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方法文章

从细胞和组织样本中分离与功能评估人乳腺癌干细胞

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DOI：

10.3791/61775

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2020年10月2日

 ,  ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Western University, 3Department of Oncology, Western University, 4Lawson Health Research Institute

本文内容

摘要

本实验方案描述了从乳腺癌细胞和组织样本中分离乳腺癌干细胞（BCSCs）的方法以及相关步骤 体外 和 体内 可用于评估乳腺癌干细胞表型和功能的检测方法。

摘要

乳腺癌干细胞（BCSCs）是一类具有遗传性或获得性干细胞样特性的癌细胞。尽管其数量稀少，但它们在乳腺癌的发生、复发、转移以及治疗耐药中起着关键作用。为了发现治疗乳腺癌的新靶点，深入理解乳腺癌干细胞的生物学特性至关重要。乳腺癌干细胞通常根据其特异性细胞表面标志物（如CD44、CD24）以及醛脱氢酶（ALDH）的酶活性来进行分离与鉴定。这些ALDH高CD44+CD24- 细胞构成了BCSC群体，可通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分离，用于后续功能研究。根据具体的科学问题，可采用不同的 体外 和 体内 可用于评估乳腺癌干细胞（BCSCs）的功能特性。本文提供了从乳腺癌细胞的异质性群体以及乳腺癌患者原发肿瘤组织中分离人源BCSCs的详细实验方案。此外，我们还强调了后续分析 体外 和 体内 包括集落形成实验、乳腺球形成实验、三维培养模型和肿瘤异种移植实验在内的功能检测方法，可用于评估乳腺癌干细胞功能。

引言

了解人类乳腺癌干细胞（BCSCs）的细胞与分子机制，对于应对乳腺癌治疗中所面临的挑战至关重要。BCSC 概念的提出可追溯至21世纪初。st 世纪，其中一小群CD44+CD24-/low 乳腺癌细胞被发现能够在小鼠体内形成异质性肿瘤1,2随后观察到，醛脱氢酶（ALDH）酶活性较高的人类乳腺癌细胞高也表现出类似的干细胞样特性3这些乳腺癌干细胞（BCSCs）代表了一小群具有自我更新和分化能力的细胞，有助于形成肿瘤组织的异质性。1,2,3越来越多的证据表明，进化上保守的信号通路的改变是驱动乳腺癌干细胞存活与维持的关键因素4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14此外，细胞外在微环境已被证明在调控不同乳腺癌干细胞功能方面发挥关键作用15,16,17这些分子通路及调控乳腺癌干细胞功能的外部因素导致乳腺癌复发和转移18 以及对治疗产生耐药性的机制研究19,20,21，治疗后乳腺癌干细胞（BCSCs）的残留存在对乳腺癌患者的总体生存率构成重大挑战22,23因此，对这些因素进行临床前评估对于鉴定靶向乳腺癌干细胞的治疗策略至关重要，有望改善乳腺癌患者的治疗效果和总体生存率。

若干 体外 人乳腺癌细胞系模型及 体内 人源异种移植模型已被用于表征乳腺癌干细胞24,25,26,27,28,29细胞系在每次连续传代后均能持续增殖的特性使其成为开展组学和药物基因组学研究的理想模型系统。然而，细胞系往往难以重现患者样本中所观察到的异质性，因此有必要将细胞系数据与患者来源样本的数据相互补充。以最纯的形式分离乳腺癌干细胞（BCSCs）对于实现对BCSCs的深入表征至关重要。实现高纯度分离的关键在于选择特异于BCSCs的表型标志物。目前，ALDH高CD44+CD24- 细胞表型最常用于通过荧光激活细胞分选（FACS）从大量乳腺癌细胞群体中区分和分离人乳腺癌干细胞（BCSCs），以获得最高纯度1,3,26此外，可通过体外实验评估分离得到的BCSCs的自我更新、增殖和分化等特性。 体内 技术。

例如，体外集落形成实验可用于评估单个细胞在不同处理条件下自我更新形成包含50个或更多细胞的集落的能力30乳腺球形成实验也可用于评估乳腺癌细胞在非贴壁条件下的自我更新潜能。该实验通过在无血清、非黏附性培养条件下连续传代，检测单个细胞形成并生长为球体（包含乳腺癌干细胞与非乳腺癌干细胞的混合群体）的能力。31此外，三维（3D）培养模型可用于评估乳腺癌干细胞（BCSC）功能，包括能够高度模拟体内微环境的细胞间及细胞-基质相互作用 体内 微环境，并允许对潜在的乳腺癌干细胞靶向治疗的活性进行研究32尽管体外模型具有多样的应用，但难以模拟其复杂的体内环境 体内 仅使用体外实验评估BCSC行为的条件。这一挑战可通过使用小鼠异种移植模型来克服 体内特别是，此类模型可作为评估乳腺癌转移的理想体系33，研究疾病进展过程中与微环境的相互作用34, 体内 成像35，以及预测抗肿瘤药物对特定患者的毒性和疗效34.

本方案详细描述了人源ALDH的分离方法高CD44+CD24- 从异质性乳腺癌细胞群体中获得高纯度的乳腺癌干细胞（BCSCs）。我们还详细描述了三种体外技术（集落形成实验、乳腺球形成实验和三维培养模型）以及一个 体内 可用于评估乳腺癌干细胞（BCSCs）不同功能的肿瘤异种移植实验。这些方法适用于有意从人乳腺癌细胞系或患者原代来源的乳腺癌细胞及肿瘤组织中分离和鉴定BCSCs的研究人员，以期深入理解BCSC生物学特性，和/或探索靶向BCSC的新型治疗策略。

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方案

在获得知情同意的乳腺癌患者中，按照经机构伦理委员会批准的人类伦理方案，直接采集患者来源的手术或活检样本。用于建立患者来源的异种移植模型的所有小鼠均饲养在经机构认证的动物实验设施中。使用小鼠建立的患者来源异种移植模型的肿瘤组织，均依照机构动物护理委员会批准的伦理方案进行操作。

1. 细胞系的制备

  1. 在生物安全柜内以无菌条件进行所有细胞培养和染色操作。使用无菌的细胞培养皿/培养瓶及试剂。
  2. 将人乳腺癌细胞在37 °C、5% CO2条件下，置于添加了胎牛血清（FBS）及各细胞系所需特定生长因子的特定培养基中进行培养。
  3. 将小鼠NIH3T3成纤维细胞（用于克隆形成实验）在37 °C、5% CO2条件下，置于添加了10% FBS的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中进行培养。
  4. 对于所有细胞培养物，每2-3天更换一次新鲜培养基。当细胞融合度达到75-80%时，将细胞传代至多个无菌细胞培养瓶中。

2. 乳腺癌肿瘤组织的制备

  1. 根据机构伦理委员会批准的人类伦理方案，从知情同意的乳腺癌患者处直接收集手术或活检样本。
  2. 随后，在机构动物护理委员会批准的动物伦理方案下，使用小鼠收集并获取来自患者来源异种移植模型的肿瘤组织。
  3. 在无菌条件下将所有肿瘤组织收集至含有30 mL DMEM:F12培养基的50 mL无菌锥形管中，置于冰上，并在采集后2小时内按以下所述方法处理样本。

3. 乳腺癌细胞单细胞悬液的制备

  1. 从含有60-80%融合度的乳腺癌细胞单层（所选细胞系）的培养瓶中吸除培养基。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除PBS，加入适量的细胞解离液（例如胰蛋白酶:EDTA；加入量以刚好覆盖细胞单层为宜），在室温（推荐）或37 °C条件下孵育5分钟。
  2. 加入5 mL培养基以中和细胞解离液的活性。
  3. 将解离后的细胞悬液转移至50 mL锥形管中，在1000 × g 条件下离心5分钟。
  4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL 1× PBS中。使用血细胞计数板和显微镜对细胞进行计数。
    注意：在血细胞计数板中观察是否存在细胞聚团现象。若未形成单细胞悬液，需重复细胞解离步骤。
  5. 细胞计数后，将细胞悬液再次在1000 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于ALDH底物缓冲液中，细胞浓度为1 × 106 个细胞/mL。

4. 从组织样本制备单细胞悬液

  1. 使用手术刀采用交叉切割法将肿瘤组织切碎，获得约 1 mm 大小的组织小块。将组织块转移至含有 10 mL 消化缓冲液（含 1X 胶原酶的 DMEM:F12 培养基）的新鲜 50 mL 锥形管中。用封口膜密封锥形管，并在 37 °C 摇床培养箱中孵育 40 分钟。
    注意：若无摇床培养箱，可将管子置于 37 °C 水浴中，每隔 5–10 分钟涡旋混匀一次。
  2. 在 530 × g 条件下离心 5 分钟，使消化后的组织沉淀。弃去上清液，加入 5 mL 胰蛋白酶。使用 1 mL 移液器（设定至 750 µL 刻度）反复吹打，使沉淀充分分散，并在 37 °C 水浴中孵育 5 分钟。孵育结束后，剧烈吹打以释放单细胞。
  3. 用 DMEM:F12 培养基将管内总体积补至 25 mL，在 1000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL dispase-DNase 溶液中，在 37 °C 水浴中孵育 5 分钟。
  4. 用 PBS 将管内总体积补至 10 mL。通过反复吹打混匀，将所得细胞悬液经连接在新鲜 50 mL 锥形管上的 40 µm 细胞滤网过滤。在 1000 × g 条件下离心 5 分钟。
  5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL 1× PBS 中。计数细胞，并按照步骤 3.4 和 3.5 所述完成细胞悬液的制备。

5. 乳腺癌干细胞（BCSCs）的分离

  1. 标记流式管，用于未染色对照、单细胞染色对照（DEAB对照、ALDH、CD44-PE、CD24-PE-Cy7、7AAD）、阴性对照管（使用DEAB、CD44-PE、CD24-PE-Cy7和7AAD染色）、荧光减一（FMO）对照以及“分选”管（使用ALDH、CD44、CD24和7AAD染色）。
  2. 从步骤3.5或步骤4.5中将500 μL（0.5 × 106 个细胞）细胞悬液转移至标记为“仅细胞”、“CD44”、“CD24”和“7AAD”的各管中。将管子置于冰上待用。
  3. 向相应的“ALDH”管中加入2 mL样本（2 × 106 个细胞）。向“DEAB对照”管和“阴性对照”管中各加入5 μL DEAB，并 tightly 封盖。向“ALDH”管中加入10 μL ALDH底物，充分涡旋混匀后，立即取500 μL转移至对应的“DEAB对照”管和“阴性对照”管。重新盖紧“DEAB对照”、“阴性对照”和“ALDH管”，在37 °C孵育30–60分钟（不得超过60分钟）。
    注意：最佳孵育时间可能需根据细胞系进行优化。ALDH底物及含染色细胞的管子应始终避光。
  4. 孵育结束后，将所有样品在250 × g 离心5分钟。用500 μL ALDH底物缓冲液重悬细胞。加入厂家推荐或用户优化浓度的抗CD44-PE和抗CD24-PE-Cy7抗体混合物，在4 °C孵育30分钟。向标记为“CD44”和“CD24”的相应管中加入抗CD44-PE和抗CD24-PE-Cy7抗体。
  5. 孵育结束后，将所有样品在250 × g 离心5分钟。用500 μL ALDH底物缓冲液重悬细胞。将“阴性对照”管、“分选管”和“7AAD”管与7AAD（建议浓度：0.25 µg/1 × 106 个细胞）在冰上孵育10分钟。
    注意：ALDH活性在绿色荧光通道中检测，因此应使用具有不同且兼容发射光谱的荧光染料。在多参数流式细胞术中若观察到光谱重叠，应使用单色对照和FMO对照进行指导，以实现荧光染料间的补偿，最小化荧光信号溢出至其他通道。
  6. 在FACS仪器上设置分析程序，准备进行样本分析。创建散点图（前向散射 vs 侧向散射，前向散射 vs 荧光通道）。
  7. 使用未染色对照，调节光电倍增管以区分碎片与完整细胞群体，并调节荧光电压使完整细胞群位于第一对数刻度附近（101）。使用DEAB对照，通过调节绿色荧光电压通道，使完整细胞群位于第二对数刻度内（102）。
  8. 首先分析所有单染对照样本（ALDH、CD44-PE、CD24-PE-Cy7）以及7AAD和FMO对照，调节电压以区分染色与未染色细胞，并最小化荧光信号向其他通道的溢出。
  9. 对每个单染细胞样本的阳性群体设门。使用阴性对照管，设门筛选活细胞（7AAD阴性）、ALDHlow 和 ALDHhigh 细胞群体（代表性设门策略见图1B）。
  10. 分析感兴趣的多参数染色样本以分离BCSCs。利用活细胞中的ALDHlow 和 ALDHhigh 设门，分别选择CD44+CD24-（BCSC）和CD44-CD24+（非BCSC）细胞群体（图1B）。
  11. 将活的BCSCs和非BCSCs收集至无菌收集管中的收集培养基中（两个代表性细胞系的细胞群体见图2A&B）。将分选后的细胞用于后续的in vitro 和 in vivo 检测，如下所述。
    注意：除下述in vitro 和 in vivo 检测外，还可通过标准免疫印迹技术检测多能性标志物（如SOX2、OCT4和NANOG）的表达来验证BCSCs。

使用流式细胞术分离乳腺癌细胞的过程；检测结果的示意图和散点图。
图1：从乳腺癌细胞系和组织样本中分离乳腺癌干细胞（BCSCs）的FACS设门策略。（A）描述BCSC分离流程的流程图。（B）代表性FACS图显示了从异质性细胞群体中分离活的BCSCs和非BCSCs所用的分选策略。人乳腺癌细胞MDA-MB-231同时用7-AAD、CD44-APC、CD24-PE以及ALDH底物进行标记。使用流式细胞仪上的四色方案分离细胞亚群。首先根据预期的光散射特性选择细胞，然后筛选单细胞，并基于排除7-AAD来确定细胞活力。随后分析细胞的ALDH活性，ALDH信号最强的前20%细胞被定义为ALDHhigh群体，而ALDH活性最低的后20%细胞则被定义为ALDHlow群体。最后，ALDHlow细胞中50%具有CD44low/-CD24+表型的细胞被进一步选出，而ALDHhigh细胞中50%具有CD44+CD24-表型的细胞被选出。本图改编自Chu等17。请点击此处查看此图的放大版本。

流式细胞术分析图；使用ALDH、CD44、CD24标志物区分BCSC和非BCSC。
图2：不同乳腺癌细胞系中BCSC的比例存在差异。代表性图像显示，在按照图1所述方法进行标记和分选后，三阴性乳腺癌细胞系（A）SUM159 和（B）MDA-MB-468 中 BCSC 与非 BCSC 的比例差异。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 克隆形成实验

  1. 将目标细胞（来自步骤 5.11 的分选细胞或来自步骤 3.5 或 4.5 的未分选细胞）重悬于完全培养基中。
  2. 标记三个流式管，分别用于接种 1 × 102、2 × 102 和 5 × 102 个细胞。每管加入 2 mL 完全培养基，并将相应数量的细胞（来自步骤 5.11 的分选细胞或来自步骤 3.5 或 4.5 的未分选细胞）转移至对应管中。通过上下吹打 5 次，充分混匀细胞悬液。
  3. 将细胞接种至 6 孔板中，并轻轻晃动培养板使细胞悬液均匀分布。
  4. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养，直至出现克隆（克隆定义为每簇 ≥50 个细胞）。每周小心更换培养基两次，避免干扰克隆形成。
  5. 吸除培养基，用 1 mL PBS 洗涤一次。每孔加入 0.5 mL 0.05% 结晶紫溶液，孵育 30 分钟。用 2 mL 水洗涤以去除多余的结晶紫染料。重复洗涤步骤，直至背景染色完全去除。
  6. 在显微镜下使用 4× 和 10× 放大倍数，计数并记录生成的克隆总数（代表性图像见图 3A）。
  7. 按下式计算克隆形成频率：频率（%）=（形成的克隆数 / 接种细胞数）× 100。例如，若从 1 × 102 个细胞中生成 25 个克隆，则克隆形成频率为：频率 = (25/100) × 100 = 25%。
  8. 可选方案：可用共培养成纤维细胞的替代方法替换步骤 6.1 至 6.4，成纤维细胞可通过分泌必要的生长和存活因子为乳腺癌干细胞（BCSCs）提供微环境支持。
  9. 用 I 型牛胶原蛋白（将 3 mg/mL 胶原蛋白按 1:30 稀释）预包被 60 mm 细胞培养皿。在 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟使胶原蛋白聚合。吸除未聚合的胶原蛋白，用 1× PBS 洗涤两次。每孔加入 1 mL PBS 覆盖胶原包被的培养皿，并在室温下静置备用。
  10. 标记三个流式管，分别用于接种 1 × 103、5 × 103 和 1 × 104 个细胞。每管加入 4 mL 克隆形成检测培养基，并将相应数量的细胞（来自步骤 5.11 的分选细胞或来自步骤 3.5 或 4.5 的未分选细胞）转移至对应管中。加入经辐照处理的小鼠 NIH3T3 成纤维细胞（每毫升培养基中加入 4 × 104 个细胞）。通过上下吹打 5 次，充分混匀细胞悬液。
  11. 吸除步骤 6.1 中胶原包被培养皿中的 PBS，并按照步骤 6.3 所述方法将细胞混合物接种至各细胞培养板中。
  12. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养，7–10 天内勿扰动，直至克隆形成，期间不更换培养基。按照步骤 6.6 和 6.7 所述方法计数并记录生成的克隆总数。

7. 乳腺球形成实验

  1. 将目标细胞（来自步骤 5.11 的分选细胞或来自步骤 3.5 或 4.5 的未分选细胞）重悬于完全型乳腺球培养基中，并以 5 × 102 个细胞/cm2 的接种密度接种至 96 孔超低吸附细胞培养板中。
    注意：不同细胞系应优化细胞接种密度。
  2. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 5–10 天。每周小心更换培养基两次，避免干扰乳腺球的形成。
  3. 培养结束后，使用显微镜计数每孔中形成的乳腺球数量；乳腺球定义为直径大于 100 μm 的乳腺癌细胞簇（代表性图像见图 3B）。
  4. 按以下公式计算乳腺球形成效率（MFE）：MFE (%) =（每孔乳腺球数量）/（每孔接种细胞数量）× 100（例如，若某孔中 1 × 102 个细胞生成了 5 个乳腺球，则 MFE = (5/100) × 100 = 5%）。
  5. 如需传代培养乳腺球，小心将含有乳腺球的培养基转移至新的 50 mL 圆锥管中，于 1000 × g 离心 5 分钟。小心弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 500 μL 胰蛋白酶中，室温孵育 5 分钟。
  6. 弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 完全型乳腺球培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并按照步骤 7.1 所述方法将细胞重新接种至超低吸附细胞培养板中。
    注意：除传代外，乳腺球来源的细胞还可进一步通过流式细胞术（FACS）分析以评估乳腺癌干细胞（BCSC）表型，和/或获取纯化的 BCSC 群体用于其他下游实验。
  7. 为确定细胞群体中所含乳腺球起始细胞的数量，可采用另一种方法——球体极限稀释分析（SLDA）。将细胞按从高到低的梯度稀释后接种至 96 孔超低吸附细胞培养板中，最高稀释度应使每孔平均少于一个细胞。
  8. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 10–14 天，期间保持静置，避免细胞聚集。
  9. 培养结束后，使用显微镜计数每孔中形成的乳腺球数量；乳腺球定义为直径大于 100 μm 的乳腺癌细胞簇。使用 Extreme Limiting Dilution Analysis（ELDA）在线软件（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）计算球体起始频率及其显著性。

8. 三维培养模型

  1. 根据实验目的，选择使用含或不含生长因子（减量）的基底膜提取物（BME）。若需评估单一生长因子对癌细胞的影响，请使用生长因子减量型 BME，这有助于最大限度减少 BME 中内源性生长因子带来的非特异性效应。
    注意：BME 在高于 10 °C 时会凝固。即使在解冻过程中，也应始终将 BME 置于冰上。
  2. 在 96 孔板中每孔小心加入 50 μL BME，避免产生气泡，并于 37 °C 下孵育 1 小时以促进聚合。孵育 10 分钟后，向每孔加入 100 μL PBS，防止凝胶层干燥。
  3. 将步骤 5.11 中分选的细胞或步骤 3.5 或 4.5 中未分选的细胞重悬，浓度为 5 × 103 至 5 × 104/200 μL，使用 3D 培养基进行悬浮。
  4. 待 BME 完全聚合后，吸除 PBS，每孔加入 200 µL 细胞悬液，并在 37 °C、5% CO2 条件下的培养箱中孵育。在周围孔中加入 PBS，以防止培养基蒸发。
    注意：接种细胞的最佳数量应在实验前预先确定。根据实验目的，乳腺癌干细胞（BCSCs）可单独培养，也可与其他类型细胞（如成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞等）共培养。
  5. 每周两次向培养板中添加新鲜培养基。在分析类器官形成之前，维持培养 10–14 天（代表性图像见 图 3C）。
  6. 进行传代培养时，小心吸除培养基，向每孔含细胞的孔中加入 200 μL 分散酶（dispase），并将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。在孵育中途（30 分钟时），取出培养板，轻轻吹打分散酶溶液上下混合 5 次，然后放回培养箱继续孵育 30 分钟。
  7. 孵育 1 小时后，将解离的细胞溶液转移至流式管中。用含 2% FBS 的 1× PBS（fPBS）清洗孔板，并将洗液转移至同一流式管中。在 1000 × g 条件下离心 5 分钟。小心吸除上清液，加入 500 μL 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 5 分钟。加入等体积的 fPBS 以终止胰蛋白酶反应，并在 1000 × g 条件下再次离心 5 分钟。
  8. 弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 mL 3D 培养基中。计数细胞后，按照步骤 8.2 至 8.4 的方法，将所需数量的细胞重新接种至 BME 中。
    注意：可合并多个孔的细胞，用于进一步分析或分选目标细胞群体。

集落形成实验、细胞培养图像、不同接种密度、显微分析。
图 3：体外 实验评估 BCSC 细胞功能。体外 实验按照方案第 6.1 至 6.5 节（A）、7.1 至 7.4 节（B）或 8.1 至 8.4 节加 8.6 节（C）所述进行。（A）代表性图像显示由 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞形成的集落；（B）代表性图像显示 MCF7、SUM159 或 MDA-MB-468 人源细胞系以及患者来源的 LRCP17 乳腺癌细胞形成的乳腺球。（C）代表性图像显示 MCF7 和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞在三维培养模型中形成的三维结构。请点击此处查看该图的放大版本。

注意：动物实验须在机构动物护理委员会批准的动物伦理协议下进行。

9. 在体 异种移植模型

  1. 为了确定乳腺癌干细胞的成瘤起始能力，采用有限稀释法准备细胞（来自步骤5.7的分选细胞群，或来自步骤3.5或4.5的未分选细胞群）。用PBS对细胞进行连续梯度稀释，设置1至5个不同的稀释组，稀释浓度低至0.01–0.2 × 102 细胞100 µL 高达 1 x 106 细胞100 µL.
    注意：未分选/全群细胞可作为对照。稀释组数应根据预期的科学目标而定（例如，若仅检测致瘤性，可使用一组较高细胞数量的接种；而在计算肿瘤启动能力时，最佳方案是测试5个梯度的极限稀释剂量）。
  2. 为建立人乳腺癌细胞的异种移植模型，使用免疫缺陷型雌性小鼠（无胸腺裸鼠 [nu/nu]，非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）或 NOD/SCID IL2γ（NGS）品系）。
    注意：尽管每组最少可使用4只动物，但建议每组使用8-12只动物，以获得更可靠的结果，尤其是进行有限稀释分析时。
  3. 使用标准乳腺脂肪垫（MFP）注射方法 100 µL/mous在生物安全柜内的无菌条件下，取每种细胞制备物一份。
    注意：为获得最佳的乳腺肿瘤生长效果及向远端器官的自发性转移，建议采用胸部乳腺脂肪垫（thoracic MFP）；也可选用腹股沟乳腺脂肪垫（inguinal MFP）。
  4. 注射后，每天监测小鼠的一般健康状况及注射部位的肿瘤生长情况。一旦触及可感知的肿瘤，即开始使用游标卡尺测量肿瘤在两个垂直方向上的尺寸，并每周记录一次，直至实验终点。
    注意：实验终点根据机构动物伦理协议中规定的要求确定；通常，当肿瘤体积达到1500 mm³时，需实施安乐死作为实验终点。3. 对于BCSC群体和/或较高细胞剂量（例如 >1 × 10⁴ 个细胞），该终点通常在乳腺脂肪垫注射后4至8周内达到。对于极低细胞剂量和/或非乳腺干细胞样细胞群体，应允许肿瘤生长持续至注射后最长8个月。
  5. 根据这些测量值，使用以下公式计算肿瘤体积：体积（mm³）3 = 0.52 ×（宽度）2 x 长度。若采用有限稀释法，请使用 ELDA 在线软件（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）计算肿瘤启动能力及显著性。
  6. 或者，为更人道地延长实验终点，可通过手术切除原发肿瘤，并继续监测小鼠健康状况和/或远端器官中自发性转移的发生。利用切除的肿瘤组织进行连续异种移植传代。
  7. 在实验终点，采集原发肿瘤及远端器官（淋巴结、肺、肝、脑、骨）的组织，进行组织病理学和/或免疫组织化学分析；或对肿瘤组织进行解离，用于第6–8节所述的体外实验。

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结果

本方案可用于从异质性的乳腺癌细胞群体（包括细胞系或解离的肿瘤组织）中分离人乳腺癌干细胞（BCSCs）。对于任一特定的细胞系或组织样本，生成均一的单细胞悬液至关重要，以最大限度地提高BCSC的纯度，因为非BCSC群体的污染可能导致细胞反应的变异性，尤其是在研究目的是评估靶向BCSC治疗剂疗效的情况下。采用严格的分选策略可最大限度减少非BCSC的污染，从而能够富集具有干细胞样特征的乳腺癌细胞亚群，这些细胞在表型上可区别于肿瘤细胞主体群体。具有增强的ALDH酶活性、高表达细胞表面标志物CD44以及低表达或不表达CD24的人乳腺癌细胞，表现为ALDHhighCD44+CD24-表型，可被归类为BCSCs。BCSC在肿瘤细胞主体群体中的比例因细胞系或患者而异（图2），通常取决于疾病阶段，侵袭性更强的乳腺癌通常含有更高比例的BCSCs26,36,37<...

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讨论

乳腺癌转移及治疗耐药已成为全球女性死亡的主要原因。乳腺癌干细胞（BCSCs）亚群的存在导致转移能力增强26,43,44,45,46以及治疗耐药性21,47,48。因此，未来治疗的重点应是根除BCSCs以改善治疗效果，而这需要借助体外（in vitro）和体内（in vivo）方法，准确分离并表征BCSCs的功能特性。

源自不同乳腺癌亚型的永生化细胞系已被证明是研究乳腺癌生物学（包括乳腺癌干细胞（BCSCs）的分离与鉴定）的可行模型

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢我们实验室的成员提供的有益讨论和支持。我们关于乳腺癌干细胞和肿瘤微环境的研究由加拿大癌症研究学会研究所和美国国防部乳腺癌项目（资助号 # BC160912）的资助支持。V.B. 获得西安大略大学西部博士后奖学金的支持，A.L.A. 和 V.B. 均获得加拿大乳腺癌协会的支持。C.L. 获得加拿大政府提供的加拿大范尔研究生奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7-氨基放线菌素 D (7AAD)BD51-68981E建议用量：0.25 µg/1x106 个细胞
丙酮FisherA18-1
醛脱氢酶 (ALDH) 底物Stemcell Technologies1700作为 ALDEFLOUR 检测试剂盒的组成部分商业出售；请按照制造商说明配制 ALDH 底物
基底膜提取物 (BME)Corning354234商品名为 Matrigel 出售
细胞培养板：6 孔Corning877218
细胞培养板：60 mmCorning353002
细胞培养板：96 孔超低吸附Corning3474
细胞滤器：40 微米BD352340
胶原蛋白Stemcell Technologies7001将 3 mg/mL 的胶原蛋白用 PBS 稀释至 1:30
胶原酶Sigma110888070011x
锥形管：50 mLFisher scientific05-539-7
结晶紫SigmaC6158使用水中 0.05% 的结晶紫溶液进行染色
中性蛋白酶Stemcell Technologies79135U/mL
DMEM:F12Gibco11330-0321x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES
脱氧核糖核酸酶 (DNAse)SigmaD5052终浓度为 0.1 mg/mL
FBSAvantor Seradigm Lifescience97068-085 
流式管：5 mLBD352063聚丙烯圆底管
甲醇Fisher84124
小鼠抗人 CD24 抗体BD561646R-藻红蛋白与花青染料偶联，克隆号：ML5
小鼠抗人 CD44 抗体BD555479R-藻红蛋白偶联，克隆号：G44-26
N,N-二乙基氨基苯甲醛 (DEAB)Stemcell Technologies1700作为 ALDEFLOUR 检测试剂盒的组成部分商业出售；请按照制造商说明配制 DEAB
PBSWisent Inc311-425-CL1x，不含钙和镁
胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056
乳腺球培养基组成
B27Gibco17504-441x
bFGFSigmaF200610 ng/mL
BSABioshopALB0030.4%
DMEM:F12Gibco11330-0321x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES
EGFSigmaE964420 ng/mL
胰岛素Sigma166345 µg/mL
三维类器官培养基组成
A8301Tocris2939500 nM
B27Gibco17504-441x
DMEM:F12Gibco11330-0321x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES
EGFSigmaE96445 ng/mL
FGF10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMaxInvitrogen35050-0611x
HEPESGibco15630-08010 mM
N-乙酰半胱氨酸SigmaA91651.25 mM
神经调节蛋白 β1Peprotech100-035 nM
烟酰胺SigmaN06365 mM
NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
R-spondin3R&D3500250 ng/mL
SB202190SigmaS7067500 nM
Y-27632Tocris12545 µM

参考文献

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