化的整体工作流程如下所示： 图12周龄幼苗、4周龄植株和6周龄植株的生长阶段如图所示 图1A（1-3）， 分别，而 图1B 显示由于坏死引起的叶片形态变化（图1B-1）或萎黄病（图1B-2）。坏死可能在浸润后第3至5天出现在注射部位。这些变化通常取决于所表达蛋白的特性以及浸润植株的健康状况（将在讨论部分进一步探讨）。同时，黄化现象也可能与所用植株的健康状况有关（将在讨论部分进一步探讨）。该过程的 农杆菌 生长...

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讨论

本方案可用于在N. benthamiana植物中表达的任何重组抗体（Ab）或重组蛋白的可视化验证，包括那些为柱层析纯化目的需要短暂暴露于酸性环境的蛋白42,43,44。此外，将asGFP与其他蛋白在不同表达系统中进行融合，可作为实验可视化和教学的有力工具。本文所述方案还可根据所需重组蛋白的产量，按比例放大或缩小所用叶片材料的量。本方法利用了先前研究中已鉴定并构建的在酸性条件下仍保持稳定的GFP变体46。已有大量前期研究构建了与目标蛋白融合的免疫球蛋白结构域，通常称为IgG融合蛋白，本方案同样适用于此类蛋白28。通过构建并表达由人源化IgG1与GFP及asGFP融合而成的IgG融合蛋白，我们能够在表达、提取和纯化过程中直观地观察目标蛋白的存在。

如果由经验丰富的研究人员遵循本方案操作，叶...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Maria Pia DiPalma 对视频的编辑工作。同时感谢亚利桑那州立大学教育教学推广与学生服务中心为本文出版费用提供的慷慨资助。本实验方案的研究工作由亚利桑那州立大学生命科学学院支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 mL 注射器任意不适用
50 mL 注射器任意不适用
琼脂SIGMA-ALDRICHA5306
带杯搅拌机任意不适用
溴酚蓝Bio-Rad1610404
DTT（二硫苏糖醇）MP BIOMEDICALS219482101
EDTA（乙二胺四乙酸）SIGMA-ALDRICHE-6760
乙醇任意不适用
甘油G-BiosciencesBTNM-0037
甘氨酸SIGMA-ALDRICHG7126-500G
HCl（盐酸）EMD MILLIPORE CORPORATIONHX0603-4
加热块任何信誉良好的供应商不适用
Jiffy-7 727 带孔泥炭颗粒Hummert International14237000
卡那霉素Gold Biotechnology IncK-120-100
KCl（氯化钾）SIGMA-ALDRICHP9541-500G
KH2PO4（磷酸二氢钾）J.t.baker3248-05
KOH（氢氧化钾）VWRBDH0262
七水合硫酸镁SIGMA-ALDRICHM2773
MES（2-(N-吗啉)乙磺酸）SIGMA-ALDRICHM8250
MiraclothMillipore4 75855-1R
控湿型盆栽混合土Miracle-Gro755783
Na2HPO4（磷酸氢二钠）J.t.baker3827-01
NaCl（氯化钠）Santa Cruz Biotechnologysc-203274C
本氏烟草种子任何信誉良好的供应商不适用
PMSF（苯甲基磺酰氟）G-Biosciences786-787
聚丙烯柱任意不适用
Precision Plus Protein 双色蛋白标准品Bio-Rad1610394
Protein G 树脂Thermo Fisher Scientific20399
利福平Gold Biotechnology IncR-120-25
SDS（十二烷基硫酸钠）G-BiosciencesDG093
抗坏血酸钠SIGMA-ALDRICHA7631-500G
分光光度计任何信誉良好的供应商不适用
Titan3 0.75 µm 玻璃纤维滤膜ThermoScientific40725-GM
带盖泥炭颗粒育苗盘任意不适用
TRIS 碱J.t.baker4109-02
Tris-HClAmrescoM108-1KG
胰蛋白胨SIGMA-ALDRICH17221
紫外灯任意不适用
水溶性通用植物营养液Miracle-Gro2000992
酵母提取物SIGMA-ALDRICH9182

参考文献

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755(2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600(2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472(2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81(2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141(2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41(2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200(2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974(2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

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