用于研究结肠癌干细胞的三维类球体模型

摘要

本方案介绍了一种新颖、稳定且可重复的培养体系，用于从Caco2结肠腺癌细胞生成并培养三维球状体。研究结果首次证明了该方法适用于癌症干细胞生物学研究，包括对化疗反应的研究。

摘要

结直肠癌具有异质性和层次性结构，其中包含一群负责肿瘤发生、维持以及耐药性的肿瘤干细胞（CSCs）。因此，深入了解CSC的特性并实现其特异性靶向，是实现有效治疗的前提。然而，目前适用于深入研究的合适临床前模型较为缺乏。尽管体外二维（2D）癌细胞系为肿瘤生物学提供了有价值的见解，但其无法模拟肿瘤在表型和遗传上的异质性。相比之下，三维（3D）模型能够更好地反映接近生理状态的肿瘤复杂性和细胞异质性。本研究旨在建立一种稳定且可重复的3D培养体系，用于研究CSC的生物学特性。本文所述方法介绍了从Caco2结肠腺癌细胞系建立和优化生成3D类球体的条件，该模型适用于长期培养。重要的是，在这些类球体中，细胞围绕类似腔样的结构排列，表现出不同的增殖模式，并含有表达多种标志物的CSCs。这些结果首次提供了概念验证，表明该3D方法适用于研究细胞异质性及CSC生物学特性，包括对化疗的反应。

引言

结直肠癌（CRC）仍然是全球癌症相关死亡的第二大原因¹。CRC的发生是由于遗传突变和/或表观遗传改变逐步获得并累积的结果^2,3，包括癌基因的激活以及肿瘤抑制基因的失活^3,4。此外，非遗传因素（例如微环境）也可促进癌变过程，从而参与CRC的演化⁵。重要的是，CRC由不同的细胞群体组成，包括未分化的CSCs和表现出一定分化特征的大量肿瘤细胞，这些细胞构成了一种层级结构，类似于正常结肠隐窝上皮的组织结构^6,7。

肿瘤干细胞（CSCs）被认为与肿瘤的发生⁸、维持与生长、转移能力以及对常规治疗的耐药性密切相关^6,7。在肿瘤内部，包括CSCs在内的癌细胞在突变特征和表观遗传谱、形态学与表型差异、基因表达、代谢、增殖速率以及转移潜能等方面表现出高度的异质性和复杂性

方案

注意：所有试剂和材料的详细信息均列在材料表中。

1. 类球体形成

1. 类球体培养基
   1. 制备基础培养基，包含添加了4 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
   2. 在步骤1.1.1的基础培养基中加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep），制备DMEM完全培养基。
   3. 在步骤1.1.1的基础培养基中加入2.5%基底膜基质、10% FBS和1% Pen/Strep，制备DMEM/基底膜基质培养基。
2. 类球体形成用培养板的准备
   1. 将基础培养基和DMEM/基底膜基质培养基在室温（RT）下预热约20分钟。
   2. 向专用于类球体形成的24孔板的每个孔中加入500 µL抗黏附冲洗液，进行预处理。
      注：这些板的每个孔包含1,200个微孔。
   3. 使用带板适配器的摆动转子，在1,200 × g 条件下离心5分钟。
      注：若仅使用一块板，需另准备一块装满水的标准板以平衡重量。
   4. 用2 mL预热的基础培养基冲洗每个孔，并吸除孔中的培养基。
   5. 在显微镜下观察培养板，确保微孔中的气泡已完全去除。若仍有气泡滞留，再次以1,200 × g 离心....

结果

由于现有3D球状体培养系统的主要缺点之一是球状体大小缺乏均一性¹³，本研究旨在建立一种可靠且可重复的方案以获得均一的球状体。首先，为了确定理想的工作条件，测试了不同数量的Caco2细胞，每微孔/球状体接种细胞数从50至2,000个不等，使用专用培养板（表1）。实际上，这些板中的每个孔包含1,200个微孔，可使每个孔内形成相同数量的球状体，更重要的是，每个微孔中仅形成一个球状体²¹。培养两天后，每球状体接种2,000个细胞的孔中细胞呈单层生长，而每球状体50个细胞则形成较小且不均一的球状体（图1A）。因此，这两种条件被排除在后续分析之外。为了建立长期培养体系，将球状体从微孔中收获，并在新制备的琼脂糖包被板中以非黏附条件重新接种。随后在整个实验过程中通过测量体积变化来监测球状体的生长情况。为考虑其非球形形态，对每个球状体测量三个不同方向的直径，并应用体积计算公式

讨论

体外三维模型克服了二维肿瘤细胞培养的主要实验缺陷，因其在重现肿瘤典型特征（包括微环境和细胞异质性）方面表现出更高的可靠性。常用的类球体三维模型包括无支架模型（在低黏附条件下培养）和基于支架的模型（利用生物材料培养细胞）。这些方法各自存在不同缺点，例如依赖所用支架的性质，或产生的类球体在结构和大小上具有变异性。

本实验方案报告了利用无支架方法从结肠腺癌细胞系 Caco2 制备均一球状体的优化条件。这些球状体易于收获，并且与先前报道的一项研究⁴¹不同，它们能够成功生长，并可分析其在培养期间的生长特性。此外，采用这一新方法获得的球状体（a）具有活跃的增殖能力，（b）细胞死亡率极低，（c）可自组织形成球体内部的腔结构，以及（d）表现出组成细胞的分化潜能。鉴于该新方法的最终目标是用于肿瘤干细胞（CSC）生物学研究，因此分析了多种肿瘤干细胞标志物的表达。有趣的是，这些标志物的表达呈现动态变化模式，依赖于培养时间点，并定义了不同的肿瘤干细胞亚群。

尤为重要的是，通过本方案生成的类球体可用于分析.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37 µm 可逆滤网，大型	STEMCELL Technologies	27250	需与 50 mL 圆锥形离心管配合使用
5-氟尿嘧啶	由里昂贝拉德中心（CLB）药房赠送	-	储备液浓度为 5 mg/100 mL；终浓度为 50 µg/mL
琼脂糖	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24 孔板	STEMCELL Technologies	34411	每孔含 1,200 个微孔，用于类球体的形成与生长
抗 Caspase3 - 兔源抗体	Cell Signaling	9661	稀释比例 1:200
抗 Musashi-1 (14H1) - 大鼠源抗体	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	稀释比例 1:500
防粘附冲洗液，100 mL	STEMCELL Technologies	07010
抗 CD133 (13A4) - 大鼠源抗体	Invitrogen	14-133-82	稀释比例 1:100
抗 CD44 - 兔源抗体	Abcam	ab157107	稀释比例 1:2000
抗 PCNA - 小鼠源抗体	Dako	M0879	稀释比例 1:1000
抗-β-catenin - 小鼠源抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	稀释比例 1:50
黑色多孔板	Thermo Fisher Scientific	237108
一水柠檬酸	Sigma	C1909
CLARIOstar 仪器	BMG Labtech		微孔板读数仪
Dako 笔			用于在载玻片上标记圆形区域，以形成液体屏障的记号笔
驴抗小鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 488 标记	Thermo Fisher Scientific	A21202	稀释比例 1:1000
驴抗小鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 568 标记	Thermo Fisher Scientific	A10037	稀释比例 1:1000
驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记	Thermo Fisher Scientific	A21206	稀释比例 1:1000
驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568 标记	Thermo Fisher Scientific	A10042	稀释比例 1:1000
含 Glutamax（L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	10569010
胎牛血清（FBS）	Gibco	16000044
含 DAPI 的 Fluorogel 封片介质	Interchim	FP-DT094B
驴抗大鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568 标记	Thermo Fisher Scientific	A11077	稀释比例 1:1000
ImageJ 软件			类球体图像分析
伊立替康	由 CLB 药房赠送	-	储备液浓度为 20 mg/mL；终浓度为 100 µg/mL
iScript 逆转录酶	Bio-Rad	1708891
亚叶酸钙	由 CLB 药房赠送	-	储备液浓度为 50 mg/mL；终浓度为 25 µg/mL
Matrigel 基底膜基质	Corning	354234	基底膜基质
Nucleospin RNA XS 试剂盒	Macherey-Nagel	740902 .250
奥沙利铂	由 CLB 药房赠送	-	储备液浓度为 100 mg/20 mL；终浓度为 10 µg/mL
青霉素-链霉素	Gibco	15140130
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）	Takara	RR420B
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	核酸染料；稀释比例 1:5000
胰蛋白酶-EDTA（0.05 %）	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert 显微镜			倒置显微镜，用于获取类球体图像