通过质量光度法快速测定抗体-抗原亲和力

摘要

我们介绍一种利用质量光度法（MP）进行抗原-抗体亲和力测量的单分子方法。基于MP的实验方案快速、准确，仅需极少量样品，且无需对蛋白质进行修饰。

摘要

抗原-抗体相互作用的特异性和亲和力测定在医学和科研应用中至关重要。本方案中，我们介绍了一种用于此目的的新型单分子技术——质量光度法（mass photometry, MP）的实施方法。MP 是一种无需标记和固定的技术，可在单分子水平上检测并量化抗体及抗原-抗体复合物的分子质量与种群分布。MP 可在数分钟内完成对抗原-抗体样品的分析，从而精确测定结合亲和力，同时提供有关蛋白质化学计量比和寡聚状态的信息。该技术操作简便，仅需皮摩尔量级的蛋白质，且无需昂贵的耗材。相同的方法也可用于研究分子质量大于 50 kDa 的蛋白质之间的蛋白-蛋白结合。对于多价蛋白相互作用，可在一次测量中获得多个结合位点的亲和力。然而，单分子检测模式以及无标记特性也带来一定的实验限制。该方法在测定亚微摩尔级相互作用亲和力、分子质量为 20 kDa 或更大的抗原，以及相对纯净的蛋白样品时效果最佳。我们还介绍了如何使用基础的数据分析软件完成必要的拟合与计算步骤。

引言

抗体已成为分子生物学中普遍使用的工具，广泛应用于医学和科研领域。在医学上，抗体在诊断中具有至关重要的作用，同时其治疗应用也在不断拓展，基于抗体的新疗法正在持续开发中^1,2,3,4。抗体的科研应用包括多种不可或缺的实验技术，如免疫荧光⁵、免疫沉淀⁶、流式细胞术⁷、ELISA 和蛋白质印迹（western blotting）。对于这些应用而言，准确测定抗体的结合特性（包括结合亲和力和特异性）至关重要。

自1990年首台商用表面等离子体共振（SPR）仪器问世以来，光学生物传感器已成为抗体表征的“金标准”，但其他技术（包括ELISA）也常用于测量抗体亲和力^8,9。这些方法通常需要对被分析分子进行固定或标记，这可能会影响目标相互作用。此外，它们速度相对较慢，在获得可用于数据分析的结果之前需经历多个检测步骤。一种近期开发的单分子方法——质量光度法（MP），可在分子落在显微镜盖玻....

方案

1. 准备流式室

1. 清洗玻璃盖玻片
   1. 使用装有蒸馏水、乙醇和异丙醇的洗瓶，按以下顺序冲洗 24 mm × 50 mm 的盖玻片：水、乙醇、水、异丙醇、水。用洁净的氮气流吹干盖玻片。冲洗时应自上而下进行，用尖端柔软的镊子夹住盖玻片底部边缘。干燥时也应沿相同方向吹气，以避免镊子污染盖玻片（图 2A）。
   2. 同样，用蒸馏水、乙醇和蒸馏水依次冲洗 24 mm × 24 mm 的盖玻片，并用洁净的氮气流吹干。
   3. 确定盖玻片的工作面：在洁净盖玻片表面滴加一滴蒸馏水，然后按照方案中的步骤 3.1–3.2 进行操作。通常只有 24 mm × 50 mm 盖玻片的一面具有适合多光子（MP）测量的光学质量。
      注意：聚焦后应无法检测到明显的表面缺陷，数据采集软件中显示的“信号”值应小于 0.05%（图 1A-C）。盒中所有盖玻片的工作面均朝向同一方向。应采用相同程序测试盖玻片清洗效果。
2. 组装流动池
   1. 将 24 mm × 24 mm 的盖玻片放置在一张铝箔上。如 图 2B 所示，在 24 mm × 24 mm 盖玻片上贴上双面胶条，并沿玻璃边缘裁剪胶带。将盖玻片从铝箔上取下，将其粘附....

结果

我们先前使用基于 MP 的检测方法研究了人α凝血酶（HT）与小鼠抗人凝血酶单克隆抗体（AHT）之间的相互作用¹¹。由于 HT 的分子质量（37 kDa）低于 40 kDa 的检测限，因此样品的最大浓度可以在不影响质量分布分辨率的前提下超过 50 nM 的 MP 浓度限制。本实验设计为滴定系列，其中 AHT 抗体浓度固定为 25 nM，HT 的浓度分别为 7.5 nM、15 nM、30 nM、60 nM 和 120 nM。图3展示了抗原-抗体混合物以及仅含抗体样品的分子质量分布。本文采用本方案中描述的方法对数据进行分析。使用科学绘图软件将质量分布拟合为三个高斯组分，分别代表游离的 AHT、AHT·HT 和 AHT·HT₂。三个组分的已知分子质量值被固定，并对三种物种使用单一的峰宽参数进行拟合。通过公式 3 对高斯组分的最佳拟合峰高参数进行归一化处理，以获得各物种的浓度分数（表1）。这些数值连同每个样品中抗体和抗原的总浓度被输入至“Kd calculation.xlsx”文件中。.......

讨论

本文所述的基于质量光度法（Mass Photometry）的实验方案提供了一种快速且准确测定抗原-抗体结合亲和力的方法。质量光度分析仅需极少量样品，且可从同一组数据中获取其他信息，包括化学计量比、寡聚状态和样品纯度（图5）。在无需修改的情况下，该方法适用于解离常数在约5 nM至500 nM范围内、且配体分子质量约为20 kDa或更大的结合反应测定。相同的实验流程不仅可用于分析抗原-抗体结合，还可用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力，前提是至少一个结合组分的分子质量大于50 kDa。由于质量光度检测无特异性，因此不能在含有高浓度载体蛋白或大分子杂质的样品中进行MP测量。

表面等离子体共振（SPR）常用于抗原-抗体结合的表征，直接比较这两种方法有助于实验方案的选择。与SPR相比，磁珠（MP）结合实验速度更快，且无需进行蛋白质固定化。在典型的结合实验中，MP所需的样品量少于SPR。MP数据可揭示复合物的化学计量关系，而该信息难以直接从SPR^10,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AcquireMP	Refeyn		MP 数据采集软件
抗人凝血酶抗体	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
棉签	Thorlabs	CTA10	用于镜头清洁的棉质光学棉签
盖玻片 24×24 mm	Globe Scientific	1405-10
盖玻片 24×50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP 数据处理软件
镊子	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	软头镊子，用于操作盖玻片
人α-凝血酶	Haematologic Technologies	HCT-0020
浸油	Thorlabs	MOIL-30
异丙醇	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		电子表格软件
OneMP	Refeyn		质谱光度计仪器
Origin	OriginLab		科学绘图软件
PBS	Corning	46-013-CM	10 倍浓缩液
注射器滤器	Millipore	SLGSR33SS	用于缓冲液和样品过滤