从细胞和组织样本中分离与功能评估人乳腺癌干细胞

摘要

本实验方案描述了从乳腺癌细胞和组织样本中分离乳腺癌干细胞（BCSCs）的方法以及相关步骤 体外 和 体内 可用于评估乳腺癌干细胞表型和功能的检测方法。

摘要

乳腺癌干细胞（BCSCs）是一类具有遗传性或获得性干细胞样特性的癌细胞。尽管其数量稀少，但它们在乳腺癌的发生、复发、转移以及治疗耐药中起着关键作用。为了发现治疗乳腺癌的新靶点，深入理解乳腺癌干细胞的生物学特性至关重要。乳腺癌干细胞通常根据其特异性细胞表面标志物（如CD44、CD24）以及醛脱氢酶（ALDH）的酶活性来进行分离与鉴定。这些ALDH^高CD44⁺CD24^- 细胞构成了BCSC群体，可通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分离，用于后续功能研究。根据具体的科学问题，可采用不同的 体外 和 体内 可用于评估乳腺癌干细胞（BCSCs）的功能特性。本文提供了从乳腺癌细胞的异质性群体以及乳腺癌患者原发肿瘤组织中分离人源BCSCs的详细实验方案。此外，我们还强调了后续分析 体外 和 体内 包括集落形成实验、乳腺球形成实验、三维培养模型和肿瘤异种移植实验在内的功能检测方法，可用于评估乳腺癌干细胞功能。

引言

了解人类乳腺癌干细胞（BCSCs）的细胞与分子机制，对于应对乳腺癌治疗中所面临的挑战至关重要。BCSC 概念的提出可追溯至21世纪初。^st 世纪，其中一小群CD44⁺CD24^-/low 乳腺癌细胞被发现能够在小鼠体内形成异质性肿瘤^1,2随后观察到，醛脱氢酶（ALDH）酶活性较高的人类乳腺癌细胞^高也表现出类似的干细胞样特性³这些乳腺癌干细胞（BCSCs）代表了一小群具有自我更新和分化能力的细胞，有助于形成肿瘤组织的异质性。^1,2,3越来越多的证据表明，进化上保守的信号通路的改变是驱动乳腺癌干细胞存活与维持的关键因素^4,5,6,7,8,

方案

在获得知情同意的乳腺癌患者中，按照经机构伦理委员会批准的人类伦理方案，直接采集患者来源的手术或活检样本。用于建立患者来源的异种移植模型的所有小鼠均饲养在经机构认证的动物实验设施中。使用小鼠建立的患者来源异种移植模型的肿瘤组织，均依照机构动物护理委员会批准的伦理方案进行操作。

1. 细胞系的制备

1. 在生物安全柜内以无菌条件进行所有细胞培养和染色操作。使用无菌的细胞培养皿/培养瓶及试剂。
2. 将人乳腺癌细胞在37 °C、5% CO₂条件下，置于添加了胎牛血清（FBS）及各细胞系所需特定生长因子的特定培养基中进行培养。
3. 将小鼠NIH3T3成纤维细胞（用于克隆形成实验）在37 °C、5% CO₂条件下，置于添加了10% FBS的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中进行培养。
4. 对于所有细胞培养物，每2-3天更换一次新鲜培养基。当细胞融合度达到75-80%时，将细胞传代至多个无菌细胞培养瓶中。

2. 乳腺癌肿瘤组织的制备

1. 根据机构伦理委员会批准的人类伦理方案，从知情同意的乳腺癌患者处直接收集手术或活检样本。
2. 随后，在机构动物护理委员会批准的动物伦理方案下，使用小鼠收集并获取来自患者来源异种移植模型的肿瘤组织。
3. 在无菌条件下将所有肿瘤组织收....

结果

本方案可用于从异质性的乳腺癌细胞群体（包括细胞系或解离的肿瘤组织）中分离人乳腺癌干细胞（BCSCs）。对于任一特定的细胞系或组织样本，生成均一的单细胞悬液至关重要，以最大限度地提高BCSC的纯度，因为非BCSC群体的污染可能导致细胞反应的变异性，尤其是在研究目的是评估靶向BCSC治疗剂疗效的情况下。采用严格的分选策略可最大限度减少非BCSC的污染，从而能够富集具有干细胞样特征的乳腺癌细胞亚群，这些细胞在表型上可区别于肿瘤细胞主体群体。具有增强的ALDH酶活性、高表达细胞表面标志物CD44以及低表达或不表达CD24的人乳腺癌细胞，表现为ALDH^highCD44⁺CD24^-表型，可被归类为BCSCs。BCSC在肿瘤细胞主体群体中的比例因细胞系或患者而异（图2），通常取决于疾病阶段，侵袭性更强的乳腺癌通常含有更高比例的BCSCs^{26,36,37<.......}

讨论

乳腺癌转移及治疗耐药已成为全球女性死亡的主要原因。乳腺癌干细胞（BCSCs）亚群的存在导致转移能力增强^{26,43,44,45,46}以及治疗耐药性^21,47,48。因此，未来治疗的重点应是根除BCSCs以改善治疗效果，而这需要借助体外（in vitro）和体内（in vivo）方法，准确分离并表征BCSCs的功能特性。

源自不同乳腺癌亚型的永生化细胞系已被证明是研究乳腺癌生物学（包括乳腺癌干细胞（BCSCs）的分离与鉴定）的可行模型

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-氨基放线菌素 D (7AAD)	BD	51-68981E	建议用量：0.25 µg/1x106 个细胞
丙酮	Fisher	A18-1
醛脱氢酶 (ALDH) 底物	Stemcell Technologies	1700	作为 ALDEFLOUR 检测试剂盒的组成部分商业出售；请按照制造商说明配制 ALDH 底物
基底膜提取物 (BME)	Corning	354234	商品名为 Matrigel 出售
细胞培养板：6 孔	Corning	877218
细胞培养板：60 mm	Corning	353002
细胞培养板：96 孔超低吸附	Corning	3474
细胞滤器：40 微米	BD	352340
胶原蛋白	Stemcell Technologies	7001	将 3 mg/mL 的胶原蛋白用 PBS 稀释至 1:30
胶原酶	Sigma	11088807001	1x
锥形管：50 mL	Fisher scientific	05-539-7
结晶紫	Sigma	C6158	使用水中 0.05% 的结晶紫溶液进行染色
中性蛋白酶	Stemcell Technologies	7913	5U/mL
DMEM:F12	Gibco	11330-032	1x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES
脱氧核糖核酸酶 (DNAse)	Sigma	D5052	终浓度为 0.1 mg/mL
FBS	Avantor Seradigm Lifescience	97068-085
流式管：5 mL	BD	352063	聚丙烯圆底管
甲醇	Fisher	84124
小鼠抗人 CD24 抗体	BD	561646	R-藻红蛋白与花青染料偶联，克隆号：ML5
小鼠抗人 CD44 抗体	BD	555479	R-藻红蛋白偶联，克隆号：G44-26
N,N-二乙基氨基苯甲醛 (DEAB)	Stemcell Technologies	1700	作为 ALDEFLOUR 检测试剂盒的组成部分商业出售；请按照制造商说明配制 DEAB
PBS	Wisent Inc	311-425-CL	1x，不含钙和镁
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
乳腺球培养基组成
B27	Gibco	17504-44	1x
bFGF	Sigma	F2006	10 ng/mL
BSA	Bioshop	ALB003	0.4%
DMEM:F12	Gibco	11330-032	1x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES
EGF	Sigma	E9644	20 ng/mL
胰岛素	Sigma	16634	5 µg/mL
三维类器官培养基组成
A8301	Tocris	2939	500 nM
B27	Gibco	17504-44	1x
DMEM:F12	Gibco	11330-032	1x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES
EGF	Sigma	E9644	5 ng/mL
FGF10	Peprotech	100-26	20 ng/mL
FGF7	Peprotech	100-19	5 ng/mL
GlutaMax	Invitrogen	35050-061	1x
HEPES	Gibco	15630-080	10 mM
N-乙酰半胱氨酸	Sigma	A9165	1.25 mM
神经调节蛋白 β1	Peprotech	100-03	5 nM
烟酰胺	Sigma	N0636	5 mM
Noggin	Peprotech	120-10C	100 ng/mL
R-spondin3	R&D	3500	250 ng/mL
SB202190	Sigma	S7067	500 nM
Y-27632	Tocris	1254	5 µM